Summary

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

Published: January 09, 2020
doi:

Summary

頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。

Abstract

原発性正常上皮細胞の使用により、細胞内遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に特異的な変異を導入することにより、細胞間のクラスタリング制御を用いて、細胞形質転換に必要なゲノム変化を再現的に誘導することが可能になる。マウスにおける短いパリンドロミック反復(CRISPR)ベースのゲノム編集技術。この技術により、マウスを用いてヒトがんに生じる遺伝的変化を正確に模倣することができます。マウスの一次細胞を遺伝子組み換えすることで、がんの発症、進行、治療、診断をより良く研究することができます。本研究では、クレ誘導性Cas9マウス舌上皮細胞を用いて、アデノ関連ウイルス(AAV)をインビトロでゲノム編集することを可能にした。具体的には、正常舌上皮細胞でKRAS、p53、APCを改変することにより、同系マウスの腫瘍性であるプリン頭頸部癌(HNC)細胞株をインビトロで生成した。ここで提示する方法は、特定のゲノム改変を有するHNC細胞株を生成する方法を詳細に説明し、同系マウスにおける腫瘍進行を予測するための適合性を説明する。我々は、この有望な方法がHNCの腫瘍生物学と治療を研究するのに有益かつ有用であろうことを想像する。

Introduction

HNCは世界的に一般的な悪性腫瘍である 1.HNC新生物の起源をモデル化することは、現在科学的転換点2にあります。HNC2、3、4(例えば、TP53、PIK3CA、NOTCH1、FAT1、RAS)では多くの遺伝子変異が同定されているが、HNCを誘導するために協調して必要なゲノム改変の特異的な組み合わせは不明のままである。

ヒトHNC細胞株の現在の使用は、病因および治療3に関連するメカニズムを解明するのに有意に役立った。しかしながら、免疫不全マウス系におけるヒト細胞株の研究には限界があり、これらのシステムは生体内新生物プロセス、特定の遺伝子変異の役割、免疫微小環境における治療応答に対処しない。したがって、特定の遺伝子改変を伴うマウス細胞株の開発と確立は、異なる遺伝子が形質転換過程にどのように寄与するかを研究し、免疫能力マウスにおける新規分子ベースの治療法を試験するために最も重要である。

生物医学研究における遺伝子機能研究は、DNA編集技術の進歩によって、二本鎖切断(DSB)を導入することにより、例えば5.これらの技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ、およびクラスター化された調節間短いパリンドロミック反復(CRISPR/Cas9)を含め、その軌跡における目的の任意の遺伝子の操作を可能にする。最新のCRISPR/Cas9システムは、ゲノム内の特定の部位でDSBを生成するようにCas9ヌクレアーゼを指示するガイドRNA(gRNA)で構成されています。このシステムは、最も伝統的に治療が困難な生物5においても、任意の細胞または標的組織における内因性遺伝子を改変する際に広範な認識を得ている。シンプルさ、スピード、効率性により、他のシステムに対して複数の利点があります。

腫瘍学では、CRISPR/CAS9技術は効果的に癌細胞を模倣する必要性を満たしています。HNCでこのシステムを確立するために、我々は強力なKRAS腫瘍遺伝子と2つの重要な腫瘍抑制遺伝子、APCおよびp536を操作した。GENIE データベース7によると、この組み合わせは HNC ではまれです。RAS突然変異(HRAS、NRAS、およびKRAS)は、すべてのHNC集団の約7%にしか存在しない。これらの腫瘍は、治療8、9に耐性である傾向がある。

Cas9とそのgRNAの送達は、AAVまたはレンチウイルスのいずれかを使用してウイルス導入を介して達成される。組換えAAVは、多くの場合、その高い力力、軽度の免疫応答、細胞の広い範囲を伝達する能力、および全体的な安全性に起因する標的細胞に遺伝子を送達するための好ましい方法です。AAVシステムを用いて、種々の組織特異的マウス細胞株が生成され、新しい細胞株が10、11、12で開発されている。しかし、マウスHNC細胞株モデル細胞を生成できる効率的なゲノム編集システムは未だに開発されている。本研究では、原発マウス舌細胞を腫瘍原性状態に変換するためのin vitro AAV-Cas9ベースのシステムの開発を模索した。このユニークなCRISPR/Cas9変換プロトコルと確立された腫瘍細胞株は、ゲノム変化の多様性によって誘発されるHNCの生物学をよりよく理解するために使用することができます。

Protocol

この研究は、ネゲブ動物ケア・使用委員会のベン・グリオン大学によって承認されました。動物実験は、IACUC(IL.80-12-2015およびIL.29-05-2018(E))によって承認された。本研究で用いられた動物実験、住宅、環境条件のすべての側面は、実験動物のケアと使用のためのガイド13に準拠していました。 1. アデノ関連ウイルス産生 1日目:細胞培養 DMEMの1…

Representative Results

AAV システムを使用して正常な Cas9 セルを変換する図1は、本研究で用いられるAAVトランスジーンプラスミドの詳細なベクターマップを提供する。図 2は、AAV-Cas9 ベースシステムの設計と動作の概要を示しています。ウイルス粒子を生成するために、HEK293T細胞をPEIトランスフェクション法を用いてAAVトランス?…

Discussion

いくつかの方法は、以前に成功の程度が可変で培養中の一次細胞を変換するために使用されてきました25,26,27,28.これらの方法のほとんどは、形質転換14、17、18、19にマウス線維芽細胞を使用するか、または4-ニトロキノ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

pAdデルタ5ヘルパープラスミドを提供してくれたダニエル・ギトラー博士に感謝します。この作品はイスラエル科学財団(ISF、 700/16(ME)、米国・イスラエル二国籍科学財団(BSF、2017323)(MEおよびMS)、イスラエル癌協会(ICA、20170024)(ME)、イスラエル癌研究財団(ICRF、17-1693-RCDA)(ME)、懸念財団(#7895)(ME)。フェローシップ:私とBGUクリットマンへのアロン・フェローシップとSJとMPへのフェローシップ。

Materials

Antibodies
Anti mouse HRP Jackson ImmunoResearch 115-035-146
Anti rabbit HRP Jackson ImmunoResearch 711-035-152
Cas9 Mouse mAb Cell Signaling Technology 14697
Cre BioLegend 900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-165-144
GFP Santa Cruz Biotechnology sc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) Cell Signaling Technology 4370
Rabbit monoclonal anti E cadherin Cell Signaling Technology 3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14 Abcam AB-ab181595
β actin MP Biomedicals 691001
β catenin Cell Signaling Technology 9582S
Cell lines
HEK93T ATCC CRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford Reagent Bio-Rad 30015484
BSA Amresco 0332-TAM-50G
DAPI fluoromount Southern Biotech 0100-20
DMEM Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) Cyanagen XLS3.0100 and XLS071.0250
FBS Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 04-127-1A
HBSS Sigma H6648
Heparin – Agarose Sigma H6508
Isolate II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52066
MgCl2 Panreac AppliChem 300283
NaCl Bio Lab Ltd 1903059100
PBS Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 02-023-1A
PEI Polysciences 23966-1
Pen Strep Solution Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 03-031-1B
PFA Santa Cruz Biotechnology 30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktail Biotool B15001A/B
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma P2714-1BTL
Tris buffer MERCK Millipore 648311-1KG
Enzymes
Benzonase Sigma E1014
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019
DNAse Thermo Fisher Scientific 18047019
Hyaluronidase MilliporeSigma H3506
Trypsin Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 03-050-1B
Glass wares
Cover slips Bar Naor BNCB00130RA1
Slides Bar Naor BN9308C
Mouse strains
C57BL/6 Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J Jackson labs 24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR Broad Institute of MIT Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vector Addgene 112865
pAD Delta F5 helper Ben Gurion University of the Negev Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDa Millipore UFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mm Millex SLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mm Millex SLHV013SL
Culture plates Greiner Bio-One
Falcon tubes Greiner Bio-One

References

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).

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Prasad, M., Jagadeeshan, S., Scaltriti, M., Allon, I., Elkabets, M. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (155), e60410, doi:10.3791/60410 (2020).

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