Summary
Vi beskriver en protokoll for ultralyd veiledet implantation av murine-avledet bukspyttkjertel ductal adenokarsinom cellelinjer direkte inn i den innfødte tumor området. Denne tilnærmingen resulterte i bukspyttkjertelen svulster oppdages av ultralyd skanning innen 2-4 uker av injeksjon, og betydelig redusert andelen tumor celle seeding på bukhulen i forhold til kirurgisk orthotopic implantation.
Abstract
Den nylige suksessen til immun kontrollpunktet blokade i melanom og lunge adenokarsinom har galvanisert feltet Immuno-onkologi samt avdekket begrensningene av dagens behandlinger, som flertallet av pasientene ikke reagerer på immunterapi. Utvikling av nøyaktige prekliniske modeller for raskt å identifisere romanen og effektive terapeutiske kombinasjoner er avgjørende for å løse dette unmet kliniske behovet. Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDA) er et Kanonisk eksempel på en immun kontrollpunkt blokade motstandsdyktig tumor med bare 2% av pasientene som reagerer på immunterapi. Genetisk konstruerte KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 grobunn (KPC) mus modell av PDA viser menneskelig sykdom og er et verdifullt verktøy for å vurdere behandling for immunterapi motstandsdyktig i prekliniske innstillingen, men tid til tumor utbruddet er svært variabel. Kirurgiske orthotopic tumor implantation modeller av PDA opprettholde immunobiologiske kjennetegn ved KPC vev-spesifikke tumor mikromiljøet (TME), men krever en tidkrevende prosedyre og innføre avvikende betennelse. Her bruker vi en ultralyd-guidet orthotopic tumor implantation modell (UG-OTIM) til ikke-invasivt injisere KPC-avledet PDA cellelinjer direkte inn i musen bukspyttkjertelen. UG-OTIM svulster vokser i endogene vevet området, trofast recapitulate histologiske funksjoner i PDA TME, og nå innmelding størrelse svulster for prekliniske studier av fire uker etter injeksjon med minimal seeding på bukhulen veggen. UG-OTIM systemet er beskrevet her er en rask og reproduserbar tumor modell som kan gi mulighet for høy gjennomstrømming analyse av romanen terapeutiske kombinasjoner i murine PDA TME.
Introduction
Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDA) er en notorisk aggressiv sykdom som er ildfast til dagens behandlinger, med en trist 5-års overlevelse på 9%1. PDA nylig overgått brystkreft å bli den tredje ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet i USA og er anslått til å bli den nest største årsaken (bak bare lungekreft) av året 20302. En rekke funksjoner karakteristisk for immunologisk ' kald ' PDA tumor mikromiljøet (TME)-inkludert høy infiltrasjon av immunsuppressiv myelogen celle populasjoner3,4,5,6,7, tette stromal deponering8,9,10,11, og en mangel av T celler5,12,13-bidra til svikt i immunterapi i PDA14. For dette formål er bruken av en klinisk relevant dyremodell et viktig verktøy for å undersøke effekten av romanen legemiddel kombinasjoner for immunologisk kalde svulster in vivo.
Genetisk konstruerte KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 grobunn (KPC) mus modell av PDA trofast viser fremtredende kliniske aspekter av menneskelig PDA, inkludert molekylære drivere av sykdom og histopathological funksjoner15. KPC svulster utvikler seg spontant i fullt immunkompetente mus, noe som åpner for avhør av terapeutiske tilnærminger inkludert kjemoterapi16,17, immunterapi18,19,20,21, og stroma-målretting terapi9,11,22in vivo før administrering av disse stoffene i klinisk utprøving innstillingen. Til tross for sine mange styrker som en prekliniske modell av PDA, er bruken av KPC mus vanskeligstilte av den svært variable progresjon av spontan tumor utvikling som tumor utbruddet kan variere fra 4 til 40 uker (og dermed krever vedlikehold en stor avl koloni)15. I tillegg KPC mus har potensial for polyklonale primære svulster23, og det er en rask nedgang i dyrehelse og økning i Co-morbidities inkludert cachexia og ascites som sykdommen utvikler seg15.
Et alternativ til den spontane KPC muse modellen er å bruke en orthotopic implantat modell av PDA24. Den direkte kirurgisk implantation av tumor cellelinjer i den innfødte vevet nettstedet er en mer kostnadseffektiv og forutsigbar metode for recapitulating av vev-spesifikke tumor mikromiljøet (TME) av PDA. Tumor implantation gjør det mulig for injeksjon av klonal tumor cellelinjer til genetisk backcrossed mus5, slik at for vert mus med ekstra genetiske manipulasjoner som ville være tidkrevende å AVLE på KPC muse modellen. Imidlertid krever bukspyttkjertel svulst en arbeidsintensiv kirurgisk prosedyre som introduserer avvikende betennelse på Sutur stedet i bukveggen24,25,26, og inneholder ofte en lang post-operative utvinning27,28,29.
Teknologiske fremskritt innen ultralyd avbildning ved bruk av gnagere-spesifikke transdusere gir høyoppløselige bilder i sanntid. Guidet av ultralyd avbildning av injeksjonsnålen bevegelse i bukhulen, kan man spesifikt implantat tumorceller inn i bukspyttkjertelen, utnytte fordelene med orthotopic tumor injeksjoner i fravær av kirurgisk implantation og tilhørende betennelse. Denne tilnærmingen, betegnet ultralyd-guidet orthotopic tumor implantation modell (UG-OTIM) har tidligere vært etablert i en xenograft modeller av bukspyttkjertelkreft30 så vel som i flere andre kreft modeller inkludert Ewing ' s sarkom, neuroblastom og blære kreft31,32.
Her gir vi en detaljert protokoll for å utføre ultralyd-guidede injeksjoner av tumor cellelinjer i murine bukspyttkjertel. Vi viser den resulterende svulster recapitulate de histologiske og immunologiske funksjonene i KPC TME og kan derfor brukes til å undersøke romanen terapeutiske kombinasjoner, inkludert immunterapi, å raskt avdekke de mest lovende behandlinger for å flytte frem i kliniske studier.
Protocol
Animal protokoller ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle av Animal Care og use Committee ved University of Pennsylvania. Kvinne 5-til-6-ukers-gamle C57Bl/6 mus ble kjøpt (se tabell over materialer) og brukes etter 1-3 uker hvile. Universitets laboratoriet Animal Resources overså dyr omsorg.
1. utarbeidelse av PDA tumor cellelinjer for injeksjon
- Grow KPC-avledet PDA cellelinje i tumor celle (TC) medier: Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 2mM L-glutamin og 83 μg/mL Gentamicin.
- Tillat at cellene vokser til 80-85% confluency i flasker opprettholdt ved 37 ° c og 5% CO2.
- Når cellene nå ideelle confluency, Dekanter mediene fra kanner og vask to ganger med varmt (37 ° c), steril fosfat-bufret saltvann (PBS), nok til å dekke monolag av tilhenger celler. Pipette av gjenværende PBS etter siste vask.
- Tilsett varm (37 ° c) 0,05% Trypsin-EDTA-løsning (0,5% lager Trypsin-EDTA fortynnet 1:10 i Hanks'-basert enzym fri celle dissosiasjon buffer) for å dekke monolag i hver kolbe og ruge ved 37 ° c i 3-5 minutter eller til cellene løsner med tapping på sidene av Kolbe.
- Tilsett 10-25mL med kaldt (4 ° c), sterilt TC-medium på hver kolbe for å stanse den trypsinization reaksjonen. Hell celle fjæringen i en 50 ml konisk (e), fyll til 50 ml med kaldt TC-medium.
- Sentrifuger på 300g i 5 minutter ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend pellet i kulde, steril DMEM (serum fri). Hvis flere koniske rør ble brukt til å samle celler, kan alle pellets kombineres til en enkelt konisk på dette trinnet.
- Sentrifuger på 300g i 5 minutter ved 4 °.
- Gjenta trinn 1,6-1.7 to ganger. I siste vask, ta en alikvot av celler for telling. Celle levedyktighet på ≥ 90% anbefales for in vivo injeksjoner.
- Forbered en ensartet suspensjon av PDA tumorceller ved ønsket konsentrasjon av tumorceller. Vi brukte 10-20 x 106 celler/mL (250 000 til 500 000 celler/25μL) i riktig mengde steril, kald DMEM eller PBS, men hver cellelinje skal være titrert in vivo.
- Hold cellene kalde, på isen, til klar til å injisere.
2. pre-kirurgisk utarbeidelse av mus
Merk: dette trinnet er anbefalt å bli utført 24 timer før prosedyren.
- Plasser bur som inneholder eksperimentelle mus på et varmere satt til 37 ° c.
- Skaff nye, rene bur og plasser på en annen oppvarmings plattform satt til 37 ° c.
- Rengjør det biologiske sikkerhets kabinettet, innlednings kammeret og ultralyd (US)-scenen grundig med steriliseringsmiddel (se tabell over materialer).
- Drei oppvarmings funksjonen til den amerikanske scenen til 37 ° c.
- Slå på anestesi maskinen: justere ringer på røret splitter slik at luftstrømmen er begrenset til induksjon kammeret bare. Slå på oksygen tanken og sett den til strømningshastighet til 1 L/min. slå på isoflurane fordamper til 2-3%.
- Plasser en enkelt mus inn i induksjon kammeret. Monitor musen til ikke lenger mobil og pust har avtatt.
- Juster hjulene på splitter slik at luftstrømmen er tillatt både induksjon kammer og nesen kjegle. Raskt flytte musen fra induksjon kammer og legge den i ventrale recumbency på den varme amerikanske scenen med sin snute i nesen kjegle.
- Test nivået av induksjon ved å observere eventuelle refleksiv respons på tå knipe. Hvis det er ingen, musen er klar for hårfjerning.
- Plasser en liten mengde øye smøremiddel (se tabell av materialer) på begge øynene for å hindre vev dehydrering. Snu musen slik at den ligger i rygg recumbency på scenen. Forsiktig holder de øvre og Nedre ekstremiteter til scenen med papir tape for å maksimere eksponeringen av magen og feste musen til scenen.
- Bruk en steril bomulls tupp applikator for å påføre et generøst lag riktige krem til øvre venstre kvadrant av buken. Riktige skal påføres i det generelle området av milten og strekker seg mot midtlinjen. Tillat å sitte i ca ett minutt.
- Test graden av hårfjerning ved forsiktig å bruke den motsatte enden av bomulls spissen applikator for å tørke bort riktige krem, når den fjerner lett, tørk magen ren med en tørr gasbind pad. Deretter våte et rent lag med gasbind med en liten mengde varmt saltvann og tørk området igjen for å fjerne riktige agent. Ikke overstige 2 fulle minutter direkte kontakt på musen huden for å redusere sjansen for kjemiske brannskader.
- Når håret er blitt tilstrekkelig fjernet fra magen, returnere musen til en ny, rent bur på varmere.
- Mens det første dyret gjennomgår hårfjerning på den amerikanske scenen, kan neste dyr legges til induksjon kammeret.
- Før anesthetizing neste bur av mus, slå av isoflurane og skyll induksjon kammeret med oksygen. Rengjør induksjon kammeret og US Stage/nese kjegle med steriliseringsmiddel. Gjenta trinn 2,5-2.14 til alle bur og mus har gjennomgått hårfjerning.
Merk: faste dyr ved midlertidig tilbaketrekking av mat i en periode før implantation kan anses å redusere visuell obstruksjon av abdominal organer på grunn av ufordøyd mat i mage og tarm (12-24 timer). Vann begrensning anbefales ikke. Hvis dyr er fastet, anbefales det at de behandles med en injeksjon på 1mL varme (37 ° c), sterilt saltvann etter tumor injeksjon for å unngå dehydrering.
3. ultralyd styrt implantation av PDA-celler
Merk: alle ultralyd prosedyrer utføres ved bruk av ultralyd maskin og programvare (se tabell over materialer). Svingeren har en senter frekvens på 40 MHz og en båndbredde på 22-55 MHz.
- Juster ultralyd plattformen slik at plattformen overflaten er parallelt med gulvet og etterforsker ansikter venstre side av dyret, med dyrets hode til høyre. Juster svinge posisjonen slik at det oppnås et tverrgående abdominal bilde (figur 1a).
- Bedøve musen til å bli injisert som beskrevet i trinn 2.1-2.8. Stabilisere musa på den amerikanske plattformen som beskrevet i trinn 2,9.
- Påfør en sjenerøs mengde varm (37 ° c) ultralyd gel til den barberte delen av magen.
- Senk svingeren forsiktig for å kontakte muse abdomen. Juster svingeren etter behov til bukspyttkjertelen er godt synlig. Finn venstre nyre og milt for å gi en nøyaktig orientering av bukhulen.
Merk: fordi svinger posisjonen er endret for å gi tilgang til venstre side av buken, er X-og Y-aksen på scene kontrollene nå invertert. - Legg en 29G x 1/2 "insulinsprøyte (se tabell over materialer) med 25μL av tumor celle suspensjon. Tørk nålspissen med sterile alkohol prep pad før injeksjon for å minimere tumor celle seeding i bukveggen.
- Ved hjelp av stump-Edge tang, ta tak i huden og bukhulen for å øke spenningen på ønsket injeksjonssted. Hold sprøyten ved omtrent en 25 °-45 ° vinkel til ultralyds plattform overflaten, langsomt før nålen gjennom huden og bukhulen. Kontroller at nålen har punktert gjennom veggen før du går videre til neste trinn. En liten pop bør merkes som nålen gjennomborer den bukhulen veggen.
- Under ultralyd visualisering, guide nålen direkte inn i bukspyttkjertelen (figur 1B-C). Bekreft at nålen er innenfor bukspyttkjertel vevet ved å bevege sprøytesylinderen forsiktig opp og ned. Hvis plasseringen er riktig, vil nålespissen forbli i bukspyttkjertel vevet mens sprøytesylinderen beveger seg.
- Langsomt injisere tumorceller og bekrefte at cellene blir implantert på ønsket sted ved dannelsen av en væske bolus i bukspyttkjertelen (synlig på ultralyd skjermen, figur 1D).
Merk: noen motstand bør merkes mens deprimerende stempelet. Vær forsiktig så du ikke Pierce bukspyttkjertel flere ganger da dette øker sannsynligheten for lekkasje i bukhulen. - Når hele volumet av suspensjon er injisert og en væske bolus kan sees i bukspyttkjertelen, holde nålen veldig stille i flere sekunder. Langsomt trekke nålen fra musen magen, tar stor forsiktighet for ikke å forstyrre injisert celler.
- Plasser musen i et rent, varmt bur og sikre at musen fullt gjenoppretter fra anestesi. Gjentagelse denne forarbeide by all means dyrene.
- Før anesthetizing neste mus, rengjør induksjon kammeret og US Stage/nese kjegle med steriliseringsmiddel.
- Gjenta trinn 3.2-3.11 til alle musene er injisert.
Representative Results
Målet med denne rapporten var å gi en detaljert protokoll for å utføre ultralyd-guidet implantation av KPC-avledet PDA cellelinjer. I den representative eksperimenter vist i figur 2-4, bekrefter vi at UG-OTIM svulster vokse i en konsistent hastighet og i en dose avhengig måte. Videre viser vi at UG-OTIM svulster recapitulate fremtredende immunologiske og histologiske funksjoner i KPC TME. Dermed er UG-OTIM-systemet en prekliniske PDA musemodell som kan brukes i en høy gjennomstrømming måte å raskt skjermen nye behandlings kombinasjoner in vivo.
Ved hjelp av UG-OTIM protokollen skissert her, var musene forberedt for implantation, sikret til den oppvarmede ultralyd plattformen og plasseringen av både plattformen og svingeren ble justert for denne prosedyren som vist i figur 1A. Høy oppløsning Ultralyd Imaging ble brukt til å identifisere et injeksjonssted innenfor musen bukspyttkjertelen som kan være målrettet uten perforering av enten nyre eller milt (figur 1B). Under ultrasonografisk visualisering, nålen ble nøye introdusert til bukhulen gjennom bukveggen og guidet inn i musen bukspyttkjertelen (figur 1C). Etter riktig plassering av nålen ble etablert, tumor celle suspensjonen ble injisert svært langsomt inn i bukspyttkjertelen. En vellykket implantation ble bekreftet av tilstedeværelsen av en boble i bukspyttkjertelen (figur 1D). I tidlige eksperimenter ble musen ofret, og effekten av prosedyren ble verifisert ved direkte visualisering av en væske bolus i brutto bukspyttkjertel vevet (figur 1E).
Tumor implantation og vekst ble overvåket av ukentlige ultralydbehandling. Vellykkede implantat IONS produserte svulster som var inneholdt innenfor grensene til bukspyttkjertelen hele tiden av eksperimentet (figur 2A). Ultralyd programvaren (se tabell over materialer) brukes tillatt for tumor området og volumet som skal fastsettes for hver gang punkt samt for 3D kartlegging av målte svulster som skal genereres (figur 2B), og 3D-bilder ble bekreftet på tidspunktet for musen obduksjon (figur 2C). En uriktig celle injeksjon under UG-OTIM prosedyren kan resultere i utviklingen av en "bukhulen" svulst (et representativt bilde som er vist i figur 2D). Mus som er til stede med bukhulen svulster kan utelukkes fra videre studier.
For å bestemme konsentrasjonen av celler optimal for bruk i prekliniske studier, en C57Bl/6 KPC-avledet PDA cellelinje (4662)9 ble injisert i til naiv, vill-type C57Bl/6 mus over seks uavhengige eksperimenter. Denne cellen linje (passert in vitro seks ganger) ble avledet fra en fullt backcrossed KPC tumor-bærende mus (> 10 generasjoner, bekreftet av SNP-analyse19) for å hindre molekylær histocompatibility komplekse konflikt tumor avvisning antigener. Tumor celler ble injisert ved en lav titer (1,25 x 106 celler/25μL) og ved en høy titer (5 x 106 celler/25μL) dose. Den høye titer tumor injeksjoner resulterte i en større andel av tumor-bærende dyr tre uker etter injeksjoner i forhold til lav titer kohort (Figur 3a). Til tross for forsinkelsen i tumor utbruddet, var den samlede tumor vekstraten ikke signifikant forskjellig mellom de to dosene (Figur 3B). På samme måte, mens overlevelse mellom de to kohorter var ikke signifikant forskjellig, data trenden mot litt bedre overlevelse i den lave titer kohort (Figur 3C). Den høye titer kohort produserte også en større andel av mus med svulster som ble enrollable i prekliniske studier (utpekt til ≥ 20mm3 tumor volum) med fire uker etter injeksjon enn den lave titer kohort (Figur 3D). Flertallet av mus fra både høye og lave titer kohorter presentert med enrollable svulster ved dag 25 og utviklet slutt-stadium sykdom symptomer inkludert ascites (data ikke vist). Metastaser, som ikke forekommer ved hjelp av 4662 ved celle doser fra denne protokollen, kan være modellert med ulike cellelinjer eller doser33.
Den UG-OTIM metoden krevde en beherskelse av fine motoriske ferdigheter til å nøyaktig lokalisere ønsket injeksjonsstedet, som var utfordrende i våre tidligste eksperimenter. Av denne grunn, inkluderte vi en tabell som viser antall dyr som utviklet svulster i bukspyttkjertelen (vellykket implantat IONS) sammenlignet med det totale antall dyr som gjennomgikk ultralyd-guidet tumor implantation (tabell 1). Dyr ble eliminert fra fremtidige analyser hvis svulster utviklet på en uønsket plassering (dvs. nyre) eller om det var ingen tegn til tumor med seks uker etter injeksjon, som indikert. Den ukentlige progresjon av andelen mus peiling enrollable bukspyttkjertel svulster (≥ 20mm3 tumor volum) fra hvert eksperiment er også vist i tabell 1.
For å avgjøre om det var en fordel å bruke UG-OTIM tilnærming i stedet for den tradisjonelle kirurgiske orthotopic modellen (utover tid investering etter å få ferdigheter på teknikken), sammenlignet vi seeding av PDA svulster i bukhulen veggen av mus etter hver prosedyre. Vi fant ut at bare 2/31 mus (6,5%) utviklet utilsiktede vegg svulster etter UG-OTIM injeksjoner, sammenlignet 7/15 mus som utviklet en vegg svulst etter kirurgisk injeksjon (46,6%, p < 0,0029) (tabell 1). Dermed er frekvensen av seeding ekstra svulster i peritoneum sterkt redusert i UG-OTIM metoden i forhold til kirurgisk implantation.
Ved offer av mus bærer UG-OTIM svulster, fant vi ut at brutto anatomi av tumorer var lik spontan KPC svulster (Figur 4A). Histologiske analyse demonstrerte et mønster av unormale ductal strukturer som var lik i begge modeller og som sammenfattet morfologi av den menneskelige sykdommen (Figur 4B). For å undersøke immunforsvaret infiltrere innen både KPC og UG-OTIM svulster, representative histologiske prøvene var farget for CD3 (uttrykt av T-celler) og F4/80 (uttrykt av makrofager). I begge modeller, viste flekker mønstre svulster som var dårlig infiltrere av T-celler (Figur 4C), men svært infiltrere av makrofager (Figur 4D). Denne oppdagelse er forenlig med det immunologisk kulden fenotype av høyst Human og KPC PDA eksemplar5,7,12.
Figur 1: ultralyd styrt implantation av PDA-celler til murine bukspyttkjertel. (A) orientering av mus, ultralyd Stadium, og ultralyd sonde brukes til å få et høyoppløselig bilde av abdominal organer. Merk scenen og plattformen har blitt slått 90 ° fra standard orientering for å gi enkel tilgang til øvre venstre kvadrant av musen magen. (B) ultrasonografisk bilde som viser identifisering av nyre, milt og bukspyttkjertel. Her er injeksjonsnålen plassert mot musen magen. (C) ultrasonografisk bilde som viser nålen i musen bukspyttkjertelen. (D) ultrasonografisk bilde som viser boblen på injeksjonsstedet (skissert i blått) etter kontrollert injeksjon av tumorceller i bukspyttkjertelen. (E) Laparotomy avslører væske bolus som inneholder PDA-celler i bukspyttkjertelen etter ultralyd styrt injeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: overvåke tumor vekst etter UG-OTIM injeksjon. (A) representative ultrasonografisk bilde av UG-OTIM tumor (skissert i blått) ved 2, 3, og 5 uker etter injeksjon, som indikert. (B) representant rekonstruert 3D-bilde av UG-OTIM svulst 5 uker etter injeksjon ved hjelp av ultralyd programvare. (C) representative brutto anatomi av UG-OTIM svulst 5 uker etter injeksjon ved muse obduksjon. (D) representant ultrasonografisk bilde av en bukhulen vegg svulst vokser i subkutan lag etter feil celle injeksjon på 7 uker etter injeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: dose avhengig utbruddet av enrollable svulster etter ultralyd veiledet injeksjon av PDA-celler. (A) andel av tumor-bærende mus på angitte tidspunkt etter injeksjon som beskrevet i figur 1 med høy titer (500 000 celler/25μL) eller lav titer (125 000 celler/25μL) tumorceller, som indikert. (B) tumor vekst Kinetics av mus fra (a), representerer hvert symbol en gruppe av mus, feil linjer indikere SEM. (C) andel av mus fra (a) i live ved angitte tidspunkt etter injeksjon. Mus ble euthanized eller sensurert hvis svulster var > 1000mm3 eller kropp tilstand var dårlig på grunn av tumor komorbiditeter. (D) tid til enrollable tumor utbruddet for mus fra (A). Enrollable svulster anses å være ≥ 20mm3 i volum. Data representant av 4 uavhengige eksperimenter med n = 8-20 mus/eksperiment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperiment | Bukspyttkjertel-tumor peiling/total injeksjoner | Uke 1 (Enrollable) | Uke 2 (Enrollable) | Uke 3 (Enrollable) | Uke 4 (Enrollable) | Seeded bukhulen |
| Høy titer | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| Lav titer | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| Kirurgisk injeksjon | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
Tabell 1: antall vellykkede UG-OTIM-svulster sammenlignet med kirurgisk implantation. Data kombinert fra 2-4 uavhengige eksperimenter per høy eller lav titer tilstand med n = 5-10 mus per eksperiment. "Kirurgisk injeksjon" indikerer mus som fikk abdominal laparoskopisk kirurgisk injeksjon av 125 000 tumorceller. "Tumor-bærende" indikerer mus med en kreft i bukspyttkjertelen. "Enrollable" indikerer andel av tumor-bærende mus på hvert tidspunkt med en tumor volum > 20mm3. "Seeded bukhulen" indikerer den totale andelen av tumor-bærende mus som hadde samtidig seeding svulster på bukhulen veggen fra tumor celle injeksjon. Mus med svulster som presenterer feil i andre vev enn bukspyttkjertelen (dvs. nyre) ble ekskludert fra "tumor-bærende" populasjoner (men inkludert i total injisert mus). ND, ikke bestemt. Hyppighet av veggen seeding sammenligne høy og lav titer grupper kombinert versus kirurgisk implantation, p < 0,0029 via 2-hale T test med mann-Whitney post-test.
Figur 4: UG-OTIM svulster recapitulate den KPC tumor mikromiljøet. Representative bilder vises. Øverste rad, KPC svulster. Nederste rad, UG-OTIM svulster ved 5 uker etter implantation. (A) brutto anatomi av excised svulster ved obduksjon. (B) H & E (10x, bar = 100μm) (C) immunhistokjemi farging for CD3 (brun) (10x, bar = 100μm). (D) Immunofluorescent farging av F4/80 (rød) og DAPI (blå) (4X, bar = 500μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi viser her at bruk av høyoppløselig ultralyd til direkte implantation av murine PDA cellelinjer til autochtonous vevet nettstedet er et pålitelig alternativ til både KPC og kirurgisk orthotopic modellsystemer. UG-OTIM produserer biologisk relevante svulster som beholder immunopathological funksjoner i PDA med en forkortet tidsramme til tumor-diagnose og pålitelig tumor vekst Kinetics. Ultralyd guidet injeksjon kan derfor tjene som et nyttig verktøy for rask produksjon av mus bærende orthotopically implantert PDA svulster, noe som åpner for etterforskning av terapeutiske kombinasjoner i en klinisk relevant modell.
Ultralyd styrt implantation tilbyr viktige forbedringer i forhold til standard modeller av prekliniske etterforskning. For det første eliminerer denne prosedyren den tids intensive overvåkingen av KPC-mus for utvikling av spontane svulster ved direkte implanting fullstendig C57BL/6 backcrossed PDA-celler til murine bukspyttkjertel. Dernest, i likhet med tradisjonelle kirurgiske orthotopic injeksjoner, gir UG-OTIM tilnærming for kontroll over cellelinjen injisert, inkludert valg av en monoklonale tumor cellelinje og/eller ex vivo manipulasjon av cellelinjen, samt kontroll over verten mottar tumor celle implantation. For det tredje, dette minimalt invasiv teknikk unngår vanskelige arbeidskraft overlevelse kirurgi og omgår den kompliserte post-operative utvinning periode for dyrene samt inflammatoriske signaler fra kirurgiske sår healing. Endelig, UG-OTIM svulster-ligner kirurgisk implantation-recapitulate den TME observert i KPC mus, inkludert lav T celle infiltrasjon og høy macrophage infiltrasjon. Således, den UG-OTIM modellen beholder viktige funksjoner i KPC svulster uten ekstra komplikasjoner som sinke terapeutiske undersøkelser i den spontane KPC modellen.
En rekke kritiske trinn i protokollen er nøkkelen til å mestre for suksessen til teknikken. Ekspertise innen murine av ultralyd er viktig for denne prosedyren, men den manuelle fingerferdighet som kreves for å kunne implantat celler i bukspyttkjertelen er et ferdighetssett som må utvikles uavhengig av hverandre. For mus på en 12-timers lys/mørk syklus, Fasting dyrene over natten sikret magen og tarmene ble ryddet av noen ufordøyd mat som kunne blokkere visning av bukspyttkjertelen, nyre og milt ved ultralyd. I tillegg bør hver cellelinje som brukes til orthotopic injeksjon være titrert før ytterligere eksperimenter for å forstå vekst Kinetics og bestemme metastatisk potensial33. Under injeksjon, bruk av Tang for å klype hud på injeksjonsstedet skapte spenningen som trengs for å forsiktig punktering gjennom både hud og bukhulen veggen. Et viktig skritt i prosedyren var å nøye veilede nålen inn i bukspyttkjertelen uten å perforering vevet eller punktering en off-målområde som milt eller nyre. Bekreftelse av en væske bolus var den beste indikatoren på vellykket tumor celle injeksjon i riktig vev. Etter injeksjon skal nålen trekkes langsomt for ikke å forstyrre væske bolus. Vi fant ut at en serie av rettssaken injeksjoner med enten DMEM eller Trypan Blue bidro til å utvikle en beherskelse av den fine motoriske ferdigheter som trengs for denne injeksjon.
Under feilsøking av denne prosedyren, identifiserte vi en rekke faktorer som påvirket suksessen til protokollen. I prøve eksperimenter, var vår hyppigste feil perforering nyrene under implantation, noe som skjedde oftere i våre tidlige eksperimenter tyder på at regelmessig utøvelse av denne ferdigheten forbedrer ferdighet. I tillegg fant vi ut at å bekrefte tilstedeværelsen av en væske bolus etter tumor celle injeksjon via både ultralyd og direkte visualisering på obduksjon under feilsøkings fasen forbedret vellykket injeksjon teknikk. Hvis dannelsen av en boble ikke bekreftes av ultralyd under injeksjonen, kan plasseringen av nålen justeres før den helt nedslående sprøyten for å løsne den gjenværende bolus av tumorceller. Vi observerte også at opphengs volumer injisert for raskt resulterte i søl av tumorceller i bukhulen eller kollaps av væske bolus i bukspyttkjertelen. Generelt, disse dyrene gikk på å utvikle bukspyttkjertelen svulster med unntak av n = 7 dyr som viste ingen tegn til tumor 4 uker etter injeksjon. Dette resultatet ble rapportert bare i våre første forsøk (og 6/7 dyr ble injisert med en lav titer av tumorceller). Mus som har tvilsomme tumor celle injeksjoner, eller krever omplassering av nålen, bør overvåkes nøye for utvikling av svulster utenfor bukspyttkjertelen.
De fremste begrensningene av ultralyd-guidet metode er tilgjengeligheten av de nødvendige instrumentene og tekniske ferdigheter knyttet til tumor implantation. Prosedyren er ikke helt steril, da musen er injisert ikke-sterilely på ultralyd plattformen, med sprøyten og nålespissen passerer gjennom ultralyd gel. Selv om vi ikke har sett noen tegn på infeksjon i n = 148 mus over totalt 8 uavhengige eksperimenter siden oppstart av disse studiene, er det mulig at en smittsom agent kan komme inn i bukspyttkjertelen gjennom injeksjonsnålen under denne prosessen. Som sådan, så mange aspekter av protokollen som mulig (inkludert hansker, ultralyd flater, is bokser) bør sprøytes med desinfeksjonsmiddel eller 70% etanol for å redusere den potensielle eksponeringen for patogener. En ytterligere begrensning av den aktuelle protokollen var mangelen på metastasering ved hjelp av 4662 cellelinjen på gjeldende fortynninger. Hver cellelinje som brukes i UG-OTIM systemet skal være titrert for ønsket vekstrater samt metastatisk potensial33. Til slutt, vår nåværende protokoll etablerte teknikker for sprøytebruk tumorceller i en enkelt celle suspensjon. Men, tillegg av en ekstracellulære matrise substrat kan legges til potensielt forbedre tumor etablering og forebygge tumor celle lekkasje (som det brukes i kirurgiske implantation modeller27,30,31,32). Dermed, mange av begrensningene i UG-OTIM kan overvinnes med riktig testing av cellelinjene som brukes i orthotopic injeksjoner.
Oppsummert er UG-OTIM modellen en presis metode for vev-regissert injeksjon av tumorceller i murine bukspyttkjertelen. Denne minimalt invasive implantat teknikken fordeler både etterforsker og dyrene ved å redusere prosedyren tid, minimere post-kirurgiske komplikasjoner og forbedre nøyaktigheten av injeksjon. Svulster som oppstår fra UG-OTIM injeksjoner beholde den karakteristiske immunobiologiske funksjoner av spontane KPC svulster, har pålitelig tid til tumor utbruddet, og reproduserbar tumor vekst Kinetics. Dermed UG-OTIM modellen kan brukes i en relativt høy gjennomstrømming måte å forhøre terapeutiske kombinasjoner i en prekliniske innstilling for å avdekke romanen behandlinger for pasienter med størst unmet klinisk behov.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Robert Vonderheide og alle medlemmer av Vonderheide laboratoriet, alle medlemmer av kreft i bukspyttkjertelen Mouse Hospital, Dr. Ben stanger, den bukspyttkjertelen Cancer Research Center ved University of Pennsylvania, og Devora Delman for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet er støttet av finansiering fra parker Institute for Cancer immunterapi Fellow Award (KTB) og kreft i bukspyttkjertelen Research Center ved University of Pennsylvania (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
