아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

Manu Prasad; Sankar Jagadeeshan; Maurizio Scaltriti; Irit Allon; Moshe Elkabets

doi:10.3791/60410

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방법 논문

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

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DOI:

10.3791/60410

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2020년 1월 9일

Manu Prasad^*¹^,² , Sankar Jagadeeshan^*¹^,² , Maurizio Scaltriti³ , Irit Allon²^,⁴ , Moshe Elkabets¹^,²

¹The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, ²Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, ³Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ⁴Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

원발성 정상 상피 세포의 사용은 군집된 조절 식 인터스페이스를 사용하여 종양 유전자 및 종양 억제 유전자에 특정 돌연변이를 도입하여 세포 변형에 필요한 게놈 변경을 재현가능하게 유도할 수 있게 합니다. 마우스에 있는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR) 기지를 둔 게놈 편집 기술. 이 기술은 우리가 정확하게 마우스를 사용하여 인간적인 암에서 일어나는 유전 변경을 모방하는 것을 허용합니다. 뮤린 원발성 세포를 유전적으로 변형시킴으로써 암 발병, 진행, 치료 및 진단을 더 잘 연구할 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 시험관에서 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용하여 게놈 편집을 가능하게 하기 위하여 Cre 유도가능한 Cas9 마우스 혀 상피 세포를 이용했습니다. 구체적으로, KRAS, p53 및 APC를 정상 혀 상피 세포에서 변경함으로써, 우리는 생체 외에서 뮤린 두경부암(HNC) 세포주생성, 이는 합성 마우스에서 종양발생이다. 여기에 제시된 방법은 특정 게놈 변경을 가진 HNC 세포주를 생성하는 방법을 상세히 기술하고 syngeneic 마우스에 있는 종양 진행을 예측하기 위한 그들의 적합성을 설명합니다. 우리는 이 유망한 방법이 HNC의 종양 생물학 그리고 치료를 공부하는 유익하고 유용할 것이라는 점을 구상합니다.

서론

HNC는^전세계적으로 일반적인 악성 1입니다. HNC 신생물의 기원을 모델링하는 것은 현재 과학적 전환점^2. 많은 유전 적 돌연변이가 HNC^2,³^,⁴ (예를 들어, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 및 RAS)에서 확인되었지만 HNC를 유도하기 위해 함께 요구되는 유전체 변종의 특정 조합은 불분명하게 남아 있다.

인간 HNC 세포주의 현재 사용은 크게 병인 및 치료와 관련된 메커니즘을 해명하는 데 도움이^3. 그러나, 면역 타협 된 뮤린 시스템에서 인간 세포주의 연구는 그 한계를 가지고, 이러한 시스템은 생체 내 신생물 과정, 특정 유전자 돌연변이의 역할, 및 면역 미세 환경에서 치료 반응을 해결하지 않기 때문에. 그러므로, 특정 유전 변경을 가진 murine 세포주의 발달 그리고 설치는 다른 유전자가 어떻게 다른 유전자가 변환 프로세스에 기여하는지 공부하고 면역 적격 마우스에 있는 새로운 분자 기지를 둔 치료를 시험하기 위하여 1 차적인 ....