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Cancer Research

मैरिन अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के अल्ट्रासाउंड-गाइडेड ऑर्थोटोपिक इम्प्लांटेशन

Published: November 19, 2019 doi: 10.3791/60497
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Pancreatic Cancer Mouse Hospital, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Abramson Cancer Center, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 4Parker Institute for Cancer Immunotherapy, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

हम मूत्र-व्युत्पन्न अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइनों के अल्ट्रासाउंड निर्देशित प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन सीधे देशी ट्यूमर साइट में करते हैं। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप इंजेक्शन के 2-4 सप्ताह के भीतर अल्ट्रासाउंड स्कैनिंग द्वारा अग्नाशय ट्यूमर का पता लगाया जा सकता है, और सर्जिकल ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण की तुलना में पेरिटोनियल दीवार पर अनुपात ट्यूमर सेल सीडिंग को काफी कम कर दिया गया।

Abstract

मेलानोमा और फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा में प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी की हालिया सफलता ने इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र को प्रेरित किया है और साथ ही वर्तमान उपचार की सीमाओं का पता चला है, क्योंकि अधिकांश रोग इम्यूनोथेरेपी का जवाब नहीं देते हैं। उपन्यास और प्रभावी चिकित्सीय संयोजनों की पहचान करने के लिए सटीक प्रीक्लिनिकल मॉडल का विकास इस अपूरित नैदानिक आवश्यकता को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीए) इम्यूनोथेरेपी का जवाब देने वाले रोगियों के केवल 2% के साथ प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी प्रतिरोधी ट्यूमर का एक विहित उदाहरण है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर KrasG12D +/- Trp53R172H+/- पीडीए का पीडीएक्स-1 क्रे (केपीसी) माउस मॉडल मानव रोग को फिर से तैयार करता है और प्रीक्लिनिकल सेटिंग में इम्यूनोथेरेपी प्रतिरोधी के लिए उपचारों का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, लेकिन ट्यूमर की शुरुआत करने का समय अत्यधिक परिवर्तनीय है। पीडीए के सर्जिकल ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण मॉडल केपीसी ऊतक-विशिष्ट ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) की इम्यूनोबायोलॉजिकल पहचान बनाए रखते हैं लेकिन एक समय-गहन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है और अदुमराह सूजन का परिचय देता है। यहां, हम एक अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण मॉडल (यूजी-ओटीआईएम) का उपयोग करने के लिए गैर-आक्रामक रूप से माउस अग्न्याशय में सीधे केपीसी-व्युत्पन्न पीडीए सेल लाइनों को इंजेक्ट करते हैं। यूजी-ओटिम ट्यूमर एंडोजेनस ऊतक साइट में बढ़ते हैं, पीडीए TME की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को ईमानदारी से संक्षिप्त करते हैं, और पेरिटोनियल दीवार पर न्यूनतम सीडिंग के साथ इंजेक्शन के बाद चार सप्ताह तक प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए नामांकन के आकार के ट्यूमर तक पहुंचते हैं। यहां वर्णित यूजी-ओटिम सिस्टम एक तेजी से और प्रजनन योग्य ट्यूमर मॉडल है जो मूत्र पीडीए TME में उपन्यास चिकित्सीय संयोजनों के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है।

Introduction

अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीए) एक बेहद आक्रामक बीमारी है जो वर्तमान उपचारों के लिए अपवर्तक है, 9%1की निराशाजनक 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ। पीडीए ने हाल ही में स्तन कैंसर को पार कर अमेरिका में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का तीसरा प्रमुख कारण बन गया है और वर्ष २०३०२तक दूसरा प्रमुख कारण (केवल फेफड़ों के कैंसर के पीछे) बनने का अनुमान है । इम्यूनोप्रेसिव मायलॉयड सेल आबादी3,4,5,6,7,घने स्ट्रोमल जमाव8,9,10,11और टी कोशिकाओं की कमी5,12,13-योगदानकी एक संख्या शामिल है । पीडीए14में इम्यूनोथेरपीज की विफलता . इस उद्देश्य के लिए, चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक पशु मॉडल का उपयोग वीवो मेंइम्यूनोलॉजिकल रूप से ठंडे ट्यूमर के लिए उपन्यास दवा संयोजनों की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए एक आवश्यक उपकरण है।

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर KrasG12D +/- Trp53R172H+/- पीडीए के पीडीएक्स-1 क्रे (केपीसी) माउस मॉडल ईमानदारी से मानव पीडीए के प्रमुख नैदानिक पहलुओं को फिर से तैयार करता है, जिसमें रोग के आणविक ड्राइवर और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताएं शामिल हैं15। केपीसी ट्यूमर पूरी तरह से इम्यूनोसक्षम चूहों में अनायास विकसित होते हैं, जिससे नैदानिक परीक्षण सेटिंग में इन दवाओं के प्रशासन से पहले कीमोथेरेपी16,17,इम्यूनोथेरेपी18,19,20,21और स्ट्रोमा-टार्गेटिंग थेरेपी9,11,22वीवो में चिकित्सकीय दृष्टिकोणों से पूछताछ की अनुमति होती है। पीडीए के एक पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में अपनी कई ताकत ों के बावजूद, केपीसी चूहों का उपयोग सहज ट्यूमर विकास की अत्यधिक परिवर्तनीय प्रगति से वंचित है क्योंकि ट्यूमर की शुरुआत 4 से 40 सप्ताह तक हो सकती है (इस प्रकार रखरखाव को एक बड़ी प्रजनन कॉलोनी की आवश्यकता होती है)15। इसके अतिरिक्त, केपीसी चूहों में पॉलीक्लोनल प्राइमरी ट्यूमर23की क्षमता है, और पशु स्वास्थ्य में तेजी से गिरावट आई है और कैक्सिया और एसाइट्स सहित सह-रुग्णताओं में वृद्धि हुई है क्योंकि रोग15की प्रगति करता है।

सहज केपीसी माउस मॉडल का एक विकल्प पीडीए24के ऑर्थोटोपिक इम्प्लांटेशन मॉडल का उपयोग करना है। देशी ऊतक साइट में ट्यूमर सेल लाइनों का प्रत्यक्ष शल्य प्रत्यारोपण पीडीए के ऊतक-विशिष्ट ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) को फिर से तैयार करने का एक अधिक लागत प्रभावी और उम्मीद के मुताबिक तरीका है। ट्यूमर प्रत्यारोपण आनुवंशिक रूप से बैकक्रॉस चूहों5के लिए क्लोनल ट्यूमर सेल लाइनों के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है, अतिरिक्त आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ मेजबान चूहों के लिए अनुमति देता है जो केपीसी माउस मॉडल में नस्ल के लिए समय लेने वाला होगा। हालांकि, अग्नाशय ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिएएक श्रम-गहन शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है जो पेट की दीवार24,25,26में सीवन साइट पर अद्यतित सूजन का परिचय देती है, और अक्सर एक लंबी पोस्ट-ऑपरेटिव वसूली27,28,29शामिल होती है।

कृंतक-विशिष्ट ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में तकनीकी प्रगति वास्तविक समय में उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करती है। पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्शन सुई आंदोलन के अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा निर्देशित, कोई विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को अग्न्याशय में प्रत्यारोपित कर सकता है, सर्जिकल प्रत्यारोपण और संबद्ध सूजन के अभाव में ऑर्थोटोपिक ट्यूमर इंजेक्शन के लाभों का लाभ उठा सकता है। अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण मॉडल (यूजी-ओटीआईएम) को पहले अग्नाशय के कैंसर30 के साथ-साथ ईविंग के सारकोमा, न्यूरोब्लास्टोमा और मूत्राशय कैंसर31, ३२सहित कई अन्य कैंसर मॉडलों में स्थापित किया गया है ।

यहां, हम मूत्र अग्न्याशय में ट्यूमर सेल लाइनों के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम परिणामी ट्यूमर KPC TME के हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोलॉजिकल सुविधाओं को संक्षिप्त दिखाते हैं और इसलिए इम्यूनोथेरपी सहित उपन्यास चिकित्सीय संयोजनों की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, तेजी से स्थानांतरित करने के लिए सबसे आशाजनक उपचार प्रकट करने के लिए नैदानिक परीक्षणों के लिए आगे।

Protocol

पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति के संस्थागत द्वारा अनुमोदित किया गया । महिला 5-से-6 सप्ताह पुराने C57Bl/6 चूहों खरीदा गया (सामग्री की मेजदेखें) और 1-3 सप्ताह के आराम के बाद इस्तेमाल किया । विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु संसाधन पशु देखभाल की देखरेख ।

1. इंजेक्शन के लिए पीडीए ट्यूमर सेल लाइनों की तैयारी

  1. ट्यूमर सेल (टीसी) मीडिया में केपीसी-व्युत्पन्न पीडीए सेल लाइन बढ़ाएं: डुल्बेकको का संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2एम एल-ग्लूटामाइन और 83 μg/mL gentamicin के साथ पूरक है।
  2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर बनाए गए फ्लास्क में 80-85% प्रवाह तक बढ़ने की अनुमति दें।
  3. एक बार कोशिकाएं आदर्श प्रवाह तक पहुंच जाती हैं, तो मीडिया को फ्लास्क से डिडेंट करें और गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ दो बार धोएं, बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस), अनुयायी कोशिकाओं के मोनोलेयर को कवर करने के लिए पर्याप्त है। अंतिम धोने के बाद शेष पीबीएस के पिपेट।
  4. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 0.05% ट्राइप्सिन-EDTA समाधान (0.5% स्टॉक ट्रिप्सिन-EDTA पतला 1:10 में हैंक्स आधारित एंजाइम-मुक्त सेल विसोशन बफर) जोड़ें प्रत्येक फ्लास्क में मोनोलेयर को कवर करने के लिए और 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट या जब तक कोशिकाओं को 3-5 मिनट के लिए अलग नहीं किया जाता है कुप्पी.
  5. ट्रिप्सिनाइजेशन रिएक्शन को रोकने के लिए प्रत्येक फ्लास्क में 10-25mL ठंड (4 डिग्री सेल्सियस), बाँझ टीसी मीडिया जोड़ें। एक 50mL शंकु (एस) में सेल निलंबन डालो, ठंडटीसी मीडिया के साथ 50mL को भरें ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300g पर अपकेंद्रित्र । ठंड, बाँझ डीएमईएम (सीरम-मुक्त) में सुपरनेटेंट और रिसस्पेंड पैलेट को त्यागें। यदि कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कई शंकुट्यूब का उपयोग किया जाता है, तो सभी छर्रों को इस चरण में एक शंकुके लिए जोड़ा जा सकता है।
  7. 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 300g पर अपकेंद्रित्र ।
  8. दो बार चरण 1.6-1.7 दोहराएं। अंतिम धोने में, गिनती के लिए कोशिकाओं का एक बहाना लें। वीवो इंजेक्शन में 90% की सेल व्यवहार्यता की सिफारिश की जाती है।
  9. ट्यूमर कोशिकाओं की वांछित एकाग्रता पर पीडीए ट्यूमर कोशिकाओं का एक समान निलंबन तैयार करें। हमने बाँझ, कोल्ड डीएमईएम या पीबीएस की उचित मात्रा में 10-20 x 106 कोशिकाओं/mL (250,000 से 500,000 कोशिकाओं/25μL) का उपयोग किया, लेकिन प्रत्येक सेल लाइन को वीवो मेंटिटकिया जाना चाहिए ।
  10. कोशिकाओं को ठंडा रखें, बर्फ पर, जब तक इंजेक्शन के लिए तैयार है ।

2. चूहों की पूर्व-शल्य चिकित्सा तैयारी

नोट: इस कदम को प्रक्रिया से 24 घंटे पहले किए जाने की सिफारिश की जाती है।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म सेट पर प्रयोगात्मक चूहों युक्त पिंजरों जगह है ।
  2. नए, साफ पिंजरों प्राप्त करें और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक दूसरे वार्मिंग मंच पर जगह है ।
  3. जैविक सुरक्षा कैबिनेट, इंडक्शन चैंबर और अल्ट्रासाउंड (यूएस) चरण को निष्फल (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ अच्छी तरह से साफ करें।
  4. अमेरिकी मंच के वार्मिंग समारोह को 37 डिग्री सेल्सियस तक घुमाें।
  5. संज्ञाहरण मशीन चालू करें: ट्यूब स्प्लिटर पर डायल को समायोजित करें ताकि एयरफ्लो केवल इंडक्शन चैंबर तक ही सीमित हो। ऑक्सीजन टैंक चालू करें और 1 एल/मिन तक प्रवाह दर के लिए सेट करें। isoflurane वाष्पीकरण को 2-3% तक चालू करें।
  6. इंडक्शन चैंबर में एक ही माउस रखें। माउस की निगरानी करें जब तक कि अब मोबाइल और श्वास धीमी नहीं हो जाती है।
  7. स्प्लिटर पर डायल को समायोजित करें ताकि एयरफ्लो को इंडक्शन चैंबर और नाक शंकु दोनों के लिए अनुमति दी जा सके। जल्दी से प्रेरण कक्ष से माउस ले जाएँ और नाक शंकु में अपने थूथन के साथ गर्म अमेरिकी मंच पर वेंट्रल रीकमबेंसी में रखना।
  8. टो-टू-पिंचिंग के लिए किसी भी सजगता प्रतिक्रिया को देखकर प्रेरण के स्तर का परीक्षण करें। अगर कोई नहीं है तो माउस बालों को हटाने के लिए तैयार है।
  9. ऊतक निर्जलीकरण को रोकने के लिए दोनों आंखों पर थोड़ी मात्रा में आंख ों को स्नेहक (सामग्री की तालिकादेखें) रखें। माउस को चालू करें ताकि यह मंच पर पृष्ठीय पुनर्प्रवाह में दे। धीरे-धीरे पेट के जोखिम को अधिकतम करने और माउस को मंच पर सुरक्षित करने के लिए पेपर टेप के साथ मंच पर ऊपरी और निचले हिस्सों का पालन करें।
  10. पेट के ऊपरी बाएं चतुर्भुज पर उदार परत डिपिलेटरी क्रीम लगाने के लिए बाँझ कॉटन-टिप एप्लीकेटर का उपयोग करें। डिपिलेटरी तिल्ली के सामान्य क्षेत्र में लागू किया जाना चाहिए और मिडलाइन की ओर विस्तार ित किया जाना चाहिए। लगभग एक मिनट तक बैठने की अनुमति दें।
  11. डिपिलेट क्रीम को मिटाने के लिए कॉटन टिप एप्लिकेटर के विपरीत छोर का धीरे-धीरे उपयोग करके बालों को हटाने की डिग्री का परीक्षण करें, एक बार यह आसानी से हटा देता है, पेट को सूखे धुंध पैड से साफ करें। फिर गर्म खारे की एक छोटी राशि के साथ धुंध की एक साफ परत गीला और पूरी तरह से depilatory एजेंट को हटाने के लिए एक बार और क्षेत्र पोंछ। रासायनिक जलने की संभावना को कम करने के लिए माउस त्वचा पर सीधे संपर्क के 2 पूरे मिनट से अधिक न करें।
  12. एक बार जब बालों को पर्याप्त रूप से पेट से हटा दिया गया है, तो माउस को गर्म करने पर एक नया, साफ पिंजरे में वापस करें।
  13. जबकि पहला जानवर अमेरिका के मंच पर बालों को हटाने के दौर से गुजर रहा है, अगले जानवर को इंडक्शन चैंबर में जोड़ा जा सकता है।
  14. चूहों के अगले पिंजरे को एनेस्थेटाइज़ करने से पहले, आइसोफ्लोरीन को बंद कर दें और इंडक्शन चैंबर को ऑक्सीजन से फ्लश करें। इंडक्शन चैंबर और यूएस स्टेज/नाक कोन को निष्फल से साफ करें। सभी पिंजरों और चूहों बाल हटाने से गुजरना नहीं होता तब तक चरण 2.5-2.14 दोहराएं।
    नोट: प्रत्यारोपण से पहले की अवधि के लिए भोजन की अस्थायी वापसी से पशुओं को उपवास करने पर विचार किया जा सकता है, जो पेट और आंतों (12-24 घंटे) में पचाए गए भोजन के कारण पेट के अंगों की दृश्य बाधा को कम करता है। जल प्रतिबंध की सिफारिश नहीं की जाती है। यदि जानवरों को उपवास किया जाता है, तो यह सिफारिश की जाती है कि निर्जलीकरण को रोकने के लिए ट्यूमर इंजेक्शन के बाद 1mL गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के इंजेक्शन के साथ उनका इलाज किया जाता है।

3. पीडीए कोशिकाओं का अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रत्यारोपण

नोट: अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मशीन और सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके सभी अल्ट्रासाउंड प्रक्रियाएं की जाती हैं। ट्रांसड्यूसर में 40 मेगाहर्ट्ज की केंद्र आवृत्ति और 22-55 मेगाहर्ट्ज की बैंडविड्थ है।

  1. अल्ट्रासाउंड मंच को इस तरह समायोजित करें कि प्लेटफ़ॉर्म की सतह फर्श के समानांतर हो और अन्वेषक जानवर के बाईं ओर का सामना करे, जानवर के सिर के साथ दाईं ओर। ट्रांसड्यूसर स्थिति को समायोजित करें ताकि एक ट्रांसवर्स पेट की छवि प्राप्त की जाएगी(चित्र 1ए)।
  2. 2.1-2.8 चरणों में वर्णित माउस को इंजेक्ट करने के लिए एनेस्थेटाइज़ करें। कदम 2.9 में वर्णित अमेरिकी मंच पर माउस को स्थिर करें।
  3. पेट के हेयरलेस सेक्शन में गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) अल्ट्रासाउंड जेल की उदार मात्रा लागू करें।
  4. माउस पेट से संपर्क करने के लिए ट्रांसड्यूसर को धीरे से कम करें। ट्रांसड्यूसर को तब तक समायोजित करें जब तक कि अग्न्याशय स्पष्ट रूप से दिखाई न दे। पेट गुहा का सटीक अभिविन्यास प्रदान करने के लिए बाईं किडनी और तिल्ली का पता लगाएं।
    नोट: क्योंकि ट्रांसड्यूसर स्थिति को पेट के बाईं ओर तक पहुंच की अनुमति देने के लिए बदल दिया गया है, मंच नियंत्रण पर एक्स और वाई धुरी अब उलटा कर रहे हैं ।
  5. ट्यूमर सेल निलंबन के 25μL के साथ एक 29G x 1/2 "इंसुलिन सिरिंज (सामग्री की मेजदेखें) लोड करें । पेट की दीवार में ट्यूमर सेल सीडिंग को कम करने के लिए इंजेक्शन से पहले बाँझ शराब तैयारी पैड के साथ सुई टिप पोंछें।
  6. कुंद-किनारे संदंश का उपयोग करना, वांछित इंजेक्शन साइट पर तनाव बढ़ाने के लिए त्वचा और पेरिटोनियल दीवार को समझें। अल्ट्रासाउंड मंच की सतह पर लगभग 25 डिग्री-45 डिग्री कोण पर सिरिंज को पकड़े हुए, धीरे-धीरे त्वचा और पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से सुई को आगे बढ़ाते हैं। पुष्टि सुई अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से पंचर हो गया है । एक छोटा पॉप महसूस किया जाना चाहिए क्योंकि सुई पेरिटोनियल दीवार को छेदती है।
  7. अल्ट्रासाउंड विज़ुअलाइज़ेशन के तहत, सुई को सीधे अग्न्याशय में गाइड करें(चित्रा 1बी-सी)। पुष्टि सुई धीरे सिरिंज बैरल ऊपर और नीचे चलती द्वारा अग्न्याशय ऊतक के भीतर है । यदि प्लेसमेंट सही है, तो सिरिंज बैरल के चलते हुए सुई टिप अग्न्याशय के ऊतकों के भीतर रहेगी।
  8. धीरे-धीरे ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्ट करें और पुष्टि करें कि कोशिकाओं को अग्न्याशय के भीतर तरल बोलस के गठन से वांछित स्थान में प्रत्यारोपित किया जा रहा है (अल्ट्रासाउंड स्क्रीन पर दिखाई देता है, चित्रा 1डी)।
    नोट: कुछ प्रतिरोध महसूस किया जाना चाहिए, जबकि निराशाजनक प्लंजर । सावधान रहें अग्न्याशय को कई बार छेदन न करें क्योंकि इससे पेट की गुहा में रिसाव की संभावना बढ़ जाती है।
  9. एक बार निलंबन की पूरी मात्रा इंजेक्शन दिया गया है और एक तरल पदार्थ बोलस अग्न्याशय में देखा जा सकता है, सुई बहुत अभी भी कई सेकंड के लिए रखो । धीरे-धीरे माउस पेट से सुई वापस लेना, इंजेक्शन कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए बहुत सावधानी बरतें।
  10. माउस को एक साफ, गर्म पिंजरे में रखें और सुनिश्चित करें कि माउस संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक हो जाए। सभी जानवरों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  11. अगले माउस को एनेस्थेटाइजिंग करने से पहले, इंडक्शन चैंबर और यूएस स्टेज/नाक शंकु को निष्फल के साथ साफ करें।
  12. सभी चूहों को इंजेक्शन दिए जाने तक चरण 3.2-3.11 दोहराएं।

Representative Results

इस रिपोर्ट का लक्ष्य केपीसी-व्युत्पन्न पीडीए सेल लाइनों के अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रत्यारोपण के प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना था । चित्रा 2-4में दिखाए गए प्रतिनिधि प्रयोगों में, हम पुष्टि करते हैं कि यूजी-ओटीआईएम ट्यूमर लगातार दर से और खुराक पर निर्भर तरीके से बढ़ते हैं। इसके अलावा, हम बताते है कि यूजी-OTIM ट्यूमर KPC TME के प्रमुख प्रतिरक्षा और हिस्टोलॉजिकल सुविधाओं को संक्षिप्त । इस प्रकार, यूजी-ओटिम सिस्टम एक प्रीक्लिनिकल पीडीए माउस मॉडल है जिसका उपयोग वीवोमें नए उपचार संयोजनों को तेजी से स्क्रीन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट तरीके से किया जा सकता है।

यहां उल्लिखित यूजी-ओटीआईएम प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, चूहों को प्रत्यारोपण के लिए तैयार किया गया था, गर्म अल्ट्रासाउंड मंच पर सुरक्षित थे और मंच और ट्रांसड्यूसर दोनों की स्थिति को इस प्रक्रिया के लिए समायोजित किया गया था जैसा कि चित्र 1एमें दिखाया गया है। उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड इमेजिंग माउस अग्न्याशय के भीतर एक इंजेक्शन साइट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था जिसे गुर्दे या तिल्ली(चित्रा 1बी)के छिद्र के बिना लक्षित किया जा सकता है। अल्ट्रासोनोग्राफिक विज़ुअलाइज़ेशन के तहत, सुई को ध्यान से पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से पेट गुहा में पेश किया गया था और माउस अग्न्याशय(चित्र ा 1सी)में निर्देशित किया गया था। सुई की सही नियुक्ति स्थापित होने के बाद, ट्यूमर सेल निलंबन को अग्न्याशय में बहुत धीरे-धीरे इंजेक्ट किया गया था। अग्न्याशय के भीतर एक बुलबुले की उपस्थिति(चित्रा 1डी)द्वारा एक सफल प्रत्यारोपण की पुष्टि की गई थी। शुरुआती प्रयोगों में, माउस का बलिदान किया गया था, और प्रक्रिया की प्रभावकारिता को सीधे सकल अग्न्याशय ऊतक(चित्र 1ई)में तरल पदार्थ बोलस की कल्पना करके सत्यापित किया गया था।

साप्ताहिक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा ट्यूमर प्रत्यारोपण और विकास दर की निगरानी की गई। सफल प्रत्यारोपण ट्यूमर है कि प्रयोग के समय भर में अग्न्याशय की सीमाओं के भीतर निहित थे का उत्पादन(चित्र ा 2ए)। अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग ट्यूमर क्षेत्र और मात्रा के लिए प्रत्येक समय बिंदु के साथ-साथ मापा ट्यूमर के 3 डी मानचित्रण के लिए निर्धारित किया जाता है(चित्रा 2बी),और माउस नेक्रॉप्सी(चित्रा 2सी)के समय 3डी छवियों की पुष्टि की गई थी। यूजी-ओटिम प्रक्रिया के दौरान एक अनुचित सेल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप पेरिटोनियल वॉल ट्यूमर (जिसकी एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 2डीमें दिखाई गई है) का विकास हो सकता है। पेरिटोनियल ट्यूमर के साथ मौजूद चूहों को आगे के अध्ययनों से बाहर रखा जा सकता है।

प्रीक्लीनिकल अध्ययनों में उपयोग के लिए इष्टतम कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, एक C57Bl/6 KPC-व्युत्पन्न पीडीए सेल लाइन (४६६२)9 छह स्वतंत्र प्रयोगों में भोले, जंगली प्रकार C57Bl/6 चूहों में इंजेक्शन था । यह सेल लाइन (छह बार विट्रो में मार्गित) आणविक हिस्टोअनुकूली जटिल बेमेल ट्यूमर अस्वीकृति एंटीजन को रोकने के लिए एक पूरी तरह से बैकक्रॉस केपीसी ट्यूमर-असर माउस (>10 पीढ़ियों, एसएनपी-विश्लेषण19द्वारा पुष्टि) से प्राप्त की गई थी। ट्यूमर कोशिकाओं को एक कम टिटर (१.२५ x १०६ कोशिकाओं/25μL) पर और एक उच्च टिटर (5 x १०६ कोशिकाओं/25μL) खुराक पर इंजेक्शन थे । उच्च टिटर ट्यूमर इंजेक्शन कम टिटर पलटन(चित्रा 3ए)की तुलना में इंजेक्शन के तीन सप्ताह बाद ट्यूमर असर जानवरों का एक बड़ा अनुपात में हुई । ट्यूमर की शुरुआत में देरी के बावजूद, समग्र ट्यूमर विकास दर दो खुराक(चित्रा 3बी)के बीच काफी अलग नहीं थी। इसी तरह, जबकि दो साथियों के बीच जीवित रहने की दर काफी अलग नहीं थी, कम टिटर पलटन(चित्रा 3सी)में थोड़ा बेहतर अस्तित्व की ओर डेटा प्रवृत्ति । उच्च टिटर पलटन भी ट्यूमर है कि पूर्व नैदानिक अध्ययन में नामांकित थे के साथ चूहों का एक बड़ा अनुपात का उत्पादन (‧20mm3 ट्यूमर की मात्रा में नामित) चार सप्ताह के बाद कम तीटर पलटन(चित्रा 3डी)से इंजेक्शन । उच्च और निम्न टिटर दोनों से अधिकांश चूहों ने 25 दिन तक नामांकन योग्य ट्यूमर के साथ प्रस्तुत किया और एसाइट्स (डेटा नहीं दिखाया गया) सहित अंतिम चरण के रोग के लक्षण विकसित किए। मेटास्तासेस, जो इस प्रोटोकॉल से सेल खुराक पर 4662 का उपयोग नहीं करते हैं, को विभिन्न सेल लाइनों या खुराक33के साथ मॉडलिंग की जा सकती है।

यूजी-ओटीआईएम विधि को वांछित इंजेक्शन साइट को सही ढंग से स्थानीयकृत करने के लिए ठीक मोटर कौशल की महारत की आवश्यकता थी, जो हमारे शुरुआती प्रयोगों में चुनौतीपूर्ण थी। इस कारण से, हमने एक तालिका शामिल की जो जानवरों की संख्या को दर्शाती है जो अग्न्याशय (सफल प्रत्यारोपण) के भीतर ट्यूमर विकसित करते हैं, जो अल्ट्रासाउंड-गाइडेड ट्यूमर प्रत्यारोपण(तालिका 1)से गुजरे जानवरों की कुल संख्या की तुलना में। जानवरों को भविष्य के विश्लेषणों से समाप्त कर दिया गया था यदि ट्यूमर एक अवांछित स्थान (यानी, गुर्दे) में विकसित हुए हैं या यदि इंजेक्शन के बाद छह सप्ताह तक ट्यूमर का कोई सबूत नहीं था, जैसा कि संकेत दिया गया है। प्रत्येक प्रयोग से नामांकन योग्य अग्नाशय ट्यूमर (20 मिमी3 ट्यूमर की मात्रा) वाले चूहों के अनुपात की साप्ताहिक प्रगति भी तालिका 1में दिखाई गई है।

यह निर्धारित करने के लिए कि पारंपरिक सर्जिकल ऑर्थोटोपिक मॉडल (तकनीक में प्रवीणता प्राप्त करने के बाद समय निवेश से परे) के बजाय यूजी-ओटिम दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए लाभ था, हमने प्रत्येक प्रक्रिया के बाद चूहों की पेरिटोनियल दीवार में पीडीए ट्यूमर की सीडिंग की तुलना की। हमने पाया कि केवल 2/31 चूहों (6.5%) यूजी-ओटिम इंजेक्शन के बाद अनपेक्षित पेरिटोनियल वॉल ट्यूमर विकसित किया गया, जबकि 7/15 चूहों की तुलना में सर्जिकल इंजेक्शन (46.6%, पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0029)(तालिका 1)के बाद पेरिटोनियल वॉल ट्यूमर विकसित किया गया। इस प्रकार, सर्जिकल प्रत्यारोपण की तुलना में यूजी-ओटिम विधि में पेरिटोनम में अतिरिक्त ट्यूमर को बोने की दर बहुत कम हो जाती है।

यूजी-ओटिम ट्यूमर वाले चूहों के बलिदान पर, हमने पाया कि ट्यूमर की सकल शरीर रचना सहज केपीसी ट्यूमर(चित्रा 4ए)के समान थी। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने असामान्य डक्टल संरचनाओं के एक पैटर्न का प्रदर्शन किया जो दोनों मॉडलों में समान था और जो मानव रोग(चित्र4बी)की आकृति विज्ञान को फिर से तैयार करता था। दोनों KPC और यूजी-OTIM ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा घुसपैठ की जांच करने के लिए, प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल नमूनों CD3 के लिए दाग थे (टी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त) और F4/80 (मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त) । दोनों मॉडलों में, धुंधला पैटर्न ट्यूमर है कि खराब टी कोशिकाओं(चित्रा 4सी)द्वारा घुसपैठ कर रहे थे पता चला, लेकिन अत्यधिक मैक्रोफेज(चित्रा 4डी)द्वारा घुसपैठ की । यह निष्कर्ष अधिकांश मानव और केपीसी पीडीए नमूनों 5 ,7,12के इम्यूनोलॉजिकल रूप से ठंडे फेनोटाइप के अनुरूप है ।

Figure 1
चित्रा 1: मूत्र अग्न्याशय में पीडीए कोशिकाओं का अल्ट्रासाउंड निर्देशित प्रत्यारोपण। (क)पेट के अंगों की उच्च-संकल्प छवि प्राप्त करने के लिए माउस, अल्ट्रासाउंड चरण और अल्ट्रासाउंड जांच का अभिविन्यास। माउस पेट के ऊपरी बाएं चतुर्भुज तक आसान पहुंच की अनुमति देने के लिए मानक अभिविन्यास से चरण और मंच को 90 डिग्री कर दिया गया है। (ख)अल्ट्रासोनोग्राफिक छवि जिसमें गुर्दे, तिल्ली और अग्न्याशय की पहचान को दर्शाया गया है। यहां इंजेक्शन की सुई माउस पेट के खिलाफ तैनात है। (ग)माउस अग्न्याशय के भीतर सुई का चित्रण करने वाली अल्ट्रासोनोग्राफिक छवि। (D)अग्न्याशय में ट्यूमर कोशिकाओं के नियंत्रित इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन साइट (नीले रंग में उल्लिखित) पर बुलबुले का चित्रण अल्ट्रासोनोग्राफिक छवि । (ई)अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन के बाद अग्न्याशय में पीडीए कोशिकाओं युक्त द्रव बोलस का खुलासा करने वाला लाप्रोटॉमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: यूजी-ओटिम इंजेक्शन के बाद ट्यूमर विकास की निगरानी। (क)यूजी-ओटिम ट्यूमर (नीले रंग में उल्लिखित) की प्रतिनिधि अल्ट्रासोनोग्राफिक छवि 2, 3, और 5 सप्ताह के बाद इंजेक्शन, के रूप में संकेत दिया । (ख)प्रतिनिधि ने अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर का उपयोग करके यूजी-ओटिम ट्यूमर की 3डी छवि को 5 सप्ताह बाद इंजेक्शन से खंगाला । (ग)प्रतिनिधि यूजी-ओटिम ट्यूमर के सकल शरीर रचना विज्ञान माउस necropsy पर इंजेक्शन के बाद 5 सप्ताह । (D)इंजेक्शन के बाद 7 सप्ताह में अनुचित सेल इंजेक्शन के बाद चमड़े के नीचे की परत में बढ़ रही एक पेरिटोनियल दीवार ट्यूमर की प्रतिनिधि अल्ट्रासोनोग्राफिक छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीडीए कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन के बाद नामांकन योग्य ट्यूमर की खुराक-निर्भर शुरुआत। (ए)इंजेक्शन के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर ट्यूमर असर चूहों का अनुपात के रूप में उच्च titer (५००,००० कोशिकाओं/25μL) या कम titer (१२५,००० कोशिकाओं/25μL) ट्यूमर कोशिकाओं के साथ चित्रा 1 में वर्णित है, के रूप में संकेत दिया । (ख)चूहों के ट्यूमर विकास गतिज(ए),प्रत्येक प्रतीक चूहों के एक समूह का प्रतिनिधित्व करता है, त्रुटि सलाखों से एसईएम(सी)इंजेक्शन के बाद संकेत समय बिंदुओं पर जीवित(ए)से चूहों का अनुपात इंगित करता है । चूहों को इच्छामृत्यु या सेंसर किया गया था यदि ट्यूमर थे >1000mm3 या ट्यूमर comorbidities के कारण शरीर की स्थिति खराब थी । (घ)चूहों के लिए शुरू होने वाले ट्यूमर को नामांकित करने का समय(ए)। एनरोलकरने योग्य ट्यूमर को मात्रा में ‧20mm3 माना जाता है। एन = 8-20 चूहों/प्रयोग के साथ 4 स्वतंत्र प्रयोगों का डेटा प्रतिनिधि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रयोग अग्न्याशय-ट्यूमर असर/कुल इंजेक्शन सप्ताह 1 (नामांकित) सप्ताह 2 (नामांकित) सप्ताह 3 (नामांकित) 4 सप्ताह (नामांकित) वरीयता प्राप्त पेरिटोनियल ट्यूमर
हाई टिटर 24/31 एन डी 8/24 (3/24) 15/24 (7/24) 23/23 (20/23) 2/20
कम टिटर 11/17 एन डी 3/11 (0/11) 6/11 (3/11) 9/11 (5/11) 0/11
सर्जिकल इंजेक्शन 15/17 एन डी एन डी 15/15 (9/15) 15/15 (14/15) 7/15

तालिका 1: शल्य प्रत्यारोपण की तुलना में सफल यूजी-ओटिम ट्यूमर की संख्या। डेटा प्रति प्रयोग एन =5-10 चूहों के साथ प्रति उच्च या निम्न टिटर स्थिति के अनुसार 2-4 स्वतंत्र प्रयोगों से संयुक्त है। "सर्जिकल इंजेक्शन" चूहों को इंगित करता है जिन्हें 125,000 ट्यूमर कोशिकाओं का पेट लेप्रोस्कोपिक सर्जिकल इंजेक्शन प्राप्त हुआ था। "ट्यूमर असर" एक अग्नाशय ट्यूमर के साथ चूहों को इंगित करता है । "एनरोलकरने योग्य" ट्यूमर की मात्रा और gt;20mm3के साथ हर समय बिंदु पर ट्यूमर असर चूहों के अनुपात को इंगित करता है । "वरीयता प्राप्त पेरिटोनियल ट्यूमर" ट्यूमर असर चूहों के कुल अनुपात को इंगित करता है कि ट्यूमर सेल इंजेक्शन से पेरिटोनियल दीवार पर ट्यूमर की सहवर्ती सीडिंग थी । अग्न्याशय (यानी, गुर्दे) के अलावा अन्य ऊतकों में गलत तरीके से पेश ट्यूमर वाले चूहों को "ट्यूमर-असर" आबादी (लेकिन कुल इंजेक्शन चूहों में शामिल) से बाहर रखा गया था। ND, निर्धारित नहीं। उच्च और निम्न टिटर समूहों की तुलना में पेरिटोनियल वॉल सीडिंग की आवृत्ति, जो मान-व्हिटनी पोस्ट-टेस्ट के साथ 2-पूंछ वाले टी टेस्ट के माध्यम से उच्च और निम्न टिटर समूहों बनाम सर्जिकल प्रत्यारोपण, पी एंड एलटी; 0.0029 के माध्यम से संयुक्त है।

Figure 4
चित्रा 4: यूजी-ओटिम ट्यूमर केपीसी ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को संक्षिप्त करें। प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। शीर्ष पंक्ति, केपीसी ट्यूमर। नीचे पंक्ति, यूजी-OTIM ट्यूमर पर 5 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण । (क)नेक्रॉप्सी पर उत्पादित ट्यूमर की सकल शरीर रचना। (B)एच एंड ई (10X, बार =100μm)(C)इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सीडी 3 (ब्राउन) (10X, बार = 100μm) के लिए धुंधला। (D)F4/80 (लाल) और DAPI (नीला) (4X, बार = 500μm) के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हम यहां दिखाते हैं कि ऑटोकॉन्सस ऊतक साइट पर मूत्र पीडीए सेल लाइनों के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासोनोग्राफी का उपयोग केपीसी और सर्जिकल ऑर्थोटोपिक मॉडल सिस्टम दोनों के लिए एक विश्वसनीय विकल्प है। यूजी-ओटीआईएम जैविक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर पैदा करता है जो ट्यूमर-निदान और विश्वसनीय ट्यूमर विकास गतिज के लिए एक छोटा समय-सीमा के साथ पीडीए की इम्यूनोपैथोलॉजिकल विशेषताओं को बनाए रखता है। अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन इसलिए ऑर्थोटोटोपरिक रूप से प्रत्यारोपित पीडीए ट्यूमर वाले चूहों के तेजी से उत्पादन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकता है, जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल में चिकित्सीय संयोजनों की जांच की अनुमति देता है।

अल्ट्रासाउंड निर्देशित प्रत्यारोपण पूर्व नैदानिक जांच के मानक मॉडल पर महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है। सबसे पहले, इस प्रक्रिया को सीधे पूरी तरह से C57BL/6 backcrossed पीडीए कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके सहज ट्यूमर के विकास के लिए केपीसी चूहों की समय गहन निगरानी समाप्त करने में murine अग्न्याशय में । दूसरे, पारंपरिक सर्जिकल ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के समान, यूजी-ओटीआईएम दृष्टिकोण इंजेक्शन कोशिका रेखा पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, जिसमें मोनोक्लोनल ट्यूमर सेल लाइन का चयन और/या सेल लाइन के पूर्व वीवो हेरफेर, साथ ही ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले मेजबान पर नियंत्रण शामिल है । तीसरे, यह न्यूनतम आक्रामक तकनीक जीवित रहने की सर्जरी के दुरूह परिश्रम से बचती है और जानवरों के लिए जटिल पोस्ट-ऑपरेटिव वसूली अवधि के साथ-साथ शल्य चिकित्सा घाव उपचार से भड़काऊ संकेतों को बाईपास करती है। अंत में, यूजी-ओटिम ट्यूमर - सर्जिकल प्रत्यारोपण के समान - कम टी सेल घुसपैठ और उच्च मैक्रोफेज घुसपैठ सहित केपीसी चूहों में मनाए गए टीएमई को फिर से तैयार करें। इस प्रकार, यूजी-ओटीआईएम मॉडल सहज केपीसी मॉडल में चिकित्सीय जांच को मंद करने वाली अतिरिक्त जटिलताओं के बिना केपीसी ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं को बरकरार रखता है।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम तकनीक की सफलता के लिए मास्टर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रक्रिया के लिए मूत्र अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में विशेषज्ञता आवश्यक है, लेकिन अग्न्याशय में कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित करने के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता एक कौशल सेट है जिसे स्वतंत्र रूप से विकसित किया जाना चाहिए। एक 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र पर चूहों के लिए, रात भर जानवरों उपवास सुनिश्चित पेट और आंतों किसी भी अपाच्य भोजन है कि अल्ट्रासाउंड द्वारा अग्न्याशय, गुर्दे और तिल्ली के दृश्य ब्लॉक सकता है की मंजूरी दे दी थी । इसके अतिरिक्त, ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सेल लाइन को विकास गतिज को समझने और मेटास्टैटिक क्षमता33निर्धारित करने के लिए आगे के प्रयोगों से पहले टिटकिया जाना चाहिए। इंजेक्शन के दौरान, इंजेक्शन साइट पर त्वचा को चुटकी देने के लिए संदंश के उपयोग ने त्वचा और पेरिटोनियल दीवार दोनों के माध्यम से धीरे से पंचर करने के लिए आवश्यक तनाव पैदा कर दिया। प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम ध्यान से ऊतक छिद्रित या तिल्ली या गुर्दे के रूप में एक बंद लक्ष्य साइट पंचर बिना अग्न्याशय में सुई गाइड था । एक तरल पदार्थ बोलस की पुष्टि उचित ऊतक में सफल ट्यूमर सेल इंजेक्शन का सबसे अच्छा संकेतक था। इंजेक्शन के बाद सुई को धीरे-धीरे वापस लेना चाहिए ताकि तरल बोलस को परेशान न किया जा सके। हमने पाया कि या तो DMEM या Trypan ब्लू का उपयोग कर परीक्षण इंजेक्शन की एक श्रृंखला के लिए ठीक मोटर इस इंजेक्शन के लिए आवश्यक कौशल की महारत विकसित करने में मदद की ।

इस प्रक्रिया की समस्या निवारण के दौरान, हमने कई कारकों की पहचान की जो प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करते हैं। परीक्षण प्रयोगों में, हमारी सबसे लगातार त्रुटि प्रत्यारोपण के दौरान गुर्दे को छिद्रित कर रही थी, जो हमारे शुरुआती प्रयोगों में अधिक बार हुई, जिससे यह सुझाव मिलता है कि इस कौशल के नियमित व्यायाम से प्रवीणता में सुधार होता है। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि समस्या निवारण चरण के दौरान अल्ट्रासाउंड और सीधे दृश्य दोनों के माध्यम से ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद तरल पदार्थ बोलस की उपस्थिति की पुष्टि सफल इंजेक्शन तकनीक में सुधार हुआ। यदि इंजेक्शन के दौरान अल्ट्रासाउंड द्वारा बुलबुले के गठन की पुष्टि नहीं की जाती है, तो ट्यूमर कोशिकाओं के शेष बोलस को जारी करने के लिए सिरिंज को पूरी तरह से निराशाजनक करने से पहले सुई के स्थान को समायोजित किया जा सकता है। हमने यह भी देखा कि निलंबन की मात्रा बहुत जल्दी इंजेक्शन परिधीय गुहा या अग्न्याशय में तरल पदार्थ बोलस के पतन में ट्यूमर कोशिकाओं के बिखराव के परिणामस्वरूप । आम तौर पर, इन जानवरों को n = 7 जानवरों के अपवाद के साथ अग्नाशय ट्यूमर विकसित करने पर चला गया है कि ट्यूमर का कोई सबूत नहीं दिखाया 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन । यह परिणाम केवल हमारे पहले प्रयास में सूचित किया गया था (और 6/7 जानवरों ट्यूमर कोशिकाओं के एक कम titer के साथ इंजेक्शन थे) । चूहों कि संदिग्ध ट्यूमर सेल इंजेक्शन है, या सुई के repositioning की आवश्यकता है, बारीकी से अग्न्याशय के बाहर ट्यूमर के विकास के लिए नजर रखी जानी चाहिए ।

अल्ट्रासाउंड निर्देशित विधि की सबसे महत्वपूर्ण सीमाएं आवश्यक उपकरणों की उपलब्धता और ट्यूमर प्रत्यारोपण से जुड़े तकनीकी कौशल हैं। प्रक्रिया पूरी तरह से बाँझ नहीं है, क्योंकि माउस को अल्ट्रासाउंड प्लेटफॉर्म पर गैर-बाँझ इंजेक्शन दिया जाता है, जिसमें सिरिंज और सुई टिप अल्ट्रासाउंड जेल से गुजरती है। यद्यपि हमने इन अध्ययनों को शुरू करने के बाद से कुल 8 स्वतंत्र प्रयोगों में एन = 148 चूहों में संक्रमण का कोई सबूत नहीं देखा है, यह संभव है कि एक संक्रामक एजेंट इस प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन सुई के माध्यम से अग्न्याशय में प्रवेश कर सकता है। जैसे, संभव के रूप में प्रोटोकॉल के कई पहलुओं के रूप में (दस्ताने, अल्ट्रासाउंड सतहों, बर्फ बक्से सहित) कीटाणुनाशक या 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए रोगजनकों के लिए संभावित जोखिम को कम करने के लिए। वर्तमान प्रोटोकॉल की एक अतिरिक्त सीमा वर्तमान कमजोर पड़ने पर 4662 सेल लाइन का उपयोग कर मेटाटैसिस की कमी थी। यूजी-ओटिम सिस्टम में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सेल लाइन को वांछित विकास दर के साथ-साथ मेटास्टैटिक क्षमता33के लिए टिट किया जाना चाहिए। अंत में, हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए तकनीकों की स्थापना की । हालांकि, एक बाह्युलर मैट्रिक्स सब्सट्रेट के अलावा संभावित ट्यूमर स्थापना को बढ़ाने और ट्यूमर सेल रिसाव को रोकने के लिए जोड़ा जा सकता है (के रूप में यह शल्य प्रत्यारोपण मॉडल27,30,31,32में प्रयोग किया जाता है) । इस प्रकार, यूयूजी-ओटीआईएम की कई सीमाओं को ऑर्थोटोटोपिक इंजेक्शन में उपयोग की जा रही सेल लाइनों के उचित परीक्षण के साथ दूर किया जा सकता है।

संक्षेप में, यूजी-ओटीआईएम मॉडल मूत्र अग्न्याशय में ट्यूमर कोशिकाओं के ऊतक-निर्देशित इंजेक्शन का एक सटीक तरीका है। यह न्यूनतम आक्रामक प्रत्यारोपण तकनीक प्रक्रिया के समय को कम करके, शल्य चिकित्सा के बाद की जटिलताओं को कम करने और इंजेक्शन की सटीकता में सुधार करके अन्वेषक और जानवरों दोनों को लाभ पहुंचाती है। यूजी-ओटिम इंजेक्शन से उत्पन्न होने वाले ट्यूमर सहज केपीसी ट्यूमर की विशेषता इम्यूनोबायोलॉजिकल विशेषताओं को बनाए रखते हैं, ट्यूमर की शुरुआत के लिए विश्वसनीय समय है, और प्रजनन योग्य ट्यूमर विकास गतिज। इस प्रकार यूजी-ओटीआईएम मॉडल का उपयोग अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट तरीके से किया जा सकता है ताकि सबसे बड़ी अपूरित नैदानिक आवश्यकता वाले रोगियों के लिए उपन्यास उपचार प्रकट करने के लिए प्रीक्लिनिकल सेटिंग में चिकित्सीय संयोजनों से पूछताछ की जा सके।

Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

लेखक डॉ रॉबर्ट Vonderheide और Vonderheide प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, अग्नाशय के कैंसर माउस अस्पताल के सभी सदस्यों, डॉ बेन Stanger, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान केंद्र, और Devora Delman के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते है उपयोगी चर्चाएं। यह काम पार्कर इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर इम्यूनोथेरेपी फेलो अवार्ड (केटीबी) और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय (सीसी) में अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान केंद्र से वित्तपोषण द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Conicals Thomas Scientific 2602A26
Blunt edged forceps Fine Science Tools 11000-12
Cell Dissociation Buffer Thermo-Fisher 13151014
Cotton Tipped swabs Thermo-Fisher 19062614
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" Thermo-Fisher 8881600145
Depilatory Agent Amazon Nair Body Lotion
DMEM Thermo-Fisher 10-566-016
FBS Gemini Bio-oroducts 100-106
Flask Sigma-Aldrich CLS430825
Forceps (blunt edge) Fine Science Tools 11000-12
Gauze Fisher 13-761-52
Gentamicin Thermo-Fisher 15750060
Induction Chamber VetEquip 941444
Isofluorane Penn Vet Supply VED1350
Isofluorane Vaporizer VetEquip 911103
L-glutamine Thermo-Fisher 25030081
Optixcare MidWest Veterinary Supply 052.50310.3
Paper Tape Medline MMM1530Z5
PBS Thermo-Fisher 14-190-250
Slide warmer C&A Scientific XH-2001
Sterilant (Clidox-S) Fisher Scientific NC0332382 (activator) NC9189926 (base) Needs to be combined according to manufacturer's instructions
Sterile Alcohol prep pad Covidien 6818
Trypsin Thermo-Fisher 15090046
Ultrasound gel Thermo-Fisher 03-34-1LT
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 Visual Sonics Vevo 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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कैंसर रिसर्च इश्यू 153 अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा अल्ट्रासाउंड ऑर्थोटोपिक प्रीक्लिनिकल मॉडल
मैरिन अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के अल्ट्रासाउंड-गाइडेड ऑर्थोटोपिक इम्प्लांटेशन
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Hay, C. A., Sor, R., Flowers, A. J., … More

Hay, C. A., Sor, R., Flowers, A. J., Clendenin, C., Byrne, K. T. Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (153), e60497, doi:10.3791/60497 (2019).

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