Summary
Detta protokoll beskriver en omfattande hemocompatibility utvärdering av blod-kontakta enheter med laser-cut neurovaskulära implantat. En flödesslinga modell med färskt, heparinerat mänskligt blod appliceras för att efterlikna blodflödet. Efter perfusion analyseras olika hematologic markörer och jämförs med de värden som vunnits direkt efter blodinsamling för hemokompatibilitetsutvärdering av de testade enheterna.
Abstract
Den ökande användningen av medicintekniska produkter (t.ex. kärltransplantat, stent och hjärtkatetrar) för tillfälliga eller permanenta ändamål som finns kvar i kroppens cirkulationssystem kräver en tillförlitlig och multiparametrisk metod som utvärderar de möjliga hematologiska komplikationer som orsakas av dessa enheter (dvs. aktivering och förstörelse av blodkomponenter). Omfattande in vitro hemocompatibility testning av blod-kontakta implantat är det första steget mot ett framgångsrikt in vivo genomförande. Därför är omfattande analyser enligt Internationella standardiseringsorganisationen 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk före klinisk tillämpning. Den presenterade flödesslingan beskriver en känslig modell för att analysera stentens hemostatiska prestanda (i detta fall neurovaskulära) och avslöja negativa effekter. Användning av färskt urblod från människa och mild blodprov är avgörande för att undvika föraktivering av blod. Blodet perfunderas genom ett heparinerat rör som innehåller provexemplaret med hjälp av en peristaltisk pump med en hastighet av 150 ml/min vid 37 °C i 60 min. Före och efter perfusion, hematologiska markörer (dvs. antal blodkroppar, hemoglobin, hematokrit och plasmatiska markörer) som indikerar aktivering av leukocyter (polymorfonukleära [PMN]-elastas), trombocyter (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulationssystemet (thombin-antithrombin III [TAT]) och komplementkaskaden (SC5b-9) analyseras. Sammanfattningsvis presenterar vi en viktig och tillförlitlig modell för omfattande hemokompatibilitetstestning av stent och andra blodkontaktiga enheter före klinisk tillämpning.
Introduction
In vivo-applicering av implantat och biomaterial, som interagerar med humant blod, kräver intensiva prekliniska tester med fokus på undersökning av olika markörer för hemostatiska systemet. Internationella standardiseringsorganisationen 10993-4 (ISO 10993-4) specificerar de centrala principerna för utvärdering av blodkontaktutrustning (dvs. stent och kärltransplantat) och anser att enhetens design, klinisk nytta och material som behövs1.
Humant blod är en vätska som innehåller olika plasmaproteiner och celler, inklusive leukocyter (vita blodkroppar [WBCs]), erytrocyter (röda blodkroppar [CFC]) och trombocyter, som utför komplexa funktioner i människokroppen2. Direktkontakt av främmande material med blod kan orsaka negativa effekter, såsom aktivering av immun- eller koagulationssystemet, vilket kan leda till inflammation eller trombotiska komplikationer och allvarliga problem efter implantation3,4,5. Därförerbjuder in vitro hemocompatibility validering en möjlighet före implantation att upptäcka och utesluta eventuella hematologic komplikationer som kan induceras vid kontakt med blodet med en främmande yta6.
Den presenterade flödesslingan modellen inrättades för att bedöma hemokompatibilitet en neurovaskulär stent och liknande enheter genom att tillämpa ett flöde på 150 ml/min i slangar (diameter 3,2 mm) för att efterlikna cerebrala flödesförhållanden och artärdiametrar2,7. Förutom behovet av en optimal in vitro-modell är källan till blod en viktig faktor för att få tillförlitliga och oförändrade resultat vid analys av hemokompatibilitet hos ett biomaterial8. Det insamlade blodet ska användas omedelbart efter provtagning för att förhindra förändringar orsakade av långvarig förvaring. I allmänhet bör en mild blodsamling utan stasis med en 21 G-nål utföras för att minimera preaktivering av blodplättar och koaguleringskaskaden under blodprovskaskaden under blodprovstagningen. Dessutom, givare uteslutning kriterier inkluderar dem som röker, är gravida, är i ett dåligt hälsotillstånd, eller har tagit p-piller eller smärtstillande medel under de senaste 14 dagarna.
Denna studie beskriver en in vitro-modell för omfattande hemokompatibilitetstestning av stentimplantat under flödesförhållanden. Vid jämförelse obestruken med fibrin-heparin-belagda stent, återspeglar resultaten av de omfattande hemokompatibilitetstesterna förbättrad hemokompatibilitet hos fibrin-heparin-belagda stent9. Däremot inducerar de obelagda stenten aktivering av koagulationskaskaden, vilket framgår av en ökning av thombin-antitrombin III (TAT) koncentrationer och förlust av blodplättsnummer på grund av vidhäftning av trombocyter till stentyta. Sammantaget rekommenderas integrering av denna hemocompatibility-modell som ett prekliniskt test för att upptäcka eventuella negativa effekter på hemostatiska systemet som orsakas av enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprovstagningsförfarandet godkändes av etikkommittén vid den medicinska fakulteten vid Universitetet i Tuebingen (projektidentifieringskod: 270/2010BO1). Alla ämnen gav skriftligt, informerat samtycke för inkludering före deltagande.
1. Beredning av Heparin-laddade Monovettes
- Blanda outspädd heparin (5 000 IE/ml) med natriumklorid (NaCl, 0,9%) lösning och förbereda en lösning med en resulterande koncentration på 15 IE/ml heparin.
- Tillsätt 900 μL av den utspädda heparinlösningen på varje neutral monovette (9 ml) för att erhålla en slutlig heparinkoncentration på 1,5 IE/ml efter blodprovstagning. Förbered tre monovetter per givare plus tre reservmonovetter och förvara heparinladdade monovetiterna vid 4 °C tills blodprovet.
2. Blodprov
- Ta ut de heparinladdade monovetterna ur kylskåpet 30 min före blodprov.
- Samla ett 27 mL blodprov från varje frisk givare (n = 5) genom venipuncture för flödesslingan. Applicera endast en slät tourniquet för att undvika för tidig aktivering av trombocyter och blodproppkaskaden.
- Samla blodprover i tre monovetter som innehåller 900 μL av heparinlösningen (1,5 IE/ml) och samla alla tre monovetterna i en plastbehållare för att säkerställa att alla komponenter är jämnt fördelade.
- Överför direkt det poolade hepariniserade blodet till tre olika monovetter som innehåller antingen EDTA (1,2 ml), citrat (1,4 ml) eller en blandning av citrat, teofyllin, adenosin och dipyridamole (CTAD, 2,7 ml) för att samla in baslinjevärden. Fortsätt med proverna enligt beskrivningen i avsnitten 5−8.
OBS: För att garantera opåverkad koagulationsbeteende bör donatorer undvika intag av hemostassom-påverkar läkemedel (t.ex. acetylsalicylsyra, naproxen och karbenicillin) inom de senaste 14 dagarna, samt p-piller och rökning.
3. Beredning av flödesslingan
- Skär tre heparinbelagda polyvinylkloridrör med en längd av 75 cm och innerdiameter på 3,2 mm. Ladda rören med de neurovaskulära laserskurna implantaten med eller utan fibrin-heparinbeläggningen. Kom ihåg att lämna ett badkar lossas som en kontroll.
- Placera ena änden av röret i en behållare fylld med 0,9% NaCl, anslut slangen till pumphuvudet och sätt in den andra änden i en mätcylinder.
- Justera inställningarna för peristaltic pumpen för att uppnå ett flöde på 150 ml/ min med hjälp av en timer samtidigt som du kontrollerar fyllningsnivån i mätcylindern.
4. Prestanda för hemocompatibility Testning
- Använd en 12 ml spruta för att fylla rören med blod. Låt 6 ml blodflödet smidigt i varje rör som innehåller ett prov eller olossat kontroll.
- Bilda en krets och stäng rören tätt med en 0,5 cm längd av silikonanslutningsslangar. Placera rören i ett vattenbad på 37 °C och starta perfusionen i 60 min.
5. Analys av helblodsräkning
- Sätt 1,2 ml blod efter provtagning (baslinje) eller efter perfusion i en monovette som innehåller EDTA och vänd försiktigt röret 5x.
- Sätt in monovetten i blodanalysatorn och utför en blodräkningsanalys för varje prov. Inkubera sedan monovetterna på is i 15−60 min efter blodräkningsmätningen för vidare analys, enligt beskrivningen i avsnitt 7.
6. Insamling av citrat plasma
- Fyll monovetiterna som innehåller citrat med 1,4 ml blod (nydragna eller efter cirkulationen) och vänd försiktigt 5x.
- Centrifugera rören i 18 min vid 1 800 x g vid rumstemperatur (RT). Aliquot tre 250 μL-prover av plasmafraktionen i 1,5 ml reaktionsrör och fryser plasmaproverna i flytande kväve. Förvara dem vid -20 °C tills analysen.
7. Insamling av EDTA Plasma
- Inkubera monovetterna på is i 15−60 min efter blodräkningsmätningen. Centrifugera sedan rören i 20 min vid 2 500 x g och 4 °C.
- Aliquot tre 250 μL-prover av plasmafraktionen i 1,5 ml reaktionsrör efter centrifugering och frysrören i flytande kväve. Förvara dem vid -80 °C tills analysen.
8. Insamling av CTAD Plasma
- Fyll monovetiterna som innehåller CTAD-blandningen med 2,7 ml blod (nydragna eller efter inkubation) och vänd försiktigt 5x. Därefter ruva monovetterna på is i 15−60 min. Centrifugera sedan rören i 20 min vid 2 500 x g och 4 °C.
- Överför 700 μL av den mellersta plasmafraktionen till ett 1,5 ml reaktionsrör och centrifugera de fyllda reaktionsrören i 20 min vid 2 500 x g och 4 °C.
- Aliquot två 100 μL-prover av den mellersta fraktionen i 1,5 ml reaktionsrör efter centrifugering och frysa rören i flytande kväve. Förvara dem vid -20 °C tills analysen.
OBS: Insamlingen av EDTA plasma och CTAD plasma kan utföras tillsammans eftersom driftsförhållandena är desamma.
9. Mätning av human tat från citrat plasma
- Tina citratplasman i ett vattenbad på 37 °C.
- Använd Den TAT enzymlänkade Immunosorbent-analyssatsen (ELISA) enligt tillverkarens anvisningar. Rekonstruera plasmastandarder och kontrollera och späd tvättlösningen, anti-human-TAT peroxidas (POD)-konjugerad antikropp och chromogenlösning. Lämna alla reagenser och mikrotiterplattan vid RT (15−25 °C) i 30 minuter innan provningen påbörjas.
- Pipa 50 μL av provbufferten i varje brunn på mikrotiterplattan och tillsätt 50 μL av provbufferten (tom), plasmastandard, plasmakontroll och outspädd plasmaprov i dubbletter till brunnsplattan. Täta plattan och inkubera vid 37 °C i 15 min med mild skakning. Tvätta sedan plattan 3x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 100 μL av DEN POD-konjugeerade anti-människa-TAT-antikroppen i varje brunn. Täta plattan och inkubera vid 37 °C i 15 min med mild skakning. Tvätta sedan plattan 3x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 100 μL av den nyberedda chromogenlösningen i varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 30 min.
- Ta bort tätningsfilmen och tillsätt 100 μL stopplösning till varje brunn. Läs den optiska densiteten (OD) med en fotometer på 490−500 nm. Anpassa standardkurvans data som en trendlinje och beräkna provernas koncentration.
10. Mätning av PMN-elastas från Citrat Plasma
- Tina citratplasman i ett vattenbad vid 37 °C.
- Använd eLISA-satsen (polymorfonukleär (PMN)-elastas enligt tillverkarens anvisningar: rekonstruera PMN-elastas-kontrollen och PMN-elastasstandarden för att förbereda en standardkurva med hjälp av satsens utspädningsbuffert.
- Späd tvättlösningen enligt tillverkarens beskrivning. Lämna alla reagenser och mikrotiterplattan på RT i 30 min innan testet påbörjas. Späd citratplasmaproverna till 1:100 med utspädningsbufferten.
- Tillsätt 100 μL av provbufferten (tom), PMN-elastasstandardkurva (15.6−1,000 ng/ mL), PMN-elastaskontroller (höga och låga koncentrationer) och utspädda plasmaprover i dubbletter till brunnsplattan. Försegla plattan och inkubera på RT i 60 min med mild skakning. Tvätta därefter plattan 4x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 150 μL av den enzymkonjugerad antikroppen till varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 60 min med mild skakning. Tvätta därefter plattan 4x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 200 μL av 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB)-substratlösning till varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 20 min i mörkret. Ta sedan bort tätningsfilmen och tillsätt 50 μL av stopplösningen i varje brunn.
- Läs OD med en fotometer på 450 nm med en referensavläsning på 630 nm. Anpassa standardkurvans data som en trendlinje och beräkna provernas koncentration.
11. Mätning av Terminal Complement Complex (TCC) från EDTA Plasma
- Tina EDTA-plasman i ett vattenbad vid 37 °C och förvara på is efter avfrostning.
- Använd komplementkaskaden SC5b-9 ELISA-satsen enligt tillverkarens anvisningar: späd tvättlösningen enligt beskrivningen i tillverkarens protokoll. Lämna alla reagenser och mikrotiterplattan på RT i 30 min innan testet påbörjas. Späd EDTA-plasmaproverna till 1:10 med satsens utspädningsbuffert.
- Tillsätt 300 μL tvättlösning till varje brunn för att återfukta ytan och aspirera efter 2 min. Tillsätt 100 μL av provbufferten (tom), SC5b-9-standarder, SC5b-9-kontroller (höga och låga koncentrationer) och de utspädda plasmaproverna i dubbletter till brunnsplattan.
- Försegla plattan och inkubera på RT i 60 min. Tvätta sedan plattan 5x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 50 μL av den enzymkonjugerad antikroppen till varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 30 min. Tvätta sedan plattan 5x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 100 μL av TMB-substratlösningen i varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 15 min i mörkret.
- Ta bort tätningsfilmen och tillsätt 100 μL av stopplösningen i varje brunn. Läs OD med en fotometer på 450 nm. Anpassa standardkurvans data som en trendlinje och beräkna provernas koncentration.
12. Mätning av β-tromboglobulin från CTAD Plasma
- Tina ctadplasman i ett vattenbad vid 37 °C.
- Använd elisa-satsen β-thromboglobulin (β-TG) enligt tillverkarens anvisningar: rekonstruera β-TG-kontrollen och β-TG-standarden och späd tvättlösningen med destillerad H2O. Rekonstruera POD-konjugerat antikroppen med hjälp av den medföljande fosfatbufferten. Lämna alla reagenser och mikrotiterplattan på RT i 30 min innan testet påbörjas.
- Förbered standardkurvan och kontrollen enligt tillverkarens anvisningar med den medföljande fosfatbufferten. Späd CTAD plasmaprover till 1:21.
- Tillsätt 200 μL fosfatbufferten (tom), β-TG-standarder, β-TG-kontroller (höga och låga koncentrationer) och utspädda plasmaprover i dubbletter till brunnsplattan. Försegla plattan och inkubera på RT i 60 min. Därefter tvätta plattan 5x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 200 μL av den enzymkonjugerad antikroppen till varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 60 min. Därefter tvätta plattan 5x med 300 μL tvättlösning.
- Tillsätt 200 μL av TMB-substratlösningen i varje brunn. Försegla plattan och inkubera på RT i 5 min i mörkret. Ta bort tätningsfilmen och stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 μL 1 M svavelsyra (H2SO4) i varje brunn.
- Lämna plattan i 15−60 min och läs sedan OD med en fotometer på 450 nm. Anpassa standardkurvans data som en trendlinje och beräkna provernas koncentration.
13. Provberedning för scanning elektronmikroskopi
- Ta bort implantatet från röret med pincett och skölj implantatet kort genom att doppa det i 0,9% NaCl lösning 3x.
- Förvaras i glutaraldehyd lösning (2% glutaraldehyd i fosfatbuffrad allomin [PBS-buffert utan Ca2+/Mg2+]) över natten vid 4 °C.
- Därefter ruva implantaten i PBS-buffert i 10 min. Torka proverna genom att inkubera i etanol med ökande koncentration i 10 min vardera: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, och 100%. Förvara de uttorkade proverna i 100% etanol tills vidare analys.
- Utför kritisk punkttorkning enligt instruktionerna från torkanordningen ellerlitteraturen 10 strax före svepelektronmikroskopi (SEM).
14. Scanning Electron Mikroskopi
- Fäst de torkade implantaten på en provbärare för skanningmikroskop och sputter proverna med guld palladium.
- Introducera de sputtered implantaten i provkammaren. Ta bilder i 100-, 500-, 1000- och 2500-faldig förstoring av områdena med representativ yta och cellvidhäftning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortfattat sammanfattade, mänskliga helblod samlades in i heparin-laddade monovettes sedan poolade och används för att utvärdera baslinjenivåerna av cellantal samt plasmatiska hemokompatibilitet markörer.
Därefter fylldes slangarna som innehöll de neurovaskulära implantatproverna, och blodet var perfunderas i 60 min vid 150 ml/min och 37 °C med hjälp av en peristaltisk pump. Återigen analyserades antalet celler i alla grupper, och plasmaproverna förbereddes för ELISA-analyser (figur 1). Kvantifieringen av blodkroppar och blodparametrar, såsom hemoglobin och hematokrit, utfördes direkt efter blodinsamling samt efter perfusion i flödesslingan modellen för alla provtyper och kontrollen. Inga ändringar upptäcktes när det gäller antalet wbcs(figur 2A),rpc(figur2B)eller hematokritvärdena ( figur2C). En minskning av hemoglobinnivåerna upptäcktes dock efter inkubationen av blod i flödesslingans modell jämfört med baslinjevärdena, vilket berodde på blodperfusionen i flödesslingsystemet (figur 2D). Dessutom observerades en minskning av trombocyttal på grund av blodperfusion. Dessutom ökades denna effekt när en obestruken stent fanns i slangen, vilket indikerar vidhäftningen av trombocyter till biomaterialet. Icke desto mindre visade det sig tydligt att förlusten av blodplättar var betydligt högre när den obelagda stenten inkuberades med blod, i motsats till fibrin-heparin-belagda stent (figur 2E).
Potentiella förändringar av hematologic plasma markörer undersöktes också i testgrupperna efter perfusion och jämfört med baslinjevärdena för det nydragna blodet. Den tat-komplexa koncentrationen, som återspeglar koagulationssystemets aktiveringsstatus, höjdes milt på grund av blodperfusion (figur 3A). I bare metal stent gruppen upptäcktes dock en betydande ökning av TAT, vilket tyder på en djupgående aktivering av koaguleringssystemet. Fibrin-heparin-belagda stent förhindrade aktiveringen av koagulationssystemet, eftersom ingen ökning av TAT fastställdes.
Perfusionen ledde till en ökad aktivering av komplementkaskaden, som fastställdes genom mätning av SC5b-9 (figur 3B). Inkubation med obelagda eller fibrin-heparinbelagda stent ökade dock inte koncentrationen SC5b-9 ytterligare. Liknande resultat erhölls vid analys av aktiveringen av neutrofilgranulocyter genom kvantifiering av PMN-elastaskoncentrationer (figur 3C).
Visualisering av stentytan utfördes med SEM. Tydliga skillnader mellan de två stentgrupperna upptäcktes efter blodinkubation. Även på ytan av obestrukna stent ett tätt nätverk av blodkroppar och proteiner var närvarande, ingen vidhäftning av proteiner eller celler upptäcktes på ytan av fibrin-heparin-belagda stent (figur 4).
Figur 1: Schematisk översikt över hemokompatibilitetsutvärderingen av stent i en väletablerad flödesslingamodell. Färskt mänskligt helblod samlas in från friska givare i blodrör som innehåller heparin för antikoagulation. För varje givare fylls ett tomt rör samt rör som förlastas med provmaterialet därefter med färskt blod och inkuberas i flödesslingan med en hastighet av 150 ml/min vid 37 °C i 60 min. Dessutom framställs plasmaprover från nydraget blod för att erhålla basvärdena för varje givare. Efter inkubationen bereds och analyseras plasmaproverna från testslangen, med och utan provmaterial, med hjälp av en specifik ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analys av olika celltyper och blodparametrar före och efter inkubation av olika stentimplantat i flödesslingans modell. Bestämningen av vita blodkroppar (A),röda blodkroppar (B), hematokrit (C),hemoglobin (D), och blodplättar (E) utfördes. Uppgifterna visas som medelvärde ± SEM (n = 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bestämning av trombocyt- eller immunsystemaktiveringsmarkörer före och efter inkubation med neurovaskulära implantat. Markörerna för(A)aktivering av blodkoagulation (TAT),(B)komplementsystem (SC5b-9) och(C)neutrofiler (PMN-elastase) kvantifierades med Hjälp av ELISA. Analysen utfördes på plasmaprover från nydraget blod eller blod inkuberat med olika stent i flödesslingan modellen. Uppgifterna visas som medelvärde ± SEM (n = 5, p* < 0,5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Scanning elektron mikroskopisk analys av stent efter inkubation med blod. Aggregering av blodplasmaproteiner och blodplättar på obestruket stentmaterial observerades. I jämförelse, stent material med fibrin-heparin beläggningen visade inte vidhäftning av celler eller andra blodkomponenter på ytan (förstoring av 500-, 1000-, och 2.500-gånger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver en omfattande och tillförlitlig metod för hemokompatibilitetstestning av blodkontaktiga implantat i enlighet med ISO 10993-4 i en skjuvflödesmodell som imiterar mänskligt blodflöde. Denna studie är baserad på testning av laser-cut neurovaskulära implantat men kan utföras med en mängd olika prover. Resultaten visar att denna metod möjliggör en bred analys av olika parametrar såsom antalet blodkroppar, prevalens av flera hemokompatibilitetsmarkörer och mikroskopisk visualisering av enhetens yta efter blodkontakt. Med det här protokollet kan potentiella skillnader när det gäller hemokompatibiliteten hos olika enheter upptäckas.
Ett alternativ till in vitro hemocompatibility bedömning består av in vivo djurförsök, som är associerad med flera nackdelar, såsom högre variationer och snedvridning av enhetsrelaterade effekter på grund av de överväldigande kortsiktiga effekterna av vävnadsskada6.
För in vitro hemocompatibility testning, tre typer av modeller finns: (1) statiskblod inkubation modeller, (2) upprörd blod inkubation modeller, och (3) skjuvflöde modeller. Den statiska modellen ger en enkel och snabb metod för att bestämma trombbogenicitet genom att inkubera enheten direkt med blod, men det leder bara till rudimentära resultat om hemokompatibilitet11. För att övervinna de största nackdelarna med statiska modeller (dvs. sedimentering av blodkroppar och den stora luftkontaktytan) får den upprört blodinkubationsmodellen användas, där en testkammare som innehåller implantaten är fylld med blod och ruvades på en gungplattform12. Dessa modelltyper är dock fortfarande sämre jämfört med de befintliga skjuvflödesmodellerna, till exempel flödesslingan som presenteras här. Kvintessensen av dessa modeller är att vaskulärt mänskligt blodflöde kan imiteras; Således kan en nära skildring av den verkliga interaktionen mellan implantatet och blodkropparna visas13. Förutom flödesslingan modell, modeller som Chandler slinga eller flera perfunderas flöde kammare finns14,15,16.
Chandler slingan är ett slutet rör system som delvis är fylld med luft och fastklämd i en roterande enhet, vilket resulterar i blodcirkulationen genom slangen17. I det nuvarande flödesslingsystemet är röret helt fyllt med blod, och flödet tvingas med hjälp av en peristaltisk pump. När du använder Chandler loop modellen, operatörer står inför två stora nackdelar på grund av kravet på att inkludera luft i testslangen. För det första är det känt att den ständiga interaktionen mellan blod och luft utlöser aggregering av leukocyter och blodplättar samt proteindenaturering18,19. För det andra är blodcirkulationshastigheten begränsad, eftersom luften alltid ligger kvar på slingans högsta punkt20.
Dessa nackdelar kan övervinnas när du använder flödesslingsystemet. Eftersom det inte finns något luftflytande gränssnitt i systemet sker ingen trombocytaktivering. Således har modellen en låg bakgrund för trombotiska händelser så att en låg koncentration av antikoagulantia, vanligtvis 1 IE/ml eller 1,5 IE/ml heparin, är tillräcklig för att förhindra koagulation, även om höga flöden tillämpas6. Den justerbara pumpreglerade blodflödet och fritt valbara rördiameter gör det möjligt för operatören att efterlikna de fysiologiska förhållandena hos en ven eller artär, som motsvarar implantatet som ska testas, och uppnå relevanta testresultat21. Denna fördel är dock samtidigt en begränsning, på grund av den mekaniska belastning som appliceras på blodet genom pumpen, och förstörelsen av erytrocyter (dvs. hemolys) kan förekomma2. Detta inneboende blodskador minskar metodens känslighet och hindrar långvarig exponering för blodet21. Ändå har flera studier visat en effektiv användning av flödesslingan modell för hemokompatibilitet utvärdering22,23,24.
Den största klyftan mellan alla in vitro-modeller och in vivo-mekanismerna omfattar dock det saknade endotheliumet, som uttrycker cytokiner, antitrombotiska komponenter och vidhäftningsmolekyler. Därför spelar denna komponent en avgörande roll i interaktionen mellan implantatet och cirkulerande blod25. Sammanfattningsvis är flödesslingan modellen justerbar, effektiv, tillförlitlig och kostnadseffektiv för att bedöma hemokompatibiliteten hos implantat före klinisk användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
För prestanda navelektronmikroskopi tackar vi Ernst Schweizer från sektionen av Medicinsk materialvetenskap och teknik vid Universitetssjukhuset Tuebingen. Forskningen stöddes av ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i CR inom National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) och av Tjeckiska Science Foundation projekt nr 18-01163S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
