Summary

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Published: November 12, 2019
doi:

Summary

Este trabalho apresenta um protocolo para produzir culturas celulares homogêneas de neurônios motores oculomotores primários, trochlear e espinhais. Essas culturas podem ser usadas para análises comparativas das características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores oculares e espinhais.

Abstract

Neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) apresentam notável resistência a doenças degenerativas do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) quando comparados aos neurônios motores espinhais (SMNs). A capacidade de isolar e cultura cn3s rato primário, CN4s, e SMNs proporcionaria uma abordagem para estudar os mecanismos subjacentes a esta vulnerabilidade seletiva. Até o momento, a maioria dos protocolos utiliza culturas géterogêneas celulares, que podem confundir a interpretação dos resultados experimentais. Para minimizar os problemas associados às populações de células mistas, as culturas puras são indispensáveis. Aqui, o primeiro protocolo descreve em detalhes como purificar e cultivar eficientemente CN3s/CN4s ao lado de contrapartes de SMNs dos mesmos embriões usando o dia embrionário 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embriões transgênicos do rato. O protocolo fornece detalhes sobre a dissecção e dissociação de tecidos, isolamento celular baseado em FACS e cultivo in vitro de células dos núcleos CN3/CN4 e SMN. Este protocolo adiciona um novo sistema de cultura CN3/CN4 in vitro aos protocolos existentes e, simultaneamente, fornece uma cultura SMN pura e de espécies combinadas para comparação. Análises com foco nas características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores são viáveis neste sistema de cultura. Este protocolo permitirá a pesquisa nos mecanismos que definem o desenvolvimento do neurônio motor, a vulnerabilidade seletiva, e a doença.

Introduction

A cultura dos neurônios motores primários é uma ferramenta poderosa que permite o estudo do desenvolvimento neuronal, função e susceptibilidade a estressores exógenos. As culturas dos neurônios motores são particularmente úteis para o estudo de doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1,2,cujos mecanismos de doença são incompletamente compreendidos. Curiosamente, apesar da morte celular significativa de neurônios motores espinhais (SMNs) em pacientes com ELA e camundongos modelo ALS, morte celular em neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) são relativamente escassos1,3,4,5,6,7,8,9. Portanto, análises comparativas de culturas puras de CN3s/CN4s e SMNs poderiam fornecer pistas importantes sobre mecanismos subjacentes à vulnerabilidade relativa. Infelizmente, uma grande barreira para tais análises tem sido a incapacidade de crescer culturas purificadas desses neurônios motores.

Muitos protocolos foram descritos para a purificação de SMNs de modelos animais. A maioria desses protocolos utiliza centrifugação de gradiente de densidade10,11,12 e/ou p75NTR-técnicas de triagem de células baseadas em anticorpos13,14,15,16. A centrifugação do gradiente da densidade explora o tamanho maior de SMNs relativo a outras pilhas espinal, visto que o p75NTR é uma proteína extracellular expressada exclusivamente por SMNs na medula espinal. Quase 100% de culturas smn puras foram geradas por um ou ambos os protocolos11,12,14. No entanto, esses protocolos não têm sido bem-sucedidos na geração de culturas CN3/CN4 porque cn3s/CN4s não expressam p75NTR,e outros marcadores específicos do CN3/CN4 não foram identificados. Eles também são menores do que as SMNs e, portanto, mais difíceis de isolar com base no tamanho. Em vez disso, estudos in vitro de CN3s ou CN4s têm contado com a dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e fatia27,28 culturas, que são compostas de tipos de células heterogêneas, e não existem protocolos para o isolamento e cultura dos CN3primários ou CN4s.

Aqui, um protocolo é descrito para a visualização, isolamento, purificação e cultivo de CN3s, CN4s e SMNs do mesmo dia embrionário 11,5 (E11,5) IslMN:GFP camundongos transgênicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP rotula especificamente os neurônios motores com um GFP farnesylated que localiza a membrana celular. Este protocolo permite a comparação de espécies e idade-combinados de vários tipos de neurônios motores, a fim de elucidar mecanismos patológicos na doença do neurônio motor.

Protocol

Todos os experimentos que utilizam animais de laboratório foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso animal do Boston Children’s Hospital. 1. Criação de acasalamentos cronometrados antes da dissecação Para gerar camundongos embrionários pré-natais para a colheita do neurônio motor, pesar cada rato fêmea e configurar acasalamento cronometrado entre adultos IslMN:…

Representative Results

O objetivo deste protocolo era purificar e cultura altamente tanto cn3s primários / CN4s e SMNs a longo prazo para permitir análises comparativas dos mecanismos subjacentes distúrbios do neurônio motor (ver Figura 1 e Figura 2 para visão geral). Uma vez que os neurônios foram isolados com sucesso e crescidos na cultura, quase puro cn3 primário/cn4 e smn culturas …

Discussion

Historicamente, estudos in vitro de neurônios motores CN3 e/ou CN4 têm contado com culturas heterogêneas como dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26,</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EUA) por instrução em técnicas de dissecação da SMN; O Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, a Immunology Division Flow Cytometry Facility da Harvard Medical School, o Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women’s Hospital Flow Cytometry Core e Boston Children’s Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membros adicionais do laboratório de Engle e membros do consórcio do Projeto ALS para assistência técnica e discussão ponderada. Este estudo foi apoiado pelo Projeto ALS. Além disso, a R.F. foi financiada pela Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant No exterior e pela bolsa de treinamento do NIH Em Genetics T32 GM007748; J.J. foi apoiado pelo programa de treinamento NIH/NEI nas Bases Moleculares de Doenças Oculares (5T32EY007145-16) através do Schepens Eye Research Institute e pelo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) através do Boston Children’s Hospital; M.C.W foi apoiado pela NEI (5K08EY027850) e pela Children’s Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e.C.E. é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss Confocal image of the embryo was captured with these equipments

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).

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