Summary
O desenvolvimento de modelos de urina com genes específicos mutados em pacientes com câncer de cabeça e pescoço é necessário para a compreensão da neoplasia. Aqui, apresentamos um protocolo para a transformação in vitro das células primárias da língua murina usando um sistema de vírus-Cas9 associado ao adeno para gerar linhas celulares murine HNC com alterações genômicas específicas.
Abstract
O uso de células epiteliais normais primárias torna possível induzir reprodutivelmente alterações genômicas necessárias para a transformação celular através da introdução de mutações específicas em oncogenes e genes supressores tumorais, usando interespaçados regulamentares agrupados repetição palindrômica curta (CRISPR) baseado em tecnologia de edição do genoma em ratos. Esta tecnologia nos permite imitar com precisão as mudanças genéticas que ocorrem em cânceres humanos usando ratos. Ao transformar geneticamente as células primárias de urina, podemos estudar melhor o desenvolvimento do câncer, progressão, tratamento e diagnóstico. Neste estudo, usamos células epiteliais de língua de camundongo Cas9 indutoras para permitir a edição do genoma usando vírus associado ao adeno (AAV) in vitro. Especificamente, alterando KRAS, p53 e APC em células epiteliais normais da língua, geramos uma linha celular de câncer de murine na cabeça e no pescoço (HNC) in vitro, que é tumorigenic em camundongos singênticos. O método apresentado aqui descreve em detalhes como gerar linhas celulares HNC com alterações genômicas específicas e explica sua adequação para prever a progressão tumoral em camundongos singênicos. Nós imaginamos que este método prometedor será informativo e útil estudar a biologia e a terapia do tumor de HNC.
Introduction
HNC é uma malignidade comum em todo o mundo1. Modelar a gênese da neoplasia hnc está atualmente em um ponto de viragem científica2. Enquanto muitas mutações genéticas foram identificadas no HNC2,3,4 (por exemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 e RAS) as combinações específicas de alterações genômicas necessárias em conjunto para induzir o HNC permanecem obscuras.
O uso atual de linhas celulares humanas hnc tem ajudado significativamente a elucidar os mecanismos associados com patogênese e tratamento3. No entanto, o estudo das linhas celulares humanas em sistemas de urina imunocomprometida tem suas limitações, porque esses sistemas não abordam o processo neoplástico in vivo, o papel de mutações genéticas específicas e respostas de tratamento em um microambiente imunológico. Assim, o desenvolvimento e o estabelecimento de linhas celulares de urina com alterações genéticas específicas são de importância primária para estudar como diferentes genes contribuem para o processo de transformação e testar novas terapias baseadas em moléculas em camundongos imunocompetentes.
Estudos de função gênica em pesquisa biomédica têm sido significativamente afetados pelos avanços nas tecnologias de edição de DNA, introduzindo quebras de cadeia dupla (DSBs), porexemplo, 5. Essas tecnologias, incluindo o uso de nucleases de dedos de zinco, nucleases de efetores efetivos semelhantes a ativadores de transcrição e repetições palindrômicas curtas interespaçadas e agrupadas (CRISPR/Cas9), permitem a manipulação de qualquer gene de interesse em seu locus. Os mais recentes sistemas CRISPR/Cas9 são compostos por um RNA guia (gRNA) que direciona a nuclease Cas9 para gerar um DSB em um local específico do genoma. Este sistema ganhou amplo reconhecimento na modificação de genes endógenos em qualquer célula ou tecido alvo, mesmo nos organismos mais tradicionalmente difíceis de tratar5. Ele tem múltiplas vantagens sobre outros sistemas devido à sua simplicidade, velocidade e eficiência.
Em oncologia, a tecnologia CRISPR/CAS9 cumpriu a necessidade de imitar efetivamente as células cancerosas. Para estabelecer este sistema em HNC, manipulamos o potente oncogene KRAS e dois genes supressores tumorais importantes, APC e p536. De acordo com o banco de dadosgenie 7, esta combinação é rara no HNC. Mutações RAS (HRAS, NRAS e KRAS) estão presentes em apenas ~7% de todas as populações de HNC. Estes tumores tendem a ser resistentes à terapia8,9.
A entrega de Cas9 e seu gRNA é alcançada através da transdução viral usando AAVs ou lentivírus. O AAV recombinante é muitas vezes o método preferido para fornecer genes para células-alvo devido ao seu alto díter, resposta imune leve, capacidade de transduzir uma ampla gama de células e segurança geral. Usando um sistema AAV, várias linhas de células de camundongos específicas do tecido foram geradas, e novas linhas celulares ainda estão sendo desenvolvidas10,11,12. No entanto, um sistema de edição genômica eficiente que pode gerar células modelos de linha celular MNC murine continua a ser desenvolvida. Neste estudo, procuramos desenvolver um sistema in vitro baseado em AAV-Cas9 para transformar as células primárias da língua de urina em um estado tumorigenic. Este protocolo de transformação CRISPR/Cas9 único e a linha de células tumorais estabelecidas podem ser usados para entender melhor a biologia do HNC induzida por uma diversidade de alterações genômicas.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pela Universidade Ben Gurion do Negev Animal Care and Use Committee. Experimentos com animais foram aprovados pela IACUC (IL.80-12-2015 e IL.29-05-2018 (E)). Todos os aspectos dos testes em animais, habitação e condições ambientais utilizadas neste estudo foram em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório13.
1. Produção de vírus associada a Adeno
- Dia 1: Cultura celular
- Sementes 4 x 106 células HEK293T por placa de 14,5 cm em 15 mL de DMEM. Prepare 10 placas para transfecção com polietiletilimina (PEI) (1 μg/μL).
- Dia 2: Transfecção de células HEK293T usando PEI
- Retire a mídia e refeed com DMEM quente 1 h antes da transfecção.
- Reagentes de transfecção pré-enxame e DMEM.
- Use 10 μg do plasmídeo de interesse contendo AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 μg do AAV 2/9n capsid plasmid (com o gene de representação de AAV2 e o gene do tampão de AAV9, e 10 μg do plasmid do ajudante (ajudante do F5 do pAdDelta) por a placa (veja a tabela dos materiais).
NOTA: Uma nova geração de plasmid ajudante - pAdDeltaF614,15,16 que também pode ser usado para a produção de AAV está disponível. - Misture os plasmídeos em 1 mL de DMEM simples por placa. Em seguida, adicione 90 μL de polietilenomina (plasmídeo total: concentração PEI = 1:3) para a mistura plasmídeo e vórtice brevemente.
- Incubar a mistura de DNA PEI-plasmid por 20 min à temperatura ambiente (RT).
- Adicione a mistura dropwise em cima das células HEK293T e transfira as placas para a incubadora de cultura celular em 37 °C com 5% de CO2 para 24 h.
- Dia 3: Mudança média após transfecção
- Retire o meio completamente e adicione 15 mL de DMEM fresco.
- Dia 5: Colhendo o vírus
- Prepare um banho seco de gelo/etanol.
- Coletar as células com um raspador de células e transferi-los para tubos de 50 mL (2 placas por tubo de 50 mL).
- Tubos de spin a 800 x g por 15 min à temperatura ambiente.
- Descarte o supernatant de todos os tubos. Adicione 0,5 mL do buffer de lofe (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) por placa (ou seja, 5 mL para 10 placas) apenas para o primeiro tubo. Resuspenda as células e transfira o volume total para o próximo tubo e continue até o último tubo.
- Transfira a suspensão celular para um tubo fresco de 50 mL. Lave os tubos com o mesmo volume de dbuffer de lyse (0,5 mL por placa) usando o mesmo método de transferência descrito na etapa 1.4.4.
- Subme a suspensão celular a três rodadas de ciclos de congelamento/degelo de ~10 min entre um banho seco de gelo/etanol e um banho de água de 37 °C. Vórtice brevemente após cada descongelamento.
- Se a purificação for realizada no mesmo dia, defina o tampão de equilíbrio e elução (ver Tabela 1 para a receita) na RT.
- Adicione 50 unidades de benzonase por placa e incubar a 37 °C para 1,5 h.
NOTA: Benzonase é usado para digerir ácidos nucleic residuais das células produtoras hospedeiras e do DNA plasmídeo presente na suspensão celular. - Gire os tubos a 3.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Colete o supernatant em uma seringa usando uma agulha de aço 18 G e empurre a solução através de um filtro de 0,45 μm em um tubo de 15 mL para obter o lysate bruto.
- Guarde o lysate bruto em 4 °C por algumas semanas até a purificação ou continuar a purificação.
2. Purificação aAV
- Dia 5 ou depois
- Coloque o tampão de equilíbrio e elução na RT.
- Lave colunas de cromatografia com 10 mL do amortecedor de equilíbrio.
- Adicione 0,5 mL por placa de heparina-agarose à coluna17 e, em seguida, adicione o buffer de equilíbrio (4x o volume da heparina-agarose). Misture as soluções invertendo a coluna e deixe o sedimento agarose.
- Elute o amortecedor de equilíbrio da coluna pela gravidade.
NOTA: Deixe algum amortecedor de equilíbrio para evitar que a agarose seque. - Carregue o lysate cru sobre a coluna e incubar por 2 h a 4 °C com agitação constante. Traga a coluna em uma posição ereta e permita que a agarose aos sedimentos.
- Lute o liceu bruto pela gravidade.
- Lave a coluna com tampão de equilíbrio (4x o volume da heparina-agarose).
- Coloque um filtro de proteína centrífuga de 100 kDa abaixo da coluna e alute o vírus usando um buffer de elução (3x o volume da heparina-agarose) no filtro.
NOTA: O buffer de elução não deve exceder 15 mL. - Centrífuga o filtro em 3.000 x g para ~ 30 min até menos de 1 mL é deixado no filtro.
- Encha o filtro com PBS e centrífuga a 3.000 x g por ~ 30 min até menos de 1 mL é deixado no filtro. Repita este passo 2x para remover todos os sais.
- Concentre a solução do vírus no filtro por centrífuga a 3.000 x g para chegar a um volume tão pequeno quanto possível (menos de 200 μL).
- Aspeto a solução do vírus com uma agulha e seringa e empurre a solução através de um filtro de 0,22 μm em um tubo.
- Faça alíquotas de partículas virais concentradas para armazenamento.
NOTA: Os alíquotas devem ser ~20 μL para armazenamento a curto prazo em 4 °C e ~5 μL para armazenamento a longo prazo em -80 °C. - Determine o titer viral e a eficiência viral da transdução como descrito previamente14,18,19,20.
3. Isolamento e cultura das células primárias
- Dia 1
- Eutanásia um B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia de CO2 ou qualquer outro protocolo aprovado pela IACUC.
NOTA: Estes camundongos knockin CRISPR/Cas9 têm expressão dependente de crecombinase de endonuclease cas9 e EGFP dirigido por um promotor CAG. A sequência de Lox-Stopx (LSL) a montante, presente no genoma destes ratinhos, impede a expressão de Cas9 e EGFP na ausência de Cre recombinando. Quando usados em combinação com RNAs guia único (sgRNAs) e uma fonte Cre, eles permitem a edição de genes de camundongos individuais ou múltiplos in vivo ou ex vivo14. - Dissecar a língua dos ratos eutanasiados usando tesoura cirúrgica.
- Dissociar manualmente o tecido, cendendo o tecido da língua em fragmentos muito pequenos usando um bisturi. Colete os fragmentos de tecido em um tubo de 15 mL contendo 4,5 ml de rpmi médio simples (com soro fora).
- Adicione a mistura de enzimatrips (200 μl) (ver Tabela 1 para a receita) aos fragmentos de tecido.
- Incubar a mistura tissue-enzima em 37 °C para 30 min e toque o tubo a cada 10 min para melhorar a dissociação enzimática do tecido.
- Adicione 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo HBSS/PBS à mistura de enzimas de tecido para parar a ação enzimática.
- Filtre a suspensão celular acima através de uma malha de nylon estéril de 70 μm para separar as células dispersas e fragmentos de tecido maiores.
- Lave a suspensão celular filtrada por centrífuga por 300 x g por 5 min em HBSS/PBS na RT.
- Resuspenda a pelota no meio da cultura (10% FBS em RPMI/DMEM) e cresça em pratos da cultura de 60 milímetros até que as colônias distintas da pilha estejam dadas forma.
- Agregados de células culturais retidos em cima do filtro em um prato de cultura de 60 mm contendo 3 mL de mídia completa (10% FBS em RPMI/DMEM) até que as colônias celulares sejam formadas.
- Microscópico examinar as células primárias para a presença de contaminação por fibroblasto após 1 semana de cultura. Trate as células primárias desenvolvidas a partir de agregados e suspensões celulares com 0,25 solução EDTA de 0,02% a 37 °C por 1 min para remover fibroblastos.
NOTA: Normalmente, a cultura primária dos agregados celulares produz mais colônias em comparação com suspensões unicelulares. As células dessas colônias fornecem melhor eficiência de transdução com transdução a AAV.
- Eutanásia um B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia de CO2 ou qualquer outro protocolo aprovado pela IACUC.
4. Transdução de AAV de células primárias
- Dia 10
- Semente 2 x 105 células primárias por poço em 6 placas de poço em 2 mL de mídia completa (10% FBS em RPMI/DMEM).
- No dia seguinte, transduza as células com 1012 genoma/mL viral (1010 unidades transducantes/mL) e incubam as células em meios contendo partículas virais por 48 h a 37 °C.
- Remova os meios de maquilista virais e alimente as células transinduzidas pelo AAV com mídia completa.
NOTA: Somente as células que foram submetidas à transdução expressarão GFP e começarão a proliferar. As células que não sofreram transdução acabarão por morrer dentro de 2 semanas. - Após 2 semanas de expansão da cultura, as células de semeadura para validação e os experimentos in vivo tumorigenic.
NOTA: O DNA genômico das células transpolitadas com AAAV e células primárias normais de camundongos Cas9 foram extraídos para validar a edição específica do genoma usando protocolos padrão. O sequenciamento do DNA extraído e a análise dos dados sequenciados(Tabela 2)foram realizados por meio de um ensaio de sequenciamento de captura de hibridização baseada em captação (por exemplo, plataforma MSK-IMPACT) conforme descrito anteriormente21.
5. Validando a transformação de células normais para células tumorigenic usando imunofluorescência e borrão ocidental
- Imunofluorescência
- Semente 2 x 105 células em 12 mm de vidro coverslips e colocá-los em uma incubadora durante a noite.
- Fixar células em paraformaldeído de 4% na PBS (pH = 7,4) e processo de rotulagem de imunofluorescência.
- Incubar as células fixas com o primeiro anticorpo primário em 1% de Soro BSA ou 1% em PBST em uma câmara umidificada por 1 h em RT ou durante a noite em 4 °C. Os anticorpos primários utilizados são o coelho monoclonal anti-KRT 14, anticorpo anti-E-cadherin monoclonal de coelho e mAb de rato Cas9.
- Retire a solução primária de anticorpos dos lábios covers, lavando as células 3x por 5 min com 1x PBS.
- Incubar as células com Cy3 burro anti-coelho IgG e / ou cabra Cy3 anti-mouse IgG anticorpos secundários em 5% BSA em PBST por 1 h em RT no escuro.
- Retire a solução de anticorpos secundários dos lábios e lave as células 3x conforme descrito na etapa 5.1.4.
- Monte os lábios com uma gota de montagem média contendo DAPI (DAPI Fluoromount).
- Guarde no escuro a 4 °C até que os slides sejam imagemdos usando microscopia de fluorescência.
- Manchaocidental
- Semente 1 x 106 células transformadas em um prato de cultura de 100 mm e colocá-los em uma incubadora durante a noite.
- Lave e raspe as células transformadas em 200 μl gelo frio PBS.
- Centrífuga o tubo contendo a suspensão celular por 10 min a 2.000 x g a 4 °C para dota as células.
- Aspirar o supernatant e lyse as células usando tampão de lofe (ver Tabela 1)contendo coquetéis inibidores de fósforo e um inibidor de protease por 10 min a 4 °C. Centrífuga sacia das lysates por 10 min a 10.000 x g e 4 °C e recolher os lysates limpos.
- Use um kit de ensaio de Bradford comercialmente disponível para determinar a concentração de proteínas seguindo o protocolo do fabricante. Use buffer de amostra 4x (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromehenol azul) para ajustar as amostras de proteína para 0,5 ou 1 μg/μL. Ferva a 96 °C por 5 min.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou até que uma análise de borrão ocidental seja realizada. - Quantidades iguais separadas de lisato total (30 μg) por 10% de sulfato dodecyl-poliacrilamida gel (SDS-PAGE). Certifique-se de que o tinumodo atinja o fundo do gel. Transfira a proteína para a membrana de nylon por borrão semi-seco em 25 V por 30 min.
- Despeje 5% BSA em Tris-buffered salina (TBS) -0,1% Tween (TBST) sobre a membrana para cobri-lo completamente. Bloqueie a membrana por 1 h na RT. Incubar a mebrane com anticorpos primários (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, catetenina anti-β, anti p53, anti-fosfo-ERK e anti-β actin diluído em 5% BSA TBST) a 4 °C durante a noite.
- Após a incubação, lave as membranas por 10 min com 1x TBST certificando-se de que a solução cobre a membrana completamente. Realize esta lavagem 3x e, em seguida, adicione peroxidase de rábano (HRP) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:10,000 em 5% BSA TBST) para a membrana. Incubar por 1 h em RT.
- Após a incubação, lave as membranas por 10 min com 1x TBST certificando-se de que a solução cobre a membrana completamente. Realize as imagens chemiluminescence (ver Tabela de Materiais)para expor as bandas, e capturar imagens em conformidade.
- Validando o potencial tumorigenic de pilhas transformadas em ratos imunocompetentes
NOTA: Os ratos foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade Ben-Gurion do Negev. Aceno. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Camundongos SCID) e C57BL/6 foram utilizados para os estudos in vivo. Os ratos foram alojados em armários de fluxo laminar filtrados pelo ar com um ciclo claro/escuro de 12 horas e foram alimentados com comida e água ad libitum.- Use 6-8 semanas de idade nod feminino. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e camundongos C57BL/6 para o estudo.
- Trypsinize as células transformadas a AAV-Cas9. Pare a trippsinização usando DMEM pré-aquecido a 37 °C e recolher em um tubo de 50 mL.
- Centrífuga do tubo a 800 x g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota de células no meio DMEM sem FBS. Executar a centrífuga novamente e resuspender a pelota celular em 1x PBS.
NOTA: Não mantenha as células em 1x PBS por muito tempo. Mantenha sempre a suspensão da pilha no gelo para impedir a aglomeração da pilha. - Use um contador automático da pilha para contar as pilhas e diluir as pilhas à concentração desejada (2.5 x 107 pilhas/mL) usando 1x PBS. Gerar tumores através de uma injeção subcutânea da suspensão celular transformada AAV-Cas9 no flanco direito de cada NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Rato SCID) (2 x 106 células/rato). Para gerar um modelo ortotrópico em camundongos singênicos, injete 0,5 × 106 células primárias ou as células transformadas a AAV-Cas9 na língua de camundongos imunocompetentes C57BL/6.
- Eutanásia os animais 2 semanas após a injeção por asfixia CO2, e dissecar os tumores dos ratos eutanasiados para análise imunohistoquímica.
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Representative Results
Usando o sistema AAV para transformar as células cas9 normais
A Figura 1 fornece um mapa vetor detalhado do plasmid transgene AAV usado neste estudo. A Figura 2 descreve o design e o funcionamento do sistema baseado em AAV-Cas9. Para produzir partículas virais, as células HEK293T foram transpartidas com o vetor transgênico AAV e outros vetores de embalagens virais usando o método de transfecção PEI. Após a transfecção, as células contendo vírus foram coletadas e lizadas, e usando o processo de purificação heparina-agarose, as partículas virais foram purificadas e concentradas(Figura 2A). Estas partículas virais purificadas foram usadas para a transformação in vitro de células primárias isoladas de camundongos Cas9 para verificar a eficácia. Em nosso sistema, o de expressão transgênica AAV é introduzido através da recombinação homóloga no Cas9 Rosa26 dependente de Cre226 visando modelo dentro de células de camundongos que carregam um promotor CAG onipresente (pCAG), uma LoxP-Stop-LoxP (LSL), um gene nuclease Cas9, um peptídeo P2A auto-clivagem, e o gene repórter (EGFP) ladeado por dois braços homologous14. A atividade recombinante das células transinduzidas extirpa o LSL e induz a expressão de Cas9 e GFP(Figura 2B). A atividade de nuclease Cas9 introduz uma quebra dupla nos locais de interesse alvo, dirigida através de gRNAs, e ajuda na edição de genes. O sistema AAV utilizado neste estudo ajuda na entrega de gRNAs multiplexados (sgRNAs para KRAS, p53 e APC) e também na expressação de um alelo krasG12D oncogenic através de reparação dirigida por homologia (HDR) nas células transinduzidas.
Figura 1: Mapa vetorial do plasmid transgene AAV usado neste estudo. Este sistema AAV tem uma espinha dorsal AAV que expressa Acombinase e três sgRNAs u6-driven visando KRAS, p53 e APC. Ele também contém um kras g12d homologia dirigida reparação (Hdr) doador. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Design e funcionamento de um sistema AAV-Cas9 na transformação de células normais. (A) Esboço da produção e purificação de partículas AAV de HEK293T após transfeccioná-las com o transgene AAV e tranças de embalagem. (B) Transdução viral de células primárias com partículas AAV e o mecanismo pelo qual a expressão Cas9 dependente de Cre permite a edição CRISPR e a transformação das células primárias para células tumorigenic. Um único vetor de AAV que integra gRNAs para três genes diferentes com um knockin do alelo kras G12D através de HDR com uma fita de expressão recombinante Cre foi entregue em células primárias de camundongos Cas9 dependentes de Cre. A atividade recombinante nas células transinduzidas leva à excisão do LoxP-Stop-LoxP e induz a expressão de Cas9 e GFP. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Validação do sistema AAV-Cas9 in vitro em células isoladas de fibroblasto embrionário de camundongos
As células primárias de fibroblasto embrionário de camundongos (MEF) têm sido usadas exclusivamente para estudar as consequências da ablação gênica no crescimento celular e proliferação22. Para validar a eficiência do sistema AAV-Cas9 na transformação de células normais, transduzimos células MEF isoladas de embriões de camundongos Cas9 (E14) com AAV. As células mef foram isoladas como descrito anteriormente23,24. Mefs de 14 dias de idade embriões de camundongos Cas9 foram utilizados porque são fáceis de cultura e transduzir in vitro. Em resumo, para transformar mefs via transdução AAV, mefs primários em aproximadamente 30% de confluência foram considerados prontos para transdução. Uma hora antes da transdução, a mídia cultural do MEF foi alterada. O AAV purificado foi descongelado no gelo e a mídia cultural do MEF foi aspirada. Supernatant viral com um titer que varia de 106-1014 genoma viral/mL foi adicionado a cada poço e incubado durante a noite em 37 °C. O supernatant viral foi removido após 48 h, substituído com 2 mL do meio da cultura de MEF, e incubado então em 37 °C até a expressão de GFP, aproximadamente 5 dias após a transdução. Os MEFs expressos por GFP foram subculturados e validados. Note-se que para este vetor descobrimos que 1012 genomas virais/mL (equivalente a 1010 unidades transducantes/mL) poderiam transformar eficientemente as células MEF primárias em MEFs tumorigenic (Figura 3A). As células transinduzidas expressaram Cre, Cas9 e GFP (Figura 3B,C). Para acessar o potencial tumorigenic das células MEF transformadas a AAV, 0,5 x 106 células (MEF primário/Transinduzido por AAV) foram injetadas na língua, lábio e subcutâneamente em camundongos NOD-SCID. As células transformadas formaram tumores nesses camundongos, em comparação com o MEF primário, que não formou tumores(Figura 3D-F).
Figura 3: Validação e transformação in vitro das células mef primárias usando o sistema AAV-Cas9. (A) Esboço da transformação in vitro dos fibroblastos dos embriões coletados dos ratos Cas9 usando partículas de AAV. (B) Imagem representativa de imunofluorescência das células mef primárias mef e transinduzidas por AAV mostrando a expressão de GFP, Cre e Cas9. Dapi foi usado para manchar o núcleo. (C)Manchaocidental mostrando Cre, Cas9, GFP, e β-actin em fibroblastos normais embrionários e fibroblastos geneticamente editados. Imagemrepresentativa de um tumor de língua que se desenvolveu em um rato NOD-SCID depois de injetá-lo com células fibroblastas transformadas. (E)Imagem representativa de um tumor labial que se formou em um mouse NOD-SCID depois de injetá-lo com células fibroblastas transformadas. Imagemrepresentativa de um tumor de flanco que se desenvolveu em um rato NOD-SCID depois de injetá-lo com células fibroblastas transformadas. As flechas indicam um tumor. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Geração in vitro da linha de células epiteliais da língua de urina de urina tumgênica das células epiteliais da língua primária usando o sistema AAV-Cas9
Depois de validar a propriedade transformadora do sistema AAV usando as células MEF, isolamos células epiteliais da língua primária de camundongos Cas9 e as cultamos in vitro. As células da língua primária foram transinduzidas com partículas virais AAV (1010 cfu/mL), e após uma semana as células começaram a expressar GFP. A transformação tumorigenic de pilhas epiteleliais preliminares da língua (figura 4A)foi confirmada usando a imunofluorescência e a borração ocidental (figura 4B,C). As células transformadas exibem expressão melhorada de KRT 14, E-cadherin e GFP(Figura 4B). A transformação tumorigenic de pilhas epitelias preliminares da língua foi confirmada pela expressão de GFP (isto é, a expressão Cre-dependente de Cas9 e de GFP) (Figura 4C). A expressão de KRT14 e E-cadherin confirma suas características epiteliais. A validação de proteínas confirmou maior β-catenina, fosfosfos-ERK e expressão p53 reduzida (Figura 4C),indicando a inregulação efetiva da APC e p53 e a incorporação de KRAS mutantes nas células da língua, tornando-as tumorigenic. A análise genômica por um sequenciamento profundo do DNA isolado das células transformadas confirmou a edição eficaz de genes e a mudança de quadros dos genes TP53 e APC pelo sistema AAV-Cas9 (Tabela 2). A propriedade tumorigenic da linha de pilha de lingüeta AAV-transformada foi avaliada mais injetando a na lingüeta de ratos selvagens imunocompetentes c57BL/6. As células da língua transformadas, designadas como células epiteliais mutantes KRAS da língua (KRAS Mut EpT), formam tumores de forma eficiente em camundongos C57BL/6 (Figura 4D). Kras Mut EpT tumores foram avaliados por um patologista oral e maxilofacial por hematoxilina de rotina e eosina (H & E) manchae ndo imunohistoquímica. Os tumores exibiram uma morfologia de células fuso com atipia nuclear proeminente: pleomorfismo, hipercromatismo, núcleos gigantes, vários nucleoli e uma alta taxa mitocôtica com figuras mitocticas atípicas. A invasão perivascular e a angioinvasão também foram observadas. Estas características morfológicas foram acompanhadas por inflamação muito limitada associada ao tumor. Imunohistoquimicamente, as células neoplásticas foram citolasmicamente positivas para E-cadherin e KRT 14, ambos marcadores de tecido epiteliais. KRT 14 é típico de epitélio escamoso, apoiando a origem escamosa das células tumorais e, portanto, o diagnóstico de carcinoma de células escamosas (Figura 4E). Assim, essa abordagem fornece uma metodologia versátil para transformar as células primárias in vitro com uma alteração genética desejada. Além disso, esta metodologia facilita o uso dessas linhas celulares desenvolvidas in vivo em camundongos singênicos para uma melhor compreensão da neoplasia em um ambiente real de microambiente tumoral.
Figura 4: Transformação in vitro das células epiteliais da língua primária usando o sistema AAV-Cas9. A) Representação esquemática da transformação in vitro de células epiteliais normais obtidas da língua de camundongos Cas9. (B) Imagem representativa de imunofluorescência de células epiteliais da língua transduzidas pelo AAV mostrando a expressão de KRT14, E-cadherin e GFP. (C)Mancha ocidental mostrando a resregulação de Cas9, β-catenina e phospho-ERK com downregulation do nível de proteína p53, mostrando as células epiteliais geneticamente editados. (D)Imagem representativa de um tumor que se desenvolveu na língua dos camundongos imunocompetentes depois de injetá-los com células epiteliais de língua transformada (KRAS Mut EpT). (E)Imagens representativas de seções de tecido tumoral para h&e, e-cadherin, e KRT 14 manchas em 20x e 40x ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Tampão da lyse da pilha para a colheita viral | Volume |
| 150 mM NaCl 150 mM NaCl | 876.6mg 876.6mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605.7mg 605.7mg |
| Use HCl para ajustar o pH 8.5 | |
| Água molecular da classe | Compor até 100 mL |
| Tampão de equilíbrio | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18.64mg 18.64mg |
| Misture tudo em PBS 1X e ajuste o pH para 7,2 | Compor até 100 mL |
| Tampão de elução | |
| 0,5 m nacl | 2.92g |
| Misture tudo em PBS 1X e ajuste o pH para 7,2 | Compor até 100 mL |
| 10x Triple Enzyme Stock Solution: | |
| Colagem | 1 g concfinal final. [10 mg/ml] |
| Hialuronidase | 100 mg [1 mg/ml] |
| Dnase | 20.000 Unidades conc final. [200 mg/ml] |
| PBS 1X PBS 1X | Compor até 100 mL |
| Plasmid mix (para uma placa de 14,5 cm) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10μg 10μg |
| AAV 2/9 capsid vetor | 10μg 10μg |
| ajudante delta F5 do pAD | 10μg 10μg |
| PEI (1μg/μl Stock) | 90μl 90μl |
| DMEM DMEM | 1 mL |
Tabela 1: Receitas de buffers utilizadas neste estudo.
Tabela 2: Dados de análise do genoma das células EpT Kras Mut. Clique aqui para ver esta tabela (Clique certo para baixar).
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Discussion
Vários métodos já foram usados para transformar as células primárias na cultura com graus variáveis de sucesso25,26,27,28. A maioria desses métodos utiliza células fibroblasto de camundongos para transformação14,17,18,19 ou usa agentes cancerígenos como 4-nitroquinoline-1-óxido (4-NQO)21,22 para o desenvolvimento de modelos de linha celular de urina. O uso de modelos de camundongos nocaute e transgênicotambém aumentou muito nossa compreensão das várias vias moleculares que regem o desenvolvimento e a diferenciação do HNC. O uso de linhas epiteliais orais da pilha do murine com um teste padrão genético original complementaria certamente estes estudos, e seus ensaios bioquímicos subseqüentes contribuiriam para o tratamento e o diagnóstico de HNC. No entanto, apenas alguns relatos descreveram o estabelecimento de células epiteliais orais do mouse28,29,30,31,32,33 e essas linhas celulares não estão em uso generalizado.
A limitação principal destas linhas epiteliais orais da pilha do murine é que não estão caracterizadas extensivamente a nível molecular e foram encontradas para expressar testes padrões raros do gene. Assim, a compreensão molecular limitada destes modelos da linha da pilha do murine e a falta de uma metodologia eficiente alertaram-nos aproveitarar o potencial original da tecnologia da edição do genoma de AAV-CRISPR em ratos knock-in de Cas9 para estabelecer linhas da pilha do murine com alterações genéticas específicas. Neste estudo, introduzimos e desenvolvemos um sistema AAV-Cas9 in vitro para transformar as células primárias de urina em um estado tumigênico para confirmar as alterações genéticas que dão origem a células carcinoma. Estabelecemos com sucesso células epiteliais da língua murina com mutações genéticas específicas com alta eficiência usando a edição de genes somáticos induzidos por CRISPR mediado por AAV por várias combinações de sgRNA.
Esta metodologia oferece uma nova abordagem experimental para uma melhor compreensão da etiologia autônoma de células do HNC. Começando com células epiteliais da língua primária murine, fomos capazes de transformar essas células em tumorigenicidade, excluindo um conjunto limitado de genes e introduzindo uma única mutação KRAS. Usando essa metodologia, agora é possível investigar se outros genes conhecidos por estarem implicados em outros carcinomas podem produzir malignidades que se assemelham mais ao HNC. As características morfológicas dos tumores do KRAS Mut EpT confirmaram carcinoma de células escamosas. A análise histopatológica dos tumores KRAS Mut EpT em camundongos singênicos está associada e apoia o comportamento biológico agressivo do carcinoma da cabeça e pescoço. Assim, pode ser possível ligar os genótipos das células cancerosas a características clínicas e histopatológicas específicas dos tumores.
As principais vantagens desta metodologia são a capacidade de desenvolver linhas celulares a partir de células primárias a partir de qualquer órgão usando mutações genéticas específicas e o uso de AAV-Cas9, o que torna o sistema mais robusto e estável. O sistema cas9 endógeno torna possível utilizar outros nocautes genéticos. A maior desvantagem da metodologia atual é o tempo necessário para isolar e estabelecer a cultura primária, bem como o alto díterdo de partículas virais necessárias para transduzir as células primárias. No entanto, isso poderia ser superado padronizando o processo de isolamento para cada tipo de célula. O problema de exigir um titer viral elevado de AAV para a transdução eficiente poderia ser aliviado pelo uso da geração a mais atrasada de plasmids capsid e de ajudante para o empacotamento viral e um processo melhor da purificação.
No futuro, um sistema AAV melhor e mais eficiente poderia ser projetado e extrapolado in vivo para fazer modelos tumorais geneticamente modificados específicos de órgãos. Em conclusão, o estabelecimento das linhas celulares de urina por essa abordagem servirá como uma valiosa ferramenta baseada em cultura de células in vitro para testar várias hipóteses no contexto da oncologia.
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Disclosures
M.S. faz parte do Conselho Consultivo do Instituto de Biociências, e Menarini Ricerche recebeu fundos de pesquisa da Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics e Menarini Ricerche. M.S. também é co-fundador da Medendi Medical Travel e, nos últimos 2 anos, recebeu homenageada de Menarini Ricerche e Da ADC Pharma. Todos os outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer ao Dr. Daniel Gitler por nos fornecer o plasmid pAd Delta 5 Helper. Este trabalho foi financiado pela Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (para ME), a United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (para ME e MS), a Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (para ME), a Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (para ME) e a Concern Foundation (#7895) (para ME). Companheirismo: a bolsa Alon para ME e Bolsas BGU Kreitman para SJ e MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
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