Summary
लिगन्ड्स के संपर्क में आने का समय उनके विकासात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है। यहाँ हम दिखाने के लिए कैसे एक Drosophila हड्डी morphogenetic प्रोटीन की छवि जारी करने के लिए (BMP) विंग डिस्क की कोशिकाओं से Dpp बुलाया.
Abstract
बहुकोशिकीय जीवों में वयस्क संरचनाओं के प्रारंभिक भ्रूण पैटर्न और विकास के लिए परिवर्तनकारी वृद्धि कारक-बीटा (टीजीएफ-जेड) सुपरफैमिली आवश्यक है। TGF-- superfamily TGF-जेड, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMPs), Activins, विकास और भेदभाव कारक, और नोडल शामिल हैं. यह लंबे समय से ज्ञात किया गया है कि कोशिकाओं को उजागर ligand की मात्रा इसके प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण है. यह सोचा गया था कि लंबी दूरी की एकाग्रता ढाल भ्रूण पैटर्न की स्थापना की. तथापि, हाल ही में यह स्पष्ट हो गया है कि इन लिगंडों के संपर्क में आने का समय उनके डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शनल परिणामों के लिए भी महत्वपूर्ण है। एक TGF - superfamily ligand एक विकासात्मक परिणाम नहीं हो सकता जब तक यह सेल जिसमें यह उत्पादन किया गया था से जारी है. हाल ही में जब तक, यह निर्धारित करने के लिए जब इन ligands कोशिकाओं से जारी किए गए थे मुश्किल था. यहाँ हम दिखा कैसे विंग प्राइमोडियम या विंग डिस्क की कोशिकाओं से Decapentaplegic (Dpp) नामक एक Drosophila बीएमपी की रिहाई को मापने के लिए. इस विधि को अन्य प्रणालियों या संकेतligs के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
अस्थि Morphogenetic प्रोटीन (BMPs) जल्दी भ्रूणजनन और वयस्क संरचनाओं के पैटर्न के लिए आवश्यक हैं. BMPs का उत्पादन कर रहे हैं और प्रतिक्रिया कोशिकाओं में विकास और सेल भेदभाव के लिए आवश्यक लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को प्रभावित करने के लिए स्रावित. Decapentaplegic (Dpp) BMP4 का एक ड्रोसोफिला होमोलॉग है जो भ्रूणीय और वयस्क संरचनाओं जैसे विंग1,2,3,4के विकास के लिए महत्वपूर्ण है . कई समूहों वयस्क मक्खी पंखों पैटर्न में Dpp की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है क्योंकि 1) पंख एक सुसंगत शिराविन्यास पैटर्न है कि आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ दो पारदर्शी एपिथेलिया शीट के शामिल हैं; 2) विंग डिस्क भी काफी फ्लैट हैं, लार्वा के बाहर सुसंस्कृत किया जा सकता है, और छवि के लिए सरल कर रहे हैं और पैटर्न में मतभेद मात्रा; और 3) विंग पैटर्न विकास Dpp के प्रति संवेदनशील है कि रास्ते में छोटे क्षोभ पंख वेशन पैटर्न को प्रभावित करेगा.
डीपीपी का उत्पादन विंग डिस्क5,6,7,8के पूर्ववर्ती/पश् च सीमा में स्थित कोशिकाओं में किया जाता है . Dpp प्रकार 1 के एक जटिल करने के लिए बांधता है और प्रकार 2 serine / threonine kinase रिसेप्टर्स9,10. Dpp बाइंडिंग पर, प्रकार 2 रिसेप्टर फॉस्फोरीलेट प्रकार 1 रिसेप्टर जो फिर Dpp के खिलाफ फॉस्फोरिलेट माताओं (मैड), एक Smad 1/ फॉस्फोरिलेटिड एसएमडी एक अतिरिक्त सह-स्माड (मेडिया) की भर्ती करता है, जो इसे नाभिक में प्रवेश करने में सक्षम बनाता है जहां यह लक्षित जीनों को नियंत्रित करता है, जिससे प्रसार या विभेद न होने जैसे डाउनस्ट्रीम प्रभाव4,11होते हैं।
हाल ही में, बैट्स लैब ने दिखाया है कि विंग डिस्क के भीतर डीपीपी की अनुचित रिहाई से मैड फॉस्फोरिलेशन में कमी, लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति में कमी और पंख पैटर्न दोष12,13हो सकते हैं। अनेक आयन चैनल द्रौपदी पक्ष और संबद्धसंरचनाओंके विकास को प्रभावित करते हैं. इन आयन चैनलों भी Dpp रिलीज में शामिल किया जा सकता है. morphogen रिलीज के तंत्र का निर्धारण करने में, यह महत्वपूर्ण है कि वहाँ एक विधि के लिए रिलीज की घटनाओं कल्पना है.
Drs. Aurelio Teleman और स्टीफन कोहेन एक Dpp-GFP संलयन प्रोटीन जो Dpp के नुकसान को बचाने में सक्षम है बनाया है, जिसका अर्थ है कि यह जैविक रूप से सक्रिय है और एक जैविक रूप से प्रासंगिक तरीके से जारी किया जाता है16. यहाँ, हम वर्णन कैसे हम Dpp रिलीज की घटनाओं इस Dpp-GFP का उपयोग कर कल्पना. यह संलयन प्रोटीन विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि जीएफपी पीएच संवेदनशील है जैसे कि जब यह अम्लीय vesicles में होता है, तो फ्लोरोसेंट17को बुझा दिया जाता है। इसलिए, जब GFP के साथ टैग प्रोटीन अधिक तटस्थ extracellular वातावरण में एक vesicle से जारी है, GFP फ्लोरोसेंट तीव्रता बढ़ जाती है17. हम GFP के पीएच संवेदनशीलता का लाभ उठाया निर्धारित करने के लिए अगर Dpp-GFP अम्लीय vesicles में रहता है. हमने अमोनियम क्लोराइड के अलावा डीपीपी-जीएफपी को व्यक्त करने वाली विंग डिस्क की छवि बनाई है, जो इंट्रासेल्यूलर डिब्बों vesicles18को बेअसर करती है। हमने अमोनियम क्लोराइड के अलावा के बाद पण्डक के फ्लोरेसेंट में उल्लेखनीय वृद्धि पाई, जिससे पता चलता है कि अमोनियम क्लोराइड18के अलावा इंट्रासेल्यूलर डीपीपी-जीपीपी को मज्जित किया जाता है। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि इंट्रासेल्यूलर डीपीपी-जीएफपी अम्लीय झिल्ली से भरे डिब्बों में रहता है, जैसे वेसिकल्स, और इंट्रासेल्यूलर डिब्बों के पीएच को निष्क्रिय करने के लिए अमोनियम क्लोराइड के अलावा18। यह Dpp-GFP के लाइव इमेजिंग एक उपयोगी तकनीक Drosophila विंग डिस्क में Dpp की गतिशीलता कल्पना के रूप में यह extracellular वातावरण में अम्लीय डिब्बों से जारी है बनाता है.
यहाँ, हम विधि हम Dpp रिलीज की घटनाओं Dpp-GFP का उपयोग करने के लिए visualize करने के लिए उपयोग का वर्णन. Dpp-GFP UAS-GAL4 प्रणाली19का उपयोग कर Drosophila विंग डिस्क में अपने मूल पैटर्न में व्यक्त किया जा सकता है. यह Irk चैनल Dpp रिलीज़18को प्रभावित करता है कि यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था जो विधि है। हमने लाइव-इमेजिंग z-स्टैक द्वारा विधि को मान्य किया है. हम Dpp-GFP puncta समय श्रृंखला में ध्यान के विमान के भीतर चलती नहीं देख अगर हम ध्यान के एक विमान में अधिग्रहण कर लिया. हम भी Dpp-GFP puncta के आंदोलन नहीं देख अगर हम एक z-स्टैक में छवि. हम निष्कर्ष है कि Dpp-GFP puncta इस विधि का उपयोग कर देखा घटनाओं के बजाय vesicles intracellularly के आंदोलन जारी कर रहे हैं. Dpp-GFP के लाइव-इमेजिंग की इस विधि संभावित Dpp गतिशीलता पर उनके प्रभाव के लिए Dpp रिलीज के अन्य putative संशोधक परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या अन्य ligands की गतिशीलता को देखने के लिए संशोधित किया जा सकता
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Protocol
1. विच्छेदन के लिए लार्वा उत्पन्न करने के लिए अंडे इकट्ठा करना
- क्रॉस 30-40 कुंवारी महिला Dpp-GAL4/TM6 टीबी हू 10-15 पुरुष Sp/CyO-GFP करने के लिए मक्खियों; UAS-Dpp-GFP/TM6 टीबी हू.
नोट: Dpp-GAL4 और UAS-Dpp-GFP युक्त किसी भी दो जीनोटाइप का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि शेषों में लार्वा मार्कर होते हैं जो लार्वा चरण के दौरान उपयुक्त संतति के चयन के लिए अनुमति देते हैं। - अंडे इकट्ठा करने के लिए, भोजन की एक ताजा शीशी में पार मक्खियों फ्लिप और उन्हें शीशी से हटाने से पहले 3-4 एच के लिए रखना करने के लिए अनुमति देते हैं। अंडे बिछाने को प्रोत्साहित करने के लिए, दानेदार खमीर से बना खमीर पेस्ट की एक छोटी राशि पानी की एक छोटी राशि के साथ मिश्रित भोजन के शीर्ष करने के लिए जोड़ा जा सकता है इससे पहले कि मक्खियों शीशी के लिए पेश कर रहे हैं। पार मक्खियों का एक ही सेट रखा जा सकता है और अंडे संग्रह के 7 दिनों के लिए इस्तेमाल किया.
नोट: किसी भी मानक Drosophila कॉर्नमील खाद्य नुस्खा स्वीकार्य होना चाहिए. यहाँ प्रयुक्त भोजन नुस्खा Hazegh और Reis20द्वारा वर्णित है. - अंडे के संग्रह शीशियों को लगभग 144 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि लार्वा तीसरे इनस्टार (भटक) चरण में न हों।
- विच्छेदन के लिए उपयुक्त लार्वा का चयन करने के लिए (जो दोनों Dpp-GAL4 और UAS-Dpp-GFP व्यक्त) पहले लार्वा है कि गैर-टीबी कर रहे हैं चुनें. ये लार्वा छोटे और वसा के बजाय सामान्य लंबाई होंगे।
- गैर-टीबी लार्वा में साइओ-जीएफपी और डीपीपी-जीएफपी व्यक्त लार्वा होंगे। लार्वा व्यक्त करने वाले Dpp-GFP का चयन करने के लिए, उन्हें फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप के अंतर्गत देखें. जबकि दोनों Dpp-GFP और CyO-GFP व्यक्त लार्वा कुछ GFP फ्लोरोसेंट होगा, Dpp-GFP लार्वा व्यक्त करने में प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि GFP पंख डिस्क के लिए प्रतिबंधित है और फ्लोरोसेंट बहुत कम है CyO-GFP लार्वा व्यक्त की तुलना में उज्ज्वल है. विच्छेदन के लिए इन कम उज्ज्वल लार्वा का चयन करें।
2. Larval इमेजिंग और विच्छेदन के लिए समाधान की तैयारी
- विंग डिस्क के लाइव इमेजिंग के लिए, संशोधित HL3 मीडिया21 (70 एमएम NaCl, 5 एमएम केसीएल, 1.5 एमएम CaCl 2 dyhydrate, 4 एमएम MgCl2, 10 एमएम NaHCO3, 5 एमएम ट्रेहलोस डिहाइड्रेट, 115 एमएम सुक्रोज, 5 एमएम HEPES) तैयार करें। यह मीडिया विंग डिस्क को इमेजिंग21के लिए जीवित रखने की अनुमति देता है .
- पीएच को HEPES का उपयोग करके 7.1 पर समायोजित करें और 0.22 डिग्री सेल्सियस फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें. दोनों विंग डिस्क विच्छेदन के लिए और लाइव इमेजिंग के लिए बढ़ते मीडिया के रूप में इस मीडिया का प्रयोग करें.
3. विंग डिस्क माउंटिंग के लिए स्लाइड की तैयारी
- एक माइक्रोस्कोप स्लाइड भर में बेरंग दो तरफा टेप widthwise के दो टुकड़े प्लेस, उन दोनों के बीच के बारे में 5 मिमी की एक जगह छोड़ने. टेप के टुकड़े काफी लंबे समय तक होना चाहिए कि टेप के सिरों माइक्रोस्कोप स्लाइड के किनारों के साथ फ्लश झूठ.
- टेप को स्लाइड पर मजबूती से दबाने के लिए (जैसे विच्छेदन संदंश की जोड़ी का हैंडल एंड) ताकि कोई भी मीडिया इसके नीचे रिस न सके.
- टेप के दो टुकड़ों के बीच संशोधित HL3 मीडिया के 25 $L रखें. विंग डिस्क टेप के टुकड़ों के बीच मीडिया के इस ड्रॉप में रखा जाएगा ताकि टेप डिस्क को कुचलने से कवरस्लिप को रोकता है (चित्र 1क) .
4. इमेजिंग के लिए विच्छेदन और माउंटिंग विंग डिस्क
- तैयार संशोधित HL3 मीडिया26में लार्वा को नष्ट करें .
- दो जोड़ी संदगों का उपयोग करके आधे में लार्वा को धीरे-धीरे फाड़ें और लार्वा के पीछे के आधे हिस्से को छोड़ दें।
- लार्वा के पूर्वकाल के मध्य को एक जोड़ी बल के साथ पकड़ें और मुंह के हुकों को लार्वा में वापस धकेलने के लिए बंद बलों की एक अन्य जोड़ी का उपयोग करें जब तक लार्वा पूरी तरह से उलटा न हो जाए।
- पंख डिस्क सबसे आसानी से श्वासनली के दो गहरे रंग का प्राथमिक शाखाओं है कि लार्वा के दोनों पक्षों के नीचे चलाने में तेज झुकता के लिए देख कर पाया जा सकता है. पंख डिस्क सीधे एक उल्टे लार्वा में श्वासनली में इन झुकता के नीचे झूठ बोलते हैं।
- धीरे से विंग डिस्क को हटाने और तैयार माइक्रोस्कोप स्लाइड पर HL3 मीडिया के 25 डिग्री एल के लिए उन्हें हस्तांतरण। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि श्वासनली के कोई टुकड़े विच्छेदन विंग डिस्क से जुड़े नहीं रह गए हैं क्योंकि इससे डिस्क तैर सकती है, जिससे इमेजिंग मुश्किल हो सकती है।
- विंग डिस्क को व्यवस्थित करें ताकि विंग पाउच का पेरिपोडायलसाइड पक्ष डिस्क के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड से ऊपर की ओर की ओर की ओर हो (चित्र 1ए,बीदेखें)।
- विंग डिस्क और टेप को कवरस्लिप के साथ कवर करें और नेल पॉलिश का उपयोग करके कवरस्लिप को सील करें। एक बार पॉलिश सूखी है, तुरंत नीचे इमेजिंग कदम के लिए आगे बढ़ना.
5. इमेजिंग Dpp रिलीज
- छवि घुड़सवार विंग डिस्क एक 40x तेल उद्देश्य और 488 एनएम लेजर के साथ एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. Dpp-GFP की एक पट्टी के रूप में दिखाई देना चाहिए GFP फ्लोरोसेंट नीचे विंग डिस्क के केंद्र के साथ Dpp-GFP के छोटे puncta कोशिकाओं के इस केंद्र पट्टी से जारी किया जा रहा है.
- Dpp रिलीज कल्पना करने के लिए 2 मिनट के लिए 2 हर्ट्ज की गति से छवियों को ले लीजिए। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, छवि संग्रह के दौरान अधिक ब्लीचिंग से बचने के लिए Dpp-रिलीजिंग कोशिकाओं की एक स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए बस काफी मजबूत सेटिंग में लेजर सेट करें। छवियों को एक समय श्रृंखला है जो तब AVI फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया जा सकता है के रूप में एकत्र किया जा सकता है (कोई संपीड़न, 3 फ्रेम /
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Representative Results
चित्र 2 इस प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि लाइव-इमेजिंग परिणाम दिखाता है. जब प्रोटोकॉल सफल होता है, Dpp-GFP Dpp-GFP क्षेत्र के भीतर गैर-प्रवाही हलकों के रूप में दिखाई नाभिक के साथ विंग डिस्क के केंद्र के नीचे एक पट्टी के रूप में देखा जा सकता है (चित्र 2). Dpp-GFP रिलीज प्रकट होते हैं और गायब हो जाते हैं कि फ्लोरोसेंट puncta के रूप में दिखाई देता है. हमने देखा है Dpp-GFP फ्लोरोसेंट दिखाई दे रहा है और सेल निकायों में गायब हो और दूर सेल निकायों से. डीपीपी सिगनिंग एक्टिन-आधारित फिलोपोडिया जैसी संरचनाओं पर निर्भर करती है जिसे साइटोनेम कहा जाता है जो कोशिका शरीर22,23से दूर होती है। इसलिए, यह संभावना है कि Dpp-GFP puncta कि दूर Dpp उत्पादन सेल निकायों से इन प्रस्तुत वीडियो में कल्पना कर रहे हैं cytomes में या cytoneme "synapses"15पर होने की संभावना है. ये puncta सबसे स्पष्ट D/V सीमा है, जो Dpp-GFP पट्टी में अंतर के रूप में देखा जा सकता है के करीब हैं.
चित्र 3 एक उपऑप्टिमल परिणाम दिखाता है। यहाँ वर्णित विधि में, पंख डिस्क को माउंट किया जाता है ताकि पेरिपोडायल पक्ष माइक्रोस्कोप स्लाइड से दूर हो सके ताकि डिस्क को पेरिपोडायल पक्ष से छवि दी जा सके (जैसा कि चित्र 1खमें दिखाया गया है)। यदि विंग डिस्क को रिवर्स साइड से छवि दी जाती है, अर्थात, प्रतिपदीय पक्ष माइक्रोस्कोप स्लाइड की ओर, Dpp-GFP फ्लोरोसेंट फोकस से बाहर दिखाई देगा और रिज़ॉल्यूशन खराब होगा, जिसके परिणामस्वरूप चित्र 3में दिखाया गया suboptimal परिणाम होगा। चरण 4.6 इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि विंग डिस्क इस परिणाम से बचने के लिए इमेजिंग से पहले सही अभिविन्यास में फ्लैट झूठ बोल रही है।
चित्र 4 में एक Dpp की छवियों की एक समय श्रृंखला दिखाता है (dpp-GAL4; UAS-GFP) तीसरे इनस्टार लार्वा विंग डिस्क. जब GFP Dpp के लिए जुड़े नहीं है, हम सेल निकायों के बाहर puncta की उपस्थिति का पालन नहीं करते. इस नियंत्रण के निष्कर्ष है कि Dpp-GFP अकेले GFP से अलग व्यवहार के लिए महत्वपूर्ण है.
चित्र 5 एक dpp-GAL4 ड्राइवर अकेले तीसरे instar लार्वा पंख डिस्क के चित्रों की एक समय श्रृंखला से पता चलता है. छवियाँ अन्य नमूनों के सभी के रूप में एक ही माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ लिया गया. Dpp-GFP व्यक्त नहीं है, जब इन छवियों को दिखाते हैं कि फ्लोरोसेंट puncta प्रकट नहीं होते हैं.
चित्र 1: विंग डिस्क बढ़ते सेटअप की मिसाल. छवि Dpp-GFP रिलीज़ करने के लिए, विच्छेदित विंग डिस्क दिखाए गए के रूप में माउंट किया जाना चाहिए। (ए)दो तरफा टेप के दो टुकड़े माइक्रोस्कोप स्लाइड के पार चौड़ाई के साथ पंख डिस्क टेप के बीच संशोधित HL3 मीडिया में घुड़सवार रखा जाता है. (बी) सही ढंग से घुड़सवार विंग डिस्क का साइड व्यू। डिस्क उन्मुख है ताकि विंग पाउच के पेरिपोडायल पक्ष कवरस्लिप की ओर ऊपर की ओर का सामना करे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: विंग डिस्क में Dpp-GFP रिलीज के प्रतिनिधि वीडियो. Dpp-GFP UAS-GAL4 प्रणाली का उपयोग कर विंग डिस्क में व्यक्त किया गया था. यहाँ दिखाया Dpp-GFP रिलीज के लाइव इमेजिंग परिणामों का एक प्रतिनिधि वीडियो है. कोशिका नाभिक को फ्लोरोसेंट में वृत्ताकार अंतराल के रूप में देखा जा सकता है। गुप्त Dpp-GFP उज्ज्वल puncta के रूप में देखा जा सकता है. इसके विपरीत के कारण, इन उज्ज्वल puncta क्षेत्र है कि Dpp उत्पादक सेल निकायों भी शामिल है के बाहर निरीक्षण करने के लिए आसान कर रहे हैं. इस तरह के एक क्षेत्र एक आयत है कि पहले कुछ फ्रेम के बाद गायब हो जाता है द्वारा संकेत दिया है। पंख डिस्क के वेंट्रल और पीछे की दिशाओं तीर द्वारा संकेत दिया जाता है। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.
चित्र 3: Dpp-GFP रिलीज इमेजिंग के Suboptimal परिणाम. एक suboptimal परिणाम है जो तब होता है अगर विंग डिस्क peripodial पक्ष चेहरा नीचे उन्मुख है का उदाहरण. विंग डिस्क पाउच Dpp-GFP के गलत अभिविन्यास के कारण ध्यान में नहीं है, स्पष्ट नाभिक नहीं देखा जा सकता है, और संकल्प गरीब कोई फर्क नहीं पड़ता कि कैसे माइक्रोस्कोप के मापदंडों समायोजित कर रहे हैं रहता है. पंख डिस्क के वेंट्रल और पीछे की दिशाओं तीर द्वारा संकेत दिया जाता है। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.
चित्र 4: विंग डिस्क के Dpp उत्पादक कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि वीडियो. GFP अभिव्यक्ति सेल निकायों में चमकीले प्रकट होता है और परिधि में जारी उज्ज्वल puncta के रूप में प्रकट नहीं होता है. पंख डिस्क के वेंट्रल और पीछे की दिशाओं तीर द्वारा संकेत दिया जाता है। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.
चित्र 5: Dpp-Gal4 तीसरे instar विंग डिस्क के प्रतिनिधि वीडियो Dpp-GFP या GFP की अभिव्यक्ति के बिना. यदि Gal4 GFP या Dpp-GFP की कमी के कारण UAS-GFP या UAS-Dpp-GFP की अभिव्यक्ति ड्राइव नहीं कर सकता, कोई फ्लोरोसेंट मनाया जाता है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.
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Discussion
ऐसे Dpp के रूप में BMPs उनके महत्वपूर्ण प्रभाव बनाने के लिए जब वे झिल्ली बाध्य रिसेप्टर्स के एक जटिल बाँध पड़ोसी या जाहिरा तौर पर दूर की कोशिकाओं में intracellular संकेतन का एक झरना पैदा करने के लिए. डॉ थॉमस Kornberg की प्रयोगशाला से पता चला है कि कोशिकाओं है कि Dpp संकेत संपर्क कोशिकाओं है कि actin आधारित पतली filapodia की तरह संरचनाओं का उपयोग कर संकेत प्राप्त उत्पादन cytonemes15,24,25कहा जाता है. इन आंकड़ों से पता चलता है कि इस संदर्भ में विकासात्मक कोशिका संचार एक तंत्रिका संयुति26के समान हो सकता है। synaptic संचार में, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज की गतिशीलता postsynaptic सेल पर इसके प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसी प्रकार, डीपीपी रिलीज की गतिशीलता भी इसके डाउनस्ट्रीमपरिणामों केलिए महत्वपूर्ण है 12 . इसलिए, यह क्या कारकDpp रिलीज प्रभाव को समझने के लिए विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और शर्तों में Dpp रिलीज की गतिशीलता को मापने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है।
यहाँ हम छवि Dpp रिलीज करने के लिए अनुकूलित विधि प्रस्तुत किया है. हम भी इमेजिंग के लिए विंग डिस्क संस्कृति के लिए कुओं का उपयोग करने की कोशिश की है. एक अच्छी तरह से बहुत गहरी Dpp रिलीज की घटनाओं पर ध्यान केंद्रित कठिनाई में परिणाम कर सकते हैं. इसके अलावा, विंग डिस्क लाइव इमेजिंग के दौरान स्थानांतरित कर सकते हैं, जो विश्लेषण को जटिल बनाता है। डबल पक्षीय टेप कवर पर्ची और स्लाइड के बीच पर्याप्त स्थान विंग डिस्क के कुचल को रोकने के लिए अनुमति देता है, जबकि उचित ध्यान की अनुमति. हमने पाया है कि इमेजिंग से पहले आधे घंटे पर माइक्रोस्कोप मोड़ करने के लिए माइक्रोस्कोप को गर्म करने की अनुमति वीडियो की अवधि पर छवि के बहाव को रोकता है. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ विंग थैली के peripodial पक्ष के साथ विंग डिस्क की नियुक्ति इमेजिंग Dpp रिलीज के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हमने पाया है कि विपरीत अभिविन्यास हमें छवि Dpp रिलीज की घटनाओं के लिए अनुमति नहीं है.
इस विधि Dpp रिलीज के आनुवंशिक संशोधक के लिए देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने देखा है कि आयन चैनल का अवरोध डीपीपी रिलीज12को प्रभावित करता है . अन्य आयन चैनल भी Dpp रिलीज़ गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है। हम यह भी परीक्षण कर सकते हैं कि कैसे teratogens जैसे पर्यावरण की स्थिति Dpp रिलीज के Dpp. संशोधक की रिहाई को प्रभावित आणविक तंत्र है कि ligand स्राव को नियंत्रित करता है प्रकट हो सकता है. रिलीज गतिशीलता कई विभिन्न विकासात्मक संकेतligs के बहाव परिणामों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. हालांकि हम केवल वर्णन किया है कि हम कैसे छवि Dpp रिलीज, ऐसे Hedgehog के रूप में अन्य ligands cytoneme मध्यस्थता संकेतन में मनाया गया है और एक समान तंत्र द्वारा विनियमित किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल के पूर्व संस्करण पर काम करने के लिए डा सरला प्रधान को धन्यवाद देना चाहेंगे। हम इस प्रोटोकॉल विकसित करते समय वित्त पोषण के लिए एनएसएफ-आईओएस 1354282 को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम NIH-NIDCR RO1DE025311 वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Baker's yeast | Red Star | ||
CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
Coverslips | VWR | 484-457 | |
Double-sided tape | Scotch | ||
Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
Light Corn Syrup | Karo | ||
Malt Extract | Breiss | ||
MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
Sucrose | Fisher | S512 | |
Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
Yellow Corn Meal | Quaker | ||
Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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