В vitro Создание генетически инженерии Murine головы и шеи рак овой линии с использованием Адено-ассоциированных Вирус-Cas9 системы
Summary
Разработка моделям мурин с специфическими генами, мутировавшими у больных раком головы и шеи, необходима для понимания неоплазии. Здесь мы представляем протокол для преобразования в пробирке первичных клеток языка мурина с помощью адено-ассоциированной системы вирус-Cas9 для генерации линий клеток murine HNC с конкретными геномными изменениями.
Abstract
Использование первичных нормальных эпителиальных клеток позволяет воспроизводимо вызывать геномные изменения, необходимые для клеточной трансформации, вводя специфические мутации в онкогены и гены супрессоров опухолей, используя кластерные регуляторные межпространственные краткое палиндромическое повторение (CRISPR) на основе технологии редактирования генома у мышей. Эта технология позволяет нам точно имитировать генетические изменения, которые происходят в раковых заболеваний человека с использованием мышей. Путем гениально преобразовывая первичные клетки murine, мы можем более лучше изучить развитие рака, прогрессирование, обработка, и диагноз. В этом исследовании мы использовали Cre-индуцированных Cas9 мышь язык эпителиальных клеток для редактирования генома с помощью адено-ассоциированного вируса (AAV) в пробирке. В частности, путем изменения KRAS, p53, и APC в нормальных эпителиальных клеток языка, мы создали морин головы и шеи рака (HNC) клеточной линии в пробирке, которая опухолевых в сингенных мышей. Представленный здесь метод подробно описывает, как генерировать линии клеток HNC с конкретными геномными изменениями и объясняет их пригодность для прогнозирования прогрессирования опухоли у сингенных мышей. Мы предусматриваем, что этот перспективный метод будет информативным и полезным для изучения биологии опухоли и терапии HNC.
Introduction
HNC является распространенной злокачественной во всем мире1. Моделирование генезиса HNC неоплазии в настоящее время на научном поворотный момент2. Хотя многие генетические мутации были выявлены в HNC2,3,4 (например, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 и RAS) конкретные комбинации геномных изменений, необходимых в согласии, чтобы побудить HNC остаются неясными.
Текущее использование человеческих линий клеток HNC значительно помогло выяснить механизмы, связанные с патогенезом илечением 3. Тем не менее, изучение человеческих клеточных линий в иммунокомпромиссных систем мурин имеет свои ограничения, потому что эти системы не касаются неопластического процесса in vivo, роли специфических генных мутаций и реакций на лечение в иммунной микросреде. Таким образом, развитие и создание линий моринных клеток с конкретными генетическими изменениями имеют первостепенное значение для изучения того, как различные гены способствуют процессу трансформации и для тестирования новых молекул на основе терапии в иммунокомпетентных мышей.
Исследования функции генов в биомедицинских исследованиях были значительно затронуты достижениями в технологиях редактирования ДНК, путем введения двухструнных перерывов (DSB), например5. Эти технологии, в том числе использование цинковых пальцев nucleases, транскрипции активатор-как эффектора nuclease, и кластерных нормативных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR/Cas9), позволяют манипулировать любым геном, представляющим интерес на его локуса. Последние системы CRISPR/Cas9 состоят из направляющей РНК (gRNA), которая направляет нуклеазу Cas9 для создания DSB на определенном участке в геноме. Эта система получила широкое признание в изменении эндогенных генов в любой клетке или целевой ткани, даже в самых традиционно трудно поддающихся лечению организмов5. Он имеет множество преимуществ по сравнению с другими системами из-за своей простоты, скорости и эффективности.
В онкологии технология CRISPR/CAS9 выполнила потребность эффективно имитировать раковые клетки. Чтобы установить эту систему в HNC, мы манипулировали мощным онкогеном KRAS и двумя важными генами супрессора опухоли, APC и p536. Согласно базе данных GENIE7, эта комбинация встречается редко в HNC. Мутации РАН (HRAS, NRAS и KRAS) присутствуют лишь в 7% всех популяций HNC. Эти опухоли, как правило, устойчивы к терапии8,9.
Доставка Cas9 и его gRNA достигается с помощью вирусной трансдукции с использованием либо AAVs или лентивирусов. Рекомбинантный AAV часто является предпочтительным методом доставки генов в клетки-мишени из-за его высокого титра, мягкий иммунный ответ, способность преобразовывать широкий спектр клеток, и общая безопасность. С помощью системы AAV были созданы различные тканевые линии клеток мыши, и новые клеточные линии все еще разрабатываются10,11,12. Тем не менее, эффективная система геномного редактирования, которая может генерировать моделя линии клеток murine HNC, еще предстоит разработать. В этом исследовании мы стремились разработать систему AAV-Cas9 на основе in vitro для преобразования первичных клеток языка мурин в опухолевое состояние. Этот уникальный протокол преобразования CRISPR/Cas9 и установленная линия опухолевых клеток могут быть использованы для лучшего понимания биологии HNC, вызванной разнообразием геномных изменений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько методов ранее были использованы для преобразования первичных клеток в культуре с переменной степенью успеха25,26,27,28. Большинство из этих методов используют клетки фибробласта мыши для преобразования<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Даниэля Гитлера за предоставленную нам плазмидную плазму pAd Delta 5. Эта работа была профинансирована Израильским научным фондом (ISF, 700/16) (для ME), Американско-Израильским днациональным научным фондом (BSF, 2017323) (для ME и MS), Израильской онкологической ассоциацией (ICA, 20170024) (ME), Израильским фондом исследований рака (ICRF, 17-1693-RCA #7895). Стипендия: стипендий Алон для меня и БГУ Kreitman стипендий SJ и MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
