Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques
Summary
Ce travail présente un protocole pour produire des cultures cellulaires homogènes des neurones moteurs oculomoteurs, trochléaires et spinaux primaires. Ces cultures peuvent être utilisées pour des analyses comparatives des caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs oculaires et spinaux.
Abstract
Les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) présentent une résistance remarquable aux maladies dégénératives des neurones moteurs comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) par rapport aux neurones moteurs rachidiens (SMN). La capacité d’isoler et de culture rattacher les CN3, les CN4 et les NSM primaires fournirait une approche des mécanismes d’étude sous-jacents à cette vulnérabilité sélective. À ce jour, la plupart des protocoles utilisent des cultures cellulaires hétérogènes, ce qui peut confondre l’interprétation des résultats expérimentaux. Pour minimiser les problèmes associés aux populations de cellules mixtes, les cultures pures sont indispensables. Ici, le premier protocole décrit en détail comment purifier et cultiver efficacement les CN3/CN4 aux côtés des homologues SMN des mêmes embryons en utilisant le jour embryonnaire 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embryons de souris transgéniques. Le protocole fournit des détails sur la dissection et la dissociation des tissus, l’isolement cellulaire à base de FACS et la culture in vitro de cellules des noyaux CN3/CN4 et SMN. Ce protocole ajoute un nouveau système de culture in vitro CN3/CN4 aux protocoles existants et fournit simultanément une culture SMN pure et équivalente à l’âge pour la comparaison. Des analyses axées sur les caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs sont réalisables dans ce système de culture. Ce protocole permettra de rechercher les mécanismes qui définissent le développement des neurones moteurs, la vulnérabilité sélective et la maladie.
Introduction
La culture des neurones moteurs primaires est un outil puissant qui permet l’étude du développement neuronal, de la fonction et de la susceptibilité aux facteurs de stress exogènes. Les cultures de neurones moteurs sont particulièrement utiles pour l’étude des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA)1,2, dont les mécanismes de la maladie sont incomplètement compris. Fait intéressant, malgré la mort cellulaire significative des neurones moteurs rachidiens (SMN) chez les patients atteints de SLA et les souris modèles de SLA, la mort cellulaire dans les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) sont relativement rares1,3,4,5,6,7,8,9. Par conséquent, des analyses comparatives des cultures pures des CN3/CN4 et des NSM pourraient fournir des indices importants sur les mécanismes sous-jacents à la vulnérabilité relative. Malheureusement, un obstacle majeur à de telles analyses a été l’incapacité de cultiver des cultures purifiées de ces neurones moteurs.
De nombreux protocoles ont été décrits pour la purification des SMN à partir de modèles animaux. La plupart de ces protocoles utilisent la centrifugation de gradient de densité10,11,12 et/ou p75NTR-techniques de panoramique à base de cellules à base d’anticorps13,14,15,16. La centrifugation de gradient de densité exploite la plus grande taille des SMN par rapport à d’autres cellules spinales, tandis que p75NTR est une protéine extracellulaire exprimée exclusivement par des SMN dans la moelle épinière. Près de 100% pure cultures SMN ont été générés par l’un ou les deux de ces protocoles11,12,14. Cependant, ces protocoles n’ont pas réussi à générer des cultures CN3/CN4 parce que les CN3/CN4 n’expriment pas p75NTR, et d’autres marqueurs CN3/CN4 spécifiques n’ont pas été identifiés. Ils sont également plus petits que les NSM et, par conséquent, plus difficiles à isoler en fonction de la taille. Au lieu de cela, les études in vitro de CN3 ou CN4se se sont appuyées sur des cultures dissociées17,18,19,20,21, explanter17,22,23,24,25,26, et tranche27,28 cultures, qui sont composées de types de cellules hétérogènes, et aucun protocole n’a existé pour le l’isolement et la culture des CN3 primaires ou des CN4.
Ici, un protocole est décrit pour la visualisation, l’isolement, la purification et la culture des CN3, des CN4 et des NSM du même jour embryonnaire 11,5 (E11.5) IslMN:GFP souris transgéniques29 (Figure 1, Figure 2A). IslMN:GFP étiquette spécifiquement les neurones moteurs avec un GFP farnédilaté qui se localise à la membrane cellulaire. Ce protocole permet de comparer les espèces et l’âge de plusieurs types de neurones moteurs afin d’élucider les mécanismes pathologiques dans la maladie des neurones moteurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historiquement, les études in vitro des neurones moteurs CN3 et/ou CN4 se sont appuyées sur des cultures hétérogènes telles que les17,18,19,20,21, explanter17,22,23,24,25,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) pour l’enseignement des techniques de dissection SMN; le Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, le Immunology Division Flow Cytometry Facility de la Harvard Medical School, le Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women’s Hospital Flow Cytometry Core, et Boston Children’s Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, d’autres membres du laboratoire Engle et des membres du consortium Project ALS pour une assistance technique et une discussion réfléchie. Cette étude a été appuyée par le projet SLA. En outre, R.F. a été financé par la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad et la subvention de formation des NIH en génétique T32 GM007748; J.J. a reçu l’appui du programme de formation DES NIH/NEI sur les bases moléculaires des maladies oculaires (5T32EY007145-16) par l’entremise du Schepens Eye Research Institute et du Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) par l’hôpital pour enfants de Boston; M.C.W a reçu le soutien de NEI (5K08EY027850) et de la Children’s Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); et E.C.E. est un chercheur de l’Institut médical Howard Hughes.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
