Summary
Denne protokol beskriver en omfattende hæmorikompatibilitet evaluering af blod-kontakt enheder ved hjælp af laser-cut neurovaskulære implantater. En flow loop model med frisk, heparinized humant blod anvendes til at efterligne blodgennemstrømningen. Efter perfusion analyseres forskellige hæmatologiske markører og sammenlignes med de værdier, der opnås umiddelbart efter blodtapning for hæmorikompatibilitetsevaluering af de testede enheder.
Abstract
Den stigende brug af medicinsk udstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) til midlertidige eller permanente formål, der forbliver i kroppens kredsløbssystem, kræver en pålidelig og multiparametrisk tilgang, der evaluerer de mulige hæmatologiske komplikationer forårsaget af disse anordninger (dvs. aktivering og destruktion af blodkomponenter). Omfattende in vitro hæmogomikompatibilitet test af blod-kontakte implantater er det første skridt i retning af en vellykket in vivo gennemførelse. Derfor er omfattende analyse ifølge Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den præsenterede flow loop beskriver en følsom model til at analysere den hæmostatiske ydeevne af stents (i dette tilfælde, neurovaskulære) og afsløre bivirkninger. Brugen af frisk humant fuldblod og blid blodprøvetagning er afgørende for at undgå præaktivering af blod. Blodet gennembruges gennem en hepariniseret slange, der indeholder prøveemnet, ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en hastighed på 150 ml/min. ved 37 °C i 60 min. Før og efter perfusion, hæmatologiske markører (dvs. antallet af blodlegemer, hæmoglobin, hæmatokrit og plasmatiske markører), der angiver aktivering af leukocytter (polymorfocyon [PMN]-elastase), blodplader (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulationssystemet (thombin-antithrombin III [TAT]) og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Afslutningsvis præsenterer vi en vigtig og pålidelig model for omfattende hæmorikompatibilitetstest af stenter og andre blodkontaktenheder forud for klinisk anvendelse.
Introduction
In vivo-anvendelsen af implantater og biomaterialer, som interagerer med humant blod, kræver intens præklinisk testning med fokus på undersøgelse af forskellige markører for det hæmostatiske system. Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) specificerer de centrale principper for vurdering af blodkontakt (dvs. stents og vaskulære transplantater) og tager hensyn til udstyrets design, kliniske nytteværdi og nødvendige materialer1.
Humant blod er en væske, der indeholder forskellige plasmaproteiner og -celler, herunder leukocytter (hvide blodlegemer [WBCs]), erythrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplader, som udfører komplekse funktioner i den menneskelige krop2. Den direkte kontakt mellem fremmede materialer og blod kan forårsage bivirkninger, såsom aktivering af immunsystemet eller koagulationssystemet, hvilket kan føre til betændelse eller trombotiske komplikationer og alvorlige problemer efter implantation3,4,5. Derfor giver in vitro hæmogomkompatibilitetsvalidering en mulighed før implantation for at opdage og udelukke hematologiske komplikationer , der kan fremkaldes ved blods kontakt med en fremmed overflade6.
Den præsenterede flow loop model blev etableret for at vurdere hæmokompatibilitet af neurovaskulære stents og lignende enheder ved at anvende en strømningshastighed på 150 ml / min i slanger (diameter på 3,2 mm) til at efterligne cerebral flow betingelser og arterie diametre2,7. Ud over behovet for en optimal in vitro-model er blodkilden en vigtig faktor for at opnå pålidelige og uændrede resultater, når man analyserer hæmokompatibilitet af et biomateriale8. Det indsamlede blod skal anvendes umiddelbart efter prøveudtagningen for at forhindre ændringer forårsaget af langvarig opbevaring. Generelt bør der udføres en skånsom tapning af blod uden stase ved hjælp af en 21 G nål for at minimere præaktiveringen af blodplader og koagulationskaskade under blodtegning. Endvidere omfatter donorudelukkelseskriterier dem, der ryger, er gravide, er i dårlig sundhedstilstand eller har taget p-piller eller smertestillende midler i løbet af de foregående 14 dage.
Denne undersøgelse beskriver en in vitro model for den omfattende hæmokompatibilitet test af stent implantater under flow betingelser. Når man sammenligner ubestrøget med fibrin-heparin-belagte stents, resultaterne af den omfattende hæmokompatibilitet test afspejler forbedret hæmokompatibilitet af fibrin-heparin-belagte stents9. I modsætning hertil fremkalder de ubestrøget stents aktivering af koagulationskaskade, som det fremgår af en stigning i thombin-antithrombin III (TAT) koncentrationer og tab af blodpladenumre på grund af vedhæftning af blodplader til stent overflade. Samlet set anbefales det at integrere denne hæm/kompatibilitetsmodel som en præklinisk test for at påvise eventuelle bivirkninger på det hæmostatiske system, der er forårsaget af enheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøvetagningsproceduren blev godkendt af den etiske komité for det medicinske fakultet ved Universitetet i Tuebingen (projektidentifikationskode: 270/2010BO1). Alle emner gav skriftligt, informeret samtykke til optagelse før deltagelse.
1. Forberedelse af Heparin-loaded Monovetter
- Den ufortyndede heparin (5.000 IE/ml) blandes med natriumchlorid (NaCl, 0,9 %) opløsning og fremstille en opløsning med en koncentration på 15 IE/ml heparin.
- 900 μL af den fortyndede heparinopløsning tilsættes til hver neutral monovette (9 ml) for at opnå en endelig heparinkoncentration på 1,5 IE/ml efter blodprøvetagning. Der fremstilles tre monovetter pr. donor plus tre reservemonovetter, og de heparinbelastede monovetter opbevares ved 4 °C indtil blodprøvetagningen.
2. Blodprøvetagning af blod
- Tag de heparinbelastede monovetter ud af køleskabet 30 minutter før blodprøvetagning.
- Der opsamles en blodprøve på 27 ml fra hver sund donor (n = 5) ved venipunktur for flowløkken. Påfør kun en glat årepresse for at undgå for tidlig aktivering af blodpladerne og blodet størkning kaskade.
- Blodprøver opsamles i tre monovetter indeholdende 900 μL heparinopløsning (1,5 IE/ml) og samles i alle tre monovetter i én plastbeholder for at sikre, at alle komponenter er jævnt fordelt.
- Direkte overføre det samlede hepariniserede blod til tre forskellige monovetter, der indeholder enten EDTA (1,2 ml), citrat (1,4 ml), eller en blanding af citrat, theophyllin, adenosin og dipyridamole (CTAD, 2,7 ml) til at indsamle baseline værdier. Fortsæt med prøverne som beskrevet i afsnit 5−8.
BEMÆRK: For at sikre upåvirket koagulationsadfærd bør donorer undgå indtagelse af hæmostase-påvirker narkotika (f.eks acetylsalicylsyre, naproxen, og carbenicillin) inden for de sidste 14 dage, samt p-piller og rygning.
3. Forberedelse af flowløkken
- Skær tre heparinbelagte polyvinylchloridrør med en længde på 75 cm og en indvendig diameter på 3,2 mm. Læg rørene med de neurovaskulære laserskårne implantater med eller uden fibrin-heparin-belægningen. Husk at lade et badekar losse som en kontrol.
- Placer den ene ende af røret i et reservoir fyldt med 0,9% NaCl, tilslut slangen til pumpehovedet, og sæt den anden ende ind i en målecylinder.
- Indstillingerne for den peristaltiske pumpe justeres for at opnå en strømningshastighed på 150 ml/min ved hjælp af en timer, mens fyldeniveauet i måleglasset kontrolleres.
4. Udførelse af hæmogomtest
- Brug en 12 ml sprøjte til at fylde rørene med blod. 6 ml blod tilførslen uden problemer til hvert rør, der indeholder en prøve eller ikke-læsset kontrol.
- Form et kredsløb og luk rørene tæt ved hjælp af en 0,5 cm længde silikone tilslutning slange. Rørene anbringes i et vandbad på 37 °C og perfusion ende i 60 min.
5. Fuldblodstællinganalyse
- Der anbringes 1,2 ml blod efter prøveudtagning (baseline) eller efter perfusion i en monovette, der indeholder EDTA, og røret forsigtigt omdannes 5x.
- Sæt monovetten ind i blodanalysatoren, og udfør en blodtællingsanalyse for hver prøve. Derefter inkuberes monovetterne på is i 15-60 minutter efter blodtællingsmålingen til yderligere analyse, som beskrevet i afsnit 7.
6. Indsamling af citratplasma
- Der fyldes de monovetter, der indeholder citrat med 1,4 ml blod (frisktegnet eller efter omsætning), og der vendes forsigtigt 5x.
- Rørene centrifugeres i 18 minutter ved 1.800 x g ved stuetemperatur (RT). Aliquot tre 250 μL prøver af plasmafraktionen i 1,5 ml reaktionsrør og fryse plasmaprøverne i flydende nitrogen. Opbevar dem ved -20 °C indtil analyse.
7. Indsamling af EDTA Plasma
- Inkuber emonovetterne på is i 15-60 minutter efter målingen af blodtælling. Derefter centrifugeres rørene i 20 min ved 2.500 x g og 4 °C.
- Aliquot tre 250 μL prøver af plasmafraktionen i 1,5 ml reaktionsrør efter centrifugering og fryse rørene i flydende nitrogen. Opbevar dem ved -80 °C indtil analyse.
8. Indsamling af CTAD Plasma
- Der fyldes de monovetter, der indeholder CTAD-blandingen, med 2,7 ml blod (frisktegnet eller efter inkubation) og inverter forsigtigt 5x. Derefter inkuberes monovetterne på is i 15-60 min. Derefter centrifugeres rørene i 20 min ved 2.500 x g og 4 °C.
- 700 μL af den midterste plasmafraktion overføres til et 1,5 ml reaktionsrør, og de fyldte reaktionsrør centrifugeres i 20 min ved 2.500 x g og 4 °C.
- Aliquot to 100 μL prøver af den midterste fraktion i 1,5 ml reaktionsrør efter centrifugering og fryse rørene i flydende nitrogen. Opbevar dem ved -20 °C indtil analyse.
BEMÆRK: Samlingen af EDTA plasma og CTAD plasma kan udføres sammen, fordi driftsbetingelserne er de samme.
9. Måling af humantat fra citratplasma
- Tø citratplasmaet op atter i et vandbad på 37 °C.
- Brug det TAT enzymforbundne Immunosorbent-analysesæt (ELISA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Plasmastandarder og kontrol og fortynd vaskeopløsningen, anti-human-TAT peroxidase (POD)-konjugeret antistof og kromogenopløsning. Lad alle reagenser og mikrotiterpladen stå på RT (15−25 °C) i 30 minutter, før testen påbegyndes.
- 50 μL af prøvebufferen i hver brønd af mikrotiterpladen og tilsættes 50 μL prøvebuffer (tom), plasmastandard, plasmakontrol og ufortyndet plasmaprøve i dubletter til brøndpladen. Pladen forsegles og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter med skånsom omrystning. Derefter vaskes pladen 3x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 100 μL af det POD-konjugerede anti-human-TAT-antistof til hver brønd. Pladen forsegles og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter med skånsom omrystning. Derefter vaskes pladen 3x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 100 μL af den frisklavede kromogenopløsning til hver brønd. Forsegl pladen og inkuber på RT i 30 min.
- Fjern tætningsfilmen, og der tilsættes 100 μL stopopløsning til hver brønd. Læs den optiske massefylde (OD) med et fotometer ved 490−500 nm. Sæt standardkurvedataene på plads som en tendenslinje, og beregn koncentrationen af prøverne.
10. Måling af PMN-elastase fra Citrate Plasma
- Tø citratplasmaet op i et vandbad ved 37 °C.
- Brug eLISA-sættet polymorfonuklear (PMN)-elastase i henhold til producentens anvisninger: Rekonstruere PMN-elastase-styringen og PMN-elastase-standarden til at forberede en standardkurve ved hjælp af sættets fortyndingsbuffer.
- Vaskopløsningen fortyndes i henhold til producentens beskrivelse. Lad alle reagenser og mikrotiterpladen stå på RT i 30 minutter, før testen påbegyndes. Citratplasmaprøverne fortyndes til 1:100 med fortyndingsbufferen.
- Der tilsættes 100 μL af prøvebufferen (blindprøve), PMN-elastase-standardkurven (15,6−1.000 ng/ ml), PMN-elastasekontroller (høje og lave koncentrationer) og fortyndede plasmaprøver i dubletter til brøndpladen. Forsegl pladen og inkuber ved RT i 60 min med blidt omrystning. Derefter vaskes pladen 4x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 150 μL af det enzymkonjugerede antistof til hver brønd. Forsegl pladen og inkuber ved RT i 60 min med blidt omrystning. Derefter vaskes pladen 4x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 200 μL af 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB)-substratopløsningen til hver brønd. Forsegl pladen og inkuber på RT i 20 min i mørke. Fjern derefter tætningsfilmen og tilsæt 50 μL af stopopløsningen til hver brønd.
- Aflæs OD med et fotometer ved 450 nm med en referenceaflæsning ved 630 nm. Sæt standardkurvedataene på plads som en tendenslinje, og beregn koncentrationen af prøverne.
11. Måling af terminalkomplementkompleks (TCC) fra EDTA-plasma
- Tø EDTA-plasmaet op i et vandbad ved 37 °C, og opbevares på is efter optøning.
- Brug komplementkaskadet SC5b-9 ELISA-kit i henhold til producentens anvisninger: Vaskopløsningen som beskrevet i producentens protokol. Lad alle reagenser og mikrotiterpladen stå på RT i 30 minutter, før testen påbegyndes. EDTA-plasmaprøverne fortyndes til 1:10 med sættets fortyndingsbuffer.
- Der tilsættes 300 μL vaskeopløsning til hver brønd for at rehydrere overfladen og aspirere efter 2 min. Der tilsættes 100 μL prøvebuffer (blindprøve), SC5b-9-standarder, SC5b-9-kontroller (høje og lave koncentrationer) og de fortyndede plasmaprøver i dubletter til brøndpladen.
- Forsegl pladen og inkuber på RT i 60 min. Derefter vaskes pladen 5x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 50 μL af det enzymkonjugerede antistof til hver brønd. Forsegl pladen og inkuber på RT i 30 min. Derefter vaskes pladen 5x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 100 μL af TMB-substratopløsningen til hver brønd. Forsegl pladen og inkuber på RT i 15 min i mørke.
- Fjern tætningsfilmen, og der tilsættes 100 μL stopopløsning til hver brønd. Læs OD med et fotometer på 450 nm. Sæt standardkurvedataene på plads som en tendenslinje, og beregn koncentrationen af prøverne.
12. Måling af β-tromboglobulin fra CTAD Plasma
- Tø CTAD-plasmaet op i et vandbad ved 37 °C.
- Brug eLISA-sættet β-thromboglobulin (β-TG) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger: reparer β-TG-kontrollen og β-TG-standarden, og vaskeopløsningen fortyndes ved hjælp af destilleret H2O. Rekonstrueredet POD-konjugerede antistof ved hjælp af den medfølgende fosfatbuffer. Lad alle reagenser og mikrotiterpladen stå på RT i 30 minutter, før testen påbegyndes.
- Standardkurven og styringen klargør i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger med den medfølgende fosfatbuffer. CTAD-plasmaprøverne fortyndes til 1:21.
- Der tilsættes 200 μL fosfatbuffer (blindprøve), β-TG-standarder, β-TG-kontroller (høje og lave koncentrationer) og fortyndede plasmaprøver i dubletter til brøndpladen. Pladen forsegles og inkuberes ved RT i 60 min. Derefter vaskes pladen 5x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 200 μL af det enzymkonjugerede antistof til hver brønd. Pladen forsegles og inkuberes ved RT i 60 min. Derefter vaskes pladen 5x med 300 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 200 μL af TMB-substratopløsningen til hver brønd. Forsegl pladen og inkuber på RT i 5 min i mørke. Fjern tætningsfilmen, og sluk reaktionen ved at tilsætte 50 μL 1 M svovlsyre (H2SO4) til hver brønd.
- Lad pladen ligge i 15−60 min. og aflæs derefter OD'en med et fotometer ved 450 nm. Sæt standardkurvedataene på plads som en tendenslinje, og beregn koncentrationen af prøverne.
13. Prøve Forberedelse til scanning elektronmikroskopi
- Fjern implantatet fra røret ved hjælp af pincet og skyl implantatet kortvarigt ved at dyppe det i 0,9% NaCl opløsning 3x.
- Opbevares i glutaraldehydopløsning (2% glutaraldehyd i fosfat-buffered saltvand [PBS-buffer uden Ca2+/Mg2+]) natten over ved 4 °C.
- Dernæst inkuberes implantaterne i PBS-buffer i 10 min. Dehydrereprøverne ved at inkubere i ethanol med stigende koncentration i 10 min: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% og 100%. De dehydrerede prøver opbevares i 100 % ethanol indtil yderligere analyse.
- Udfør tørring af kritiske punkter i henhold til tørreanordningens eller litteratur10's anvisninger lige før scanning af elektronmikroskopi (SEM).
14. Scanning elektronmikroskopi
- Fastgør de tørrede implantater til en prøvebærer til scanningsmikroskopet og sputter prøverne med guldpalladium.
- Indfør de sputtered implantater i prøvekammeret. Tag billeder i 100-, 500-, 1.000- og 2.500 gange forstørrelse af områderne med den repræsentative overflade og cellevedhæftning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort opsummeret, humant fuldblod blev indsamlet i heparin-loaded monovetter derefter samlet og bruges til at evaluere baseline niveauer af celletal samt plasmatiske hæmomkompatibilitet markører.
Efterfølgende blev slangen indeholdende de neurovaskulære implantatprøver fyldt, og blodet blev perfunderet i 60 min. ved 150 ml/min. og 37 °C ved hjælp af en peristaltpumpe. Igen blev antallet af celler analyseret i alle grupper, og plasmaprøverne blev forberedt til ELISA-analyser (figur 1). Kvantificeringen af blodceller og blodparametre, såsom hæmoglobin og hæmatokrit, blev udført direkte efter blodtapning samt efter perfusion i flowloop-modellen for alle prøvetyper og kontrollen. Der blev ikke konstateret ændringer med hensyn til antallet af WBC'er (figur 2A), RBC(figur 2B) eller hæmatokritværdierne (figur 2C). Der blev dog påvist et fald i hæmoglobinniveauerne efter inkubationen af blod i flowloop-modellen sammenlignet med baselineværdierne, hvilket skyldtes blodpersmeltningen i flowloopsystemet (figur 2D). Desuden blev der observeret et fald i blodpladenumrene på grund af blodperfusion. Desuden blev denne effekt øget, da en ubestrøget stent var til stede i slangen, hvilket indikerer vedhæftning af blodplader til biomaterialet. Ikke desto mindre blev det tydeligt påvist, at tabet af blodplader var betydeligt højere, når den ubestrøget stent blev inkuberet med blod, i modsætning til fibrin-heparin-belagt stent (Figur 2E).
Potentielle ændringer af de hæmatologiske plasmamarkører blev også undersøgt i testgrupperne efter perfusion og sammenlignet med baselineværdierne for det nytegnede blod. Den komplekse TAT-koncentration, som afspejler koagulationssystemets aktiveringsstatus, blev let forøget på grund af blodperfusion (figur 3A). I stentgruppen med bare metal blev der imidlertid opdaget en betydelig stigning i TAT,hvilket indikerer en gennemgribende aktivering af koagulationssystemet. Den fibrin-heparinbelagte stent forhindrede aktivering af koagulationssystemet, da der ikke blev bestemt nogen forøgelse af TAT.
Perfusionførte til en øget aktivering af komplemenfikatet kaskade, som blev bestemt ved måling af SC5b-9 (Figur 3B). Inkubationen med ubestrøget eller fibrin-heparinbelagte stents øgede imidlertid ikke Koncentrationen af SC5b-9 yderligere. Lignende resultater blev opnået ved analyse af aktiveringen af neutrofile granulocytter gennem kvantificering af PMN-elastase koncentrationer (Figur 3C).
Visualisering af stentoverfladen blev udført ved hjælp af SEM. Der blev påvist klare forskelle mellem de to stentgrupper efter blodinkubation. Mens der på overfladen af den ubestrøget stent var et tæt netværk af blodlegemer og proteiner til stede, blev der ikke påvist vedhæftning af proteiner eller celler på overfladen af den fibrin-heparinbelagte stent (figur 4).
Figur 1: Skematisk oversigt over hæmorikompatibilitetsevalueringen af stents i en veletableret flowloop-model. Frisk humant fuldblod indsamles fra raske donorer i blodrør, der indeholder heparin til antikoagulation. For hver donor fyldes et tomt rør samt rør, der er forudindlæst med prøvematerialet, efterfølgende med frisk blod og inkuberes i flowkredsløbet med en hastighed på 150 ml/min. ved 37 °C i 60 min. Derudover fremstilles plasmaprøver af frisktrukket blod for at opnå hver donors basisværdier. Efter inkubationen fremstilles plasmaprøverne fra testslangen med og uden prøvematerialer ved hjælp af en specifik ELISA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Analyse af forskellige celletyper og blodparametre før og efter inkubation af forskellige stentimplantater i flowloop-modellen. Bestemmelse af hvide blodlegemer (A), røde blodlegemer (B), hæmatokrit (C), hæmoglobin (D), og blodplader (E) blev udført. Dataene vises som middel ± SEM (n = 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bestemmelse af blodplade- eller immunsystemaktiveringsmarkører før og efter inkubation med neurovaskulære implantater. Markørerne for (A)aktivering af blodkoagulation (TAT), (B) komplementsystem (SC5b-9) og (C) neutrofiler (PMN-elastase) blev kvantificeret ved hjælp af ELISA. Analysen blev udført på plasmaprøver fra frisktegnet blod eller blod inkuberet med forskellige stents i flow loop-modellen. Dataene vises som gennemsnit ± SEM (n = 5, p* < 0,5). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Scanning af elektronmikroskopisk analyse af stents efter inkubation med blod. Sammenlægningen af blodplasmaproteiner og blodplader på ubestrøget stentmateriale blev observeret. Til sammenligning viste stentmaterialer med fibrin-heparinbelægningen ikke vedhæftning af celler eller andre blodkomponenter på overfladen (forstørrelse på 500-, 1.000- og 2.500 gange). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver en omfattende og pålidelig metode til hæmofikompatibilitetstest af blodkontaktende implantater i overensstemmelse med ISO 10993-4 i en forskydningsflowmodel, der efterligner blodgennemstrømningen hos mennesker. Denne undersøgelse er baseret på test af laser-cut neurovaskulære implantater, men kan udføres med en række prøver. Resultaterne viser, at denne metode muliggør en bred analyse af forskellige parametre såsom blodcelletal, forekomsten af flere hæmokompatibilitetsmarkører og mikroskopisk visualisering af enhedens overflade efter blodkontakt. Ved hjælp af denne protokol, potentielle forskelle med hensyn til hæmokompatibilitet af forskellige enheder kan påvises.
Et alternativ til in vitro hæm/kompatibilitetsvurdering består af in vivo dyreforsøg, som er forbundet med flere ulemper, såsom højere variabilitet og forvrængning af enhedsrelaterede virkninger som følge af de overvældende kortsigtede virkninger af vævsskade6.
Til in vitro-hæmokompatibilitetstest findes der tre typer modeller: (1) statiske blodinkubationsmodeller, (2) ophidsede blodinkubationsmodeller og (3) forskydningsflowmodeller. Den statiske model giver en enkel og hurtig metode til at bestemme trombogenicity ved at inkubere enheden direkte med blod, men det fører kun til rudimentære resultater vedrørende hæmokompatibilitet11. For at overvinde de største ulemper ved statiske modeller (dvs. sedimentering af blodlegemer og den store luftkontaktflade) kan den agiterende blodinkubationsmodel anvendes, hvor et testkammer, der indeholder implantaterne, fyldes med blod og inkuberes på en gyngende platform12. Men disse modeltyper er stadig ringere i forhold til de eksisterende forskydningsflowmodeller, f.eks. Indbegrebet af disse modeller er, at vaskulære menneskelige blodgennemstrømning kan efterlignes; således kan en tæt skildring af den virkelige interaktion mellem implantatet og blodceller vises13. Ud over flowloop-modellen findes modeller som Chandler-løkken eller flere perfunderede flowkammer14,15,16.
Chandler loop er et lukket rørsystem, der er delvist fyldt med luft og fastspændt i en roterende enhed, hvilket resulterer i blodcirkulation gennem slangen17. I det nuværende flow loop system, røret er helt fyldt med blod, og strømmen er tvunget ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Når chandler loop-modellen tages i brug, står operatørerne over for to store ulemper på grund af kravet om at inkludere luft i testslangen. For det første er det kendt, at den konstante interaktion mellem blod og luft udløser aggregering af leukocytter og blodplader samt protein denaturering18,19. For det andet er blodcirkulationen begrænset, fordi luften altid forbliver på det højeste punkt i løkken20.
Disse ulemper kan overvindes, når du bruger flow loop system. Da der ikke er nogen luftvæskegrænseflade i systemet, sker der ingen blodpladeaktivering. Således modellen har en lav baggrund for trombotiske hændelser, således at en lav koncentration af antikoagulanter, typisk 1 IE / ml eller 1,5 IE / ml heparin, er tilstrækkelig til at forhindre koagulation, selv om høje strømningshastigheder anvendes6. Den justerbare pumperegulerede blodgennemstrømning og den frit valgbare rørdiameter gør det muligt for operatøren at efterligne de fysiologiske forhold for en vene eller arterie, som svarer til det implantat, der skal testes, og opnå relevante testresultater21. Men denne fordel er på samme tid en begrænsning, på grund af den mekaniske stress påføres blodet gennem pumpen, og ødelæggelsen af erythrocytter (dvs. hæmolyse) kan forekomme2. Dette, der opstår iboende blodskader, reducerer metodens følsomhed og hindrer langvarig udsættelse for blodet21. Ikke desto mindre har flere undersøgelser vist , at flowloop-modellen anvendes effektivt til hæm/kompatibilitetsevaluering22,23,24.
Den største forskel mellem alle in vitro-modeller og in vivo-mekanismerne omfatter imidlertid det manglende endotel, som udtrykker cytokiner, anti-trombotiske komponenter og vedhæftningsmolekyler; derfor, denne komponent spiller en afgørende rolle i samspillet mellem implantatet og cirkulerende blod25. Afslutningsvis er flowloop-modellen justerbar, effektiv, pålidelig og omkostningseffektiv til at vurdere implantaternes hæmokompatibilitet før klinisk brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
For udførelsen af scanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den del af medicinske materialer videnskab og teknologi på universitetshospitalet Tuebingen. Forskningen blev støttet af Undervisnings-, Ungdoms- og Sportsministeriet i CR under Det Nationale Bæredygtighedsprogram II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) og af Det Tjekkiske Videnskabsinstituts projekt nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
