Summary

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

Published: January 09, 2020
doi:

Summary

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

Abstract

원발성 정상 상피 세포의 사용은 군집된 조절 식 인터스페이스를 사용하여 종양 유전자 및 종양 억제 유전자에 특정 돌연변이를 도입하여 세포 변형에 필요한 게놈 변경을 재현가능하게 유도할 수 있게 합니다. 마우스에 있는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR) 기지를 둔 게놈 편집 기술. 이 기술은 우리가 정확하게 마우스를 사용하여 인간적인 암에서 일어나는 유전 변경을 모방하는 것을 허용합니다. 뮤린 원발성 세포를 유전적으로 변형시킴으로써 암 발병, 진행, 치료 및 진단을 더 잘 연구할 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 시험관에서 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용하여 게놈 편집을 가능하게 하기 위하여 Cre 유도가능한 Cas9 마우스 혀 상피 세포를 이용했습니다. 구체적으로, KRAS, p53 및 APC를 정상 혀 상피 세포에서 변경함으로써, 우리는 생체 외에서 뮤린 두경부암(HNC) 세포주생성, 이는 합성 마우스에서 종양발생이다. 여기에 제시된 방법은 특정 게놈 변경을 가진 HNC 세포주를 생성하는 방법을 상세히 기술하고 syngeneic 마우스에 있는 종양 진행을 예측하기 위한 그들의 적합성을 설명합니다. 우리는 이 유망한 방법이 HNC의 종양 생물학 그리고 치료를 공부하는 유익하고 유용할 것이라는 점을 구상합니다.

Introduction

HNC는세계적으로 일반적인 악성 1입니다. HNC 신생물의 기원을 모델링하는 것은 현재 과학적 전환점2. 많은 유전 적 돌연변이가 HNC2,3,4 (예를 들어, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 및 RAS)에서 확인되었지만 HNC를 유도하기 위해 함께 요구되는 유전체 변종의 특정 조합은 불분명하게 남아 있다.

인간 HNC 세포주의 현재 사용은 크게 병인 및 치료와 관련된 메커니즘을 해명하는 데 도움이3. 그러나, 면역 타협 된 뮤린 시스템에서 인간 세포주의 연구는 그 한계를 가지고, 이러한 시스템은 생체 내 신생물 과정, 특정 유전자 돌연변이의 역할, 및 면역 미세 환경에서 치료 반응을 해결하지 않기 때문에. 그러므로, 특정 유전 변경을 가진 murine 세포주의 발달 그리고 설치는 다른 유전자가 어떻게 다른 유전자가 변환 프로세스에 기여하는지 공부하고 면역 적격 마우스에 있는 새로운 분자 기지를 둔 치료를 시험하기 위하여 1 차적인 중요합니다.

생물 의학 연구에서 유전자 기능 연구는 DNA 편집 기술의 발전에 의해 크게 영향을 받았습니다, 이중 가닥 휴식 (DSBs)를 도입 하 여, 예를 들어5. 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제, 클러스터된 조절 식 간 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR/Cas9)의 사용을 포함한 이러한 기술은 궤적에서 관심 있는 유전자의 조작을 허용합니다. 최신 CRISPR/Cas9 시스템은 게놈의 특정 부위에서 DSB를 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에게 지시하는 가이드 RNA(gRNA)로 구성됩니다. 이 시스템은 어떤 세포 또는 표적 조직에서 내인성 유전자를 수정하는 데 있어, 심지어 가장 전통적으로 치료하기 어려운 유기체에서도5. 단순성, 속도 및 효율성으로 인해 다른 시스템에 비해 여러 가지 장점이 있습니다.

종양학에서 CRISPR/CAS9 기술은 암세포를 효과적으로 모방할 필요성을 충족시켰습니다. HNC에 있는 이 시스템을 설치하기 위하여는, 우리는 강력한 KRAS 종양유전자 및 2개의 중요한 종양 억제유전자, APC 및 p536를조작했습니다. GENIE 데이터베이스7에따르면, 이 조합은 HNC에서 드물다. RAS 돌연변이 (HRAS, NRAS 및 KRAS)는 모든 HNC 인구의 단지 ~7%에서 존재합니다. 이러한 종양은 치료8,9에내성이있는 경향이있다.

Cas9 및 그 gRNA의 전달은 AAV 또는 렌티바이러스를 사용하여 바이러스 성 전달을 통해 달성된다. 재조합 AAV는 종종 그것의 높은 역가, 온화한 면역 반응, 세포의 넓은 범위를 변환 하는 능력, 그리고 전반적인 안전 으로 인해 대상 세포에 유전자를 제공 하기 위한 바람직한 방법. AAV 시스템을 사용하여 다양한 조직 특이적 마우스 세포주가 생성되고 있으며, 새로운 세포주는 여전히10,11,12로개발되고 있다. 그러나, 뮤린 HNC 세포주 모델 세포를 생성할 수 있는 효율적인 게놈 편집 시스템은 여전히 개발되고 있다. 이 연구에서, 우리는 1 차적인 뮤린 혀 세포를 종양성 상태로 변형시키기 위한 시험관 내 AAV-Cas9 기반 시스템을 개발하고자 했습니다. 이러한 독특한 CRISPR/Cas9 형질전환 프로토콜 및 확립된 종양 세포주들은 다양한 게놈 변화에 의해 유도된 HNC의 생물학을 더 잘 이해하는데 사용될 수 있다.

Protocol

이 연구는 네게브 동물 관리 및 사용 위원회의 벤 구리온 대학에 의해 승인되었다. 동물 실험은 IACUC(IL.80-12-2015 및 IL.29-05-2018(E))에 의해 승인되었다. 이 연구에 사용된 동물 실험, 주거 및 환경 조건의 모든 측면은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드13을준수했다. 1. 아데노 관련 바이러스 생산 1일차: 세포 배양 DMEM의 15 mL에서 14.5 cm 플레이…

Representative Results

AAV 시스템을 사용하여 일반 Cas9 셀 변환도 1은 본 연구에서 사용된 AAV 이식유전자 플라스미드의 상세한 벡터 맵을 제공한다. 그림 2는 AAV-Cas9 기반 시스템의 설계 및 작동을 간략하게 설명합니다. 바이러스 성 입자를 생성하기 위해, HEK293T 세포는 PEI 형질감염 방법을 사용하여 AAV 이식 유전자 벡터 및 기타 바이러?…

Discussion

여러 가지 방법은 이전에 성공25,26,27,28의가변 학위를 가진 배양에서 1 차 세포를 형질전환하는 데 사용되어 왔다. 이들 방법의 대부분은 마우스 섬유아세포변형14,17,18,19 또는 4-니트로퀴놀린-1-산화물(4-NQ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 포드 델타 5 도우미 플라스미드를 제공 해 주신 다니엘 Gitler 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF)에 의해 지원되었다, 700/16) (ME), 미국-이스라엘 양국 과학 재단 (BSF, 2017323) (ME 및 MS), 이스라엘 암 협회 (ICA, 20170024) (ME), 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), 그리고 우려 재단 (#7895 me). 펠로우십: 저와 BGU 크릿만과 SJ 및 MP에 대한 알론 펠로우십.

Materials

Antibodies
Anti mouse HRP Jackson ImmunoResearch 115-035-146
Anti rabbit HRP Jackson ImmunoResearch 711-035-152
Cas9 Mouse mAb Cell Signaling Technology 14697
Cre BioLegend 900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-165-144
GFP Santa Cruz Biotechnology sc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) Cell Signaling Technology 4370
Rabbit monoclonal anti E cadherin Cell Signaling Technology 3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14 Abcam AB-ab181595
β actin MP Biomedicals 691001
β catenin Cell Signaling Technology 9582S
Cell lines
HEK93T ATCC CRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford Reagent Bio-Rad 30015484
BSA Amresco 0332-TAM-50G
DAPI fluoromount Southern Biotech 0100-20
DMEM Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) Cyanagen XLS3.0100 and XLS071.0250
FBS Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 04-127-1A
HBSS Sigma H6648
Heparin – Agarose Sigma H6508
Isolate II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52066
MgCl2 Panreac AppliChem 300283
NaCl Bio Lab Ltd 1903059100
PBS Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 02-023-1A
PEI Polysciences 23966-1
Pen Strep Solution Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 03-031-1B
PFA Santa Cruz Biotechnology 30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktail Biotool B15001A/B
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma P2714-1BTL
Tris buffer MERCK Millipore 648311-1KG
Enzymes
Benzonase Sigma E1014
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019
DNAse Thermo Fisher Scientific 18047019
Hyaluronidase MilliporeSigma H3506
Trypsin Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 03-050-1B
Glass wares
Cover slips Bar Naor BNCB00130RA1
Slides Bar Naor BN9308C
Mouse strains
C57BL/6 Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J Jackson labs 24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR Broad Institute of MIT Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vector Addgene 112865
pAD Delta F5 helper Ben Gurion University of the Negev Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDa Millipore UFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mm Millex SLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mm Millex SLHV013SL
Culture plates Greiner Bio-One
Falcon tubes Greiner Bio-One

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Prasad, M., Jagadeeshan, S., Scaltriti, M., Allon, I., Elkabets, M. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (155), e60410, doi:10.3791/60410 (2020).

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