アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立
Summary
頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。
Abstract
原発性正常上皮細胞の使用により、細胞内遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に特異的な変異を導入することにより、細胞間のクラスタリング制御を用いて、細胞形質転換に必要なゲノム変化を再現的に誘導することが可能になる。マウスにおける短いパリンドロミック反復(CRISPR)ベースのゲノム編集技術。この技術により、マウスを用いてヒトがんに生じる遺伝的変化を正確に模倣することができます。マウスの一次細胞を遺伝子組み換えすることで、がんの発症、進行、治療、診断をより良く研究することができます。本研究では、クレ誘導性Cas9マウス舌上皮細胞を用いて、アデノ関連ウイルス(AAV)をインビトロでゲノム編集することを可能にした。具体的には、正常舌上皮細胞でKRAS、p53、APCを改変することにより、同系マウスの腫瘍性であるプリン頭頸部癌(HNC)細胞株をインビトロで生成した。ここで提示する方法は、特定のゲノム改変を有するHNC細胞株を生成する方法を詳細に説明し、同系マウスにおける腫瘍進行を予測するための適合性を説明する。我々は、この有望な方法がHNCの腫瘍生物学と治療を研究するのに有益かつ有用であろうことを想像する。
Introduction
HNCは世界的に一般的な悪性腫瘍である 1.HNC新生物の起源をモデル化することは、現在科学的転換点2にあります。HNC2、3、4(例えば、TP53、PIK3CA、NOTCH1、FAT1、RAS)では多くの遺伝子変異が同定されているが、HNCを誘導するために協調して必要なゲノム改変の特異的な組み合わせは不明のままである。
ヒトHNC細胞株の現在の使用は、病因および治療3に関連するメカニズムを解明するのに有意に役立った。しかしながら、免疫不全マウス系におけるヒト細胞株の研究には限界があり、これらのシステムは生体内新生物プロセス、特定の遺伝子変異の役割、免疫微小環境における治療応答に対処しない。したがって、特定の遺伝子改変を伴うマウス細胞株の開発と確立は、異なる遺伝子が形質転換過程にどのように寄与するかを研究し、免疫能力マウスにおける新規分子ベースの治療法を試験するために最も重要である。
生物医学研究における遺伝子機能研究は、DNA編集技術の進歩によって、二本鎖切断(DSB)を導入することにより、例えば5.これらの技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ、およびクラスター化された調節間短いパリンドロミック反復(CRISPR/Cas9)を含め、その軌跡における目的の任意の遺伝子の操作を可能にする。最新のCRISPR/Cas9システムは、ゲノム内の特定の部位でDSBを生成するようにCas9ヌクレアーゼを指示するガイドRNA(gRNA)で構成されています。このシステムは、最も伝統的に治療が困難な生物5においても、任意の細胞または標的組織における内因性遺伝子を改変する際に広範な認識を得ている。シンプルさ、スピード、効率性により、他のシステムに対して複数の利点があります。
腫瘍学では、CRISPR/CAS9技術は効果的に癌細胞を模倣する必要性を満たしています。HNCでこのシステムを確立するために、我々は強力なKRAS腫瘍遺伝子と2つの重要な腫瘍抑制遺伝子、APCおよびp536を操作した。GENIE データベース7によると、この組み合わせは HNC ではまれです。RAS突然変異(HRAS、NRAS、およびKRAS)は、すべてのHNC集団の約7%にしか存在しない。これらの腫瘍は、治療8、9に耐性である傾向がある。
Cas9とそのgRNAの送達は、AAVまたはレンチウイルスのいずれかを使用してウイルス導入を介して達成される。組換えAAVは、多くの場合、その高い力力、軽度の免疫応答、細胞の広い範囲を伝達する能力、および全体的な安全性に起因する標的細胞に遺伝子を送達するための好ましい方法です。AAVシステムを用いて、種々の組織特異的マウス細胞株が生成され、新しい細胞株が10、11、12で開発されている。しかし、マウスHNC細胞株モデル細胞を生成できる効率的なゲノム編集システムは未だに開発されている。本研究では、原発マウス舌細胞を腫瘍原性状態に変換するためのin vitro AAV-Cas9ベースのシステムの開発を模索した。このユニークなCRISPR/Cas9変換プロトコルと確立された腫瘍細胞株は、ゲノム変化の多様性によって誘発されるHNCの生物学をよりよく理解するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかの方法は、以前に成功の程度が可変で培養中の一次細胞を変換するために使用されてきました25,26,27,28.これらの方法のほとんどは、形質転換14、17、18、19にマウス線維芽細胞を使用するか、または4-ニトロキノ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pAdデルタ5ヘルパープラスミドを提供してくれたダニエル・ギトラー博士に感謝します。この作品はイスラエル科学財団(ISF、 700/16(ME)、米国・イスラエル二国籍科学財団(BSF、2017323)(MEおよびMS)、イスラエル癌協会(ICA、20170024)(ME)、イスラエル癌研究財団(ICRF、17-1693-RCDA)(ME)、懸念財団(#7895)(ME)。フェローシップ:私とBGUクリットマンへのアロン・フェローシップとSJとMPへのフェローシップ。
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
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