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Neuroscience

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

Published: November 12, 2019
doi:
10.3791/60440
, , , ,
1Department of Neurology,Boston Children’s Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center,Boston Children’s Hospital, 3Department of Neurology,Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program,Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology,Boston Children’s Hospital, 6Department of Ophthalmology,Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology,Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics,Albert Einstein College of Medicine

Summary

이 작품은 1 차적인 oculomotor, trochlear 및 척추 운동 뉴런의 동종 세포 배양을 산출하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 배양은 안구 및 척추 운동 뉴런의 형태학적, 세포적, 분자 적 및 전기 생리학적 특성의 비교 분석에 사용될 수 있다.

Abstract

Oculomotor 뉴런 (CN3s) 및 trochlear 뉴런 (CN4s) 척추 모터 뉴런에 비해 근위축성 측삭 경화증 (ALS)와 같은 퇴행성 운동 뉴런 질환에 현저한 저항을 나타낸다 (SMNs). 기본 마우스 CN3, CN4 및 SM을 격리하고 배양하는 기능은 이 선택적 취약점의 기반이 되는 메커니즘을 연구하는 방법을 제공합니다. 현재까지 대부분의 프로토콜은 이기종 세포 배양을 사용하므로 실험 결과의 해석을 혼동할 수 있습니다. 혼합 세포 집단과 관련된 문제를 최소화하기 위해 순수한 배양이 필수적입니다. 여기서, 제1 프로토콜은 배아일 11.5(E11.5) IslMN:GFP 형질전환 마우스 배아를 사용하여 동일한 배아로부터 의SMN 대응체와 함께 CN3s/CN4를 효율적으로 정화하고 배양하는 방법을 자세히 설명한다. 이 프로토콜은 CN3/CN4 및 SMN 핵으로부터의 조직 해부 및 해리, FACS 기반 세포 분리, 시험관내 배작에 대한 세부 정보를 제공한다. 이 프로토콜은 기존 프로토콜에 새로운 체외 CN3/CN4 배양 시스템을 추가하고 동시에 비교를 위해 순수한 종 및 연령 일치 SMN 배양을 제공한다. 운동 뉴런의 형태학, 세포, 분자 및 전기 생리학적 특성에 초점을 맞춘 분석은 이 문화 시스템에서 가능합니다. 이 프로토콜은 운동 신경 발달, 선택적 취약성 및 질병을 정의하는 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 합니다.

Introduction

1 차적인 운동 신경의 문화는 외인성 스트레스 요인에 신경 발달, 기능 및 감수성의 연구를 가능하게 하는 강력한 공구입니다. 운동 신경 배양은 근위축성 측삭 경화증(ALS)1,2,그의 질병 기전이 불완전하게 이해되는 것과 같은 신경 퇴행성 질환의 연구에 특히 유용하다. 흥미롭게도, ALS 환자와 ALS 모델 마우스 모두에서 척추 운동 뉴런(SMN)의 유의한 세포 사멸에도 불구하고, 오큘러 뉴런(CN3s) 및트로클레어 뉴런(CN4s)에서의 세포 사멸은 상대적으로1,3,4,5,6,7,8,9. 따라서 CN3s/CN4및 SM의 순수 문화어를 비교분석하면 상대적 취약점의 근본적인 메커니즘에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 불행 하 게도, 이러한 분석에 주요 장벽은 이러한 모터 뉴런의 정제 된 문화를 성장 하는 무 능력.

많은 프로토콜은 동물 모델에서 SMN의 정제를 위해 기술되었다. 이러한 프로토콜의 대부분은 밀도 구배 원심 분리10,11,12 및 / 또는 p75NTR-항체 기반 세포 정렬 패닝 기술13,14,15,16을사용합니다. 밀도 구배 원심분리는 다른 척수 세포에 비해 SM의 더 큰 크기를 이용하는 반면, p75NTR은 척수에 있는 SMS에 의해 독점적으로 표현되는 세포외 단백질입니다. 거의 100% 순수 SMN 문화는 이들 프로토콜 들 중 하나 또는 둘 다에 의해 생성되었다11,12,14. 그러나 CN3s/CN4s가 p75NTR을표현하지 않고 다른 특정 CN3/CN4 마커가 확인되지 않았기 때문에 이러한 프로토콜은 CN3/CN4 문화를 생성하는 데 성공하지 못했습니다. 또한 SM보다 작기 때문에 크기에 따라 격리하기가 더 어렵습니다. 대신, CN3s 또는 CN4s의 시험관 내 연구는 해리17,18,19,20,21,17,22, 23,24,25, 슬라이스27,28 배양에 의존했으며, 이질적인 세포 유형으로 구성되며 프로토콜이 존재하지 않았습니다. 기본 CN3 또는 CN4의 격리 및 문화.

여기서, 프로토콜은 동일한 배아일11.5(E11.5) IslMN으로부터 CN3s, CN4s 및 SM의 시각화, 절연, 정제 및 배율에 대해 기재되어 있다:GFP 형질전환 마우스29(도 1, 도 2A). IslMN:GFP는 특히 세포막에 국소화되는 원거리 GFP로 운동 뉴런을 라벨을 지정합니다. 이 프로토콜은 운동 신경 질환의 병리학 적 메커니즘을 밝히기 위해 여러 유형의 운동 뉴런을 종과 연령일치로 비교할 수 있게 합니다.

Protocol

실험실 동물을 이용한 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 1. 해부 전에 시간 지정 짝짓기 설정 운동 뉴런 수확을 위한 태아 배아 마우스를 생성하기 위해, 각 암컷 마우스의 무게를 측정하고 성인 IslMN:GFP 형질전환 마우스 사이의 시간 적 결합을 ?…

Representative Results

이 프로토콜의 목적은 운동 신경 장애의 기본 메커니즘을 비교 분석할 수 있도록 1차 CN3s/CN4및 SMN 을 장기적으로 고도로 정화하고 배양하는 것이었습니다(개요는 그림 1 및 그림 2 참조). 일단 뉴런이 성공적으로 분리되고 배양에서 성장되면, 거의 순수한 1차 CN3/CN4 및 SMN 배양체를 수…

Discussion

역사적으로, CN3 및/또는 CN4 운동 뉴런의 체외 연구는 해리 된17,18,19,20,21,17,22,23,24,25,슬라이스27,<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

브리기테 페트만(미국 매사추세츠 주 바이오젠)에게 SMN 해부기술 에 대한 강의에 감사드립니다. 다나 파버 암 연구소 흐름 세포 측정 시설, 하버드 의과 대학의 면역학 부문 흐름 세포 측정 시설, 조슬린 당뇨병 센터 흐름 세포 분석 코어, 브리검 과 여성의 병원 흐름 세포 측정 코어, 보스턴 어린이 병원 흐름 세포 측정 연구 시설 기본 모터 뉴런의 FACS 격리를위한; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. 로즈, 추가 엥글 연구소 회원 및 프로젝트 ALS 컨소시엄 회원으로 기술 지원 및 사려 깊은 토론을 제공합니다. 이 연구는 프로젝트 ALS에 의해 지원되었다. 또한, R.F.는 일본 심장 재단 / 바이엘 야쿠힌 연구 보조금 해외 및 유전학 T32 GM007748에 NIH 교육 보조금에 의해 지원되었다; J.J.는 Schepens 안과 연구소와 발달 신경학 교육 프로그램 박사 후 펠로우십 (5T32NS007473-19)을 통해 보스턴 아동 병원을 통해 안구 질환의 분자 기지 (5T32EY007145-16)에서 NIH / NEI 교육 프로그램에 의해 지원되었습니다. M.C.W는 NEI (5K08EY027850)와 어린이 병원 안과 재단 (교수 발견 상)에 의해 지원되었다; E.C.E.는 하워드 휴즈 의학 연구소 조사관입니다.

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience – This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon – Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon – Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss – Confocal image of the embryo was captured with these equipments
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References

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).
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