जन्म के पूर्व Isl मिलियन से ओकुलोमोटर, ट्रोक्लोर और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की अलगाव और संस्कृति: जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहे
Summary
यह काम प्राथमिक ओकुलोमोटर, ट्रोक्लोर और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की सजातीय कोशिका संस्कृतियों को उपज देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इन संस्कृतियों का उपयोग नेत्र और रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स की रूपात्मक, सेलुलर, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Abstract
रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स (एसएमएनएस) की तुलना में ओकुलोमोटर न्यूरॉन्स (CN3s) और ट्रोक्लोर न्यूरॉन्स (CN4s) अपक्षयी मोटर न्यूरॉन्स रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) के लिए उल्लेखनीय प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। प्राथमिक माउस CN3s, CN4s, और SMNs को अलग करने और संस्कृति करने की क्षमता इस चयनात्मक भेद्यता अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करेगी। आज तक, अधिकांश प्रोटोकॉल विषम कोशिका संस्कृतियों का उपयोग करते हैं, जो प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या को चकित कर सकते हैं। मिश्रित-कोशिका आबादी से जुड़ी समस्याओं को कम करने के लिए, शुद्ध संस्कृतियां अपरिहार्य हैं। यहां, पहला प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि भ्रूण दिवस ११.५ (E11.5) IslMN:GFP ट्रांसजेनिक माउस भ्रूण का उपयोग कर एक ही भ्रूण से एक ही भ्रूण से SMNs समकक्षों के साथ CN3s/CN4s को कुशलतापूर्वक शुद्ध और खेती करने के लिए । प्रोटोकॉल ऊतक विच्छेदन और विच्छेदन, FACS आधारित सेल अलगाव, और CN3/CN4 और SMN नाभिक से कोशिकाओं की विट्रो खेती पर विवरण प्रदान करता है । यह प्रोटोकॉल मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए विट्रो CN3/CN4 संस्कृति प्रणाली में एक उपन्यास जोड़ता है और एक साथ तुलना के लिए एक शुद्ध प्रजातियों और उंर मिलान SMN संस्कृति प्रदान करता है । मोटर न्यूरॉन्स की रूपात्मक, सेलुलर, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित करने वाले विश्लेषण इस संस्कृति प्रणाली में व्यवहार्य हैं। यह प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन विकास, चयनात्मक भेद्यता और रोग को परिभाषित करने वाले तंत्रों में अनुसंधान को सक्षम करेगा।
Introduction
प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स की संस्कृति एक शक्तिशाली उपकरण है जो न्यूरोनल विकास, कार्य और एक्सोजेनस तनावके अध्ययन को सक्षम बनाता है। मोटर न्यूरॉन संस्कृतियां न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस)1,2के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, जिनकी रोग तंत्र को अधूरा समझा जाता है। दिलचस्प बात यह है कि एएलएस रोगियों और एएलएस मॉडल चूहों दोनों में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स (एसएमएनएस) की महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु के बावजूद, ओकुलोमोटर न्यूरॉन्स (सीएन3एस) और ट्रोक्लोर न्यूरॉन्स (सीएन4) में सेल डेथ अपेक्षाकृत दुर्लभ1,3,4,5,7,7,8,9हैं। इसलिए, CN3s/CN4s और SMNs की शुद्ध संस्कृतियों के तुलनात्मक विश्लेषण सापेक्ष भेद्यता अंतर्निहित तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान कर सकता है । दुर्भाग्य से, इस तरह के विश्लेषण के लिए एक प्रमुख बाधा इन मोटर न्यूरॉन्स की शुद्ध संस्कृतियों को विकसित करने में असमर्थता रही है ।
पशु मॉडल ों से एसएमएनएस के शुद्धिकरण के लिए कई प्रोटोकॉल बताए गए हैं। इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल घनत्व ढाल केंद्रीकरण10,11,12 और/या p75एनटीआर-एंटीबॉडीआधारित सेल-छंटाई पैनिंग तकनीक13,14,15,16का उपयोग करते हैं । घनत्व ढाल केंद्रीकरण अन्य रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं के सापेक्ष एसएमएनएस के बड़े आकार का शोषण करता है, जबकि p75एनटीआर रीढ़ की हड्डी में एसएमएनएस द्वारा विशेष रूप से व्यक्त किया गया एक बाह्य प्रोटीन है। इनमें से एक या दोनों प्रोटोकॉल 11,12,14द्वारा लगभग 100% शुद्ध स्एम संस्कृतियों का उत्पादन किया गया है . हालांकि, ये प्रोटोकॉल CN3/CN4 संस्कृतियों को पैदा करने में सफल नहीं रहे हैं क्योंकि CN3s/CN4s p75NTRव्यक्त नहीं करते हैं, और अन्य विशिष्ट CN3/CN4 मार्कर की पहचान नहीं की गई है । वे भी SMNs से छोटे है और इसलिए, और अधिक आकार के आधार पर अलग करने के लिए मुश्किल है । इसके बजाय, CN3s या CN4s के इन विट्रो अध्ययन ों ने17,18,19,20,21,एक्सप्लांट17,22,23,24,25,26,और स्लाइस27,28 संस्कृतियों पर भरोसा किया है, जो विषम कोशिका प्रकारों से बने हैं, और कोई प्रोटोकॉल के लिए मौजूद नहीं है प्राथमिक CN3s या CN4s के अलगाव और संस्कृति।
यहां, एक प्रोटोकॉल एक ही भ्रूण दिन 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ट्रांसजेनिक चूहों29 (चित्रा 1, चित्रा 2ए)से CN3s, CN4s, और SMNs की कल्पना, अलगाव, शुद्धिकरण और खेती के लिए वर्णित है। आईएसएलएमएन:जीएफपी विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स को एक फर्राटेदार जीएफपी के साथ लेबल करता है जो कोशिका झिल्ली को स्थानीयता देता है। यह प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन रोग में रोग तंत्र को स्पष्ट करने के लिए कई प्रकार के मोटर न्यूरॉन्स की प्रजातियों और आयु-मिलान तुलना को सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐतिहासिक रूप से, CN3 और/या CN4 मोटर न्यूरॉन्स के इन विट्रो अध्ययन ों ने विषम संस्कृतियों जैसे असंतुष्ट17,18,19,20,21,एक्सप्लांट17,22,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम SMN विच्छेदन तकनीकों में निर्देश के लिए ब्रिजित पेटमैन (बायोजेन, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) का शुक्रिया अदा करते हैं; दाना फारबर कैंसर संस्थान फ्लो साइटोमेट्री सुविधा, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल की इम्यूनोलॉजी डिवीजन फ्लो साइटोमेट्री सुविधा, जोस्लिन डायबिटीज सेंटर फ्लो साइटोमेट्री कोर, ब्रिघम और महिला अस्पताल फ्लो साइटोमेट्री कोर, और बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल फ्लो साइटोमेट्री रिसर्च फैसिलिटी प्राइमरी मोटर न्यूरॉन्स के FACS अलगाव के लिए; ए ए Nugent, ए. पी. Tenney, एएस ली, ईएच गुयेन, M.F. गुलाब, अतिरिक्त Engle प्रयोगशाला के सदस्यों, और तकनीकी सहायता और विचारशील चर्चा के लिए परियोजना ALS कंसोर्टियम के सदस्यों । इस अध्ययन को प्रोजेक्ट एएलएस द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अलावा, आरएफ जापान हार्ट फाउंडेशन/बायर Yakuhin अनुसंधान अनुदान विदेशों में और NIH प्रशिक्षण अनुदान आनुवंशिकी T32 GM007748 द्वारा वित्त पोषित किया गया था; जेजे को बोस्टन चिल्ड्रन अस्पताल के माध्यम से और विकासात्मक न्यूरोलॉजी प्रशिक्षण कार्यक्रम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (5T32NS007473-19) द्वारा नेत्र रोगों के आणविक ठिकानों (5T32EY007145-16) में NIH/NEI प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था; M.C.W NEI (5K08EY027850) और बच्चों के अस्पताल नेत्र विज्ञान फाउंडेशन (संकाय डिस्कवरी पुरस्कार) द्वारा समर्थित था; और ईसीई एक हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है ।
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
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