Summary
Denne protokollen beskriver en omfattende hemokompatibilitetevaluering av blodkontaktenheter ved hjelp av laserkuttede nevrovaskulære implantater. En flow loop modell med frisk, heparinisert menneskelig blod påføres for å etterligne blodstrømmen. Etter perfusjon analyseres ulike hematologiske markører og sammenlignes med verdiene som oppnås rett etter blodinnsamling for hemokompatibilitetsevaluering av de testede enhetene.
Abstract
Den økende bruken av medisinsk utstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) for midlertidige eller permanente formål som forblir i kroppens sirkulasjonssystem krever en pålitelig og multiparametrisk tilnærming som evaluerer mulige hematologiske komplikasjoner forårsaket av disse enhetene (dvs. aktivering og ødeleggelse av blodkomponenter). Omfattende in vitro hemokompatibilitetstesting av blod-kontakt implantater er det første skrittet mot vellykket i vivo implementering. Derfor er omfattende analyse i henhold til International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den presenterte flytsløyfen beskriver en sensitiv modell for å analysere den hemostatiske ytelsen til stenter (i dette tilfellet nevrovaskulær) og avsløre bivirkninger. Bruk av friskt menneskelig blod og skånsom blodprøvetaking er avgjørende for å unngå preaktivering av blod. Blodet er gjennomsyret gjennom et heparinisert rør som inneholder testprøven ved hjelp av en peristaltisk pumpe med en hastighet på 150 ml /min ved 37 °C i 60 min. Før og etter perfusjon, hematologiske markører (dvs. blodceller, hemoglobin, hematokrit og plasmatiske markører) som indikerer aktivering av leukocytter (polymorfokleære [PMN]-elastase), blodplater (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulasjonssystemet (trombin-antitrombin III [TAT]), og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Til slutt presenterer vi en viktig og pålitelig modell for omfattende hemokompatibilitetstesting av stenter og andre blodkontaktenheter før klinisk bruk.
Introduction
In vivo anvendelse av implantater og biomaterialer, som samhandler med menneskelig blod, krever intens preklinisk testing med fokus på undersøkelse av ulike markører i det hemostatiske systemet. Den internasjonale organisasjonen for standardisering 10993-4 (ISO 10993-4) spesifiserer de sentrale prinsippene for evaluering av blodkontaktenheter (dvs. stenter og vaskulære grafts) og vurderer enhetsdesign, klinisk verktøy og materialer som trengs1.
Humant blod er en væske som inneholder ulike plasmaproteiner og celler, inkludert leukocytter (hvite blodlegemer [WBCer]), erytrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplater, som utfører komplekse funksjoner i menneskekroppen2. Direkte kontakt av fremmedlegemer med blod kan forårsake bivirkninger, for eksempel aktivering av immun- eller koagulasjonssystemet, noe som kan føre til betennelse eller trombotiske komplikasjoner og alvorlige problemer etter implantasjon3,4,5. Derfor gir in vitro hemokompatibilitetsvalidering en mulighet før implantasjon for å oppdage og utelukke hematologiske komplikasjoner som kan induseres ved kontakt av blodet med en fremmed overflate6.
Den presenterte flow loop modellen ble etablert for å vurdere hemokompatibilitet av nevrovaskulære stenter og lignende enheter ved å bruke en strømningshastighet på 150 ml / min i rør (diameter på 3,2 mm) for å etterligne cerebralflyt forhold og arterie diametre2,7. Foruten behovet for en optimal in vitro modell, er blodkilden en viktig faktor for å få pålitelige og uendrede resultater når du analyserer hemokompatibilitet av et biomateriale8. Det oppsamlede blodet skal brukes umiddelbart etter prøvetaking for å forhindre endringer forårsaket av langvarig lagring. Generelt bør en mild oppsamling av blod uten stasis ved hjelp av en 21 G nål utføres for å minimere preaktivering av blodplater og koagulasjonskaskade under blodtegning. Videre inkluderer donorekskluderingskriterier de som røyker, er gravide, er i dårlig helsetilstand, eller har tatt p-piller eller smertestillende midler i løpet av de siste 14 dagene.
Denne studien beskriver en in vitro-modell for omfattende hemokompatibilitetstesting av stentimplantater under strømningsforhold. Når du sammenligner ubestrøket med fibrin-heparinbelagte stenter, gjenspeiler resultatene av de omfattende hemokompatibilitetstestene forbedret hemokompatibilitet av fibrin-heparinbelagte stenter9. I motsetning induserer de ubestrøkede stenter aktiveringen av koagulasjonskaskade, som demonstrert av en økning i trombin-antitrombin III (TAT) konsentrasjoner og tap av blodplatetall på grunn av vedheftet av blodplater til stentoverflate. Samlet sett anbefales det å integrere denne hemokompatibilitetsmodellen som en preklinisk test for å oppdage eventuelle bivirkninger på det hemostatiske systemet som er forårsaket av enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøvebehandlingen ble godkjent av etikkkomiteen til det medisinske fakultetet ved Universitetet i Tuebingen (prosjektidentifikasjonskode: 270/2010BO1). Alle gitt skriftlig, informert samtykke for inkludering før deltakelse.
1. Utarbeidelse av Heparin-lastet monovettes
- Bland ufortynnet heparin (5000 IE/ml) med natriumklorid (NaCl, 0,9 %) løsning og klargjøre en løsning med en resulterende konsentrasjon på 15 IE/ml heparin.
- Tilsett 900 μL av den fortynnede heparinoppløsningen til hver nøytrale monovette (9 ml) for å oppnå en endelig heparinkonsentrasjon på 1,5 IE/ml etter blodprøvetaking. Forbered tre monovettes per donor pluss tre reserve monovettes og lagre heparin-lastet monovettes ved 4 °C til blodprøvetaking.
2. Blodprøvetaking
- Ta de heparinbelastede monovete ut av kjøleskapet 30 min før blodprøvetaking.
- Samle en 27 ml blodprøve fra hver sunn donor (n = 5) ved venipuncture for strømningssløyfen. Bruk kun en glatt turniquet for å unngå for tidlig aktivering av blodplatene og blodproppkaskade.
- Samle blodprøver i tre monovettes som inneholder 900 μL av heparinoppløsningen (1,5 IE/ml) og samle alle tre monovettene i en plastbeholder for å sikre at alle komponentene fordeles jevnt.
- Direkte overføre det samlede hepariniserte blodet til tre forskjellige monovette som inneholder enten EDTA (1,2 ml), sitrat (1,4 ml), eller en blanding av citrat, teofyllin, adenosin og dipyridamole (CTAD, 2,7 ml) for å samle baselineverdier. Fortsett med prøvene som beskrevet i pkt. 5-8.
MERK: For å garantere upåvirket koagulasjonsatferd, bør donorer unngå inntak av hemostasepåvirkende legemidler (f.eks. acetylsalisylsyre, naproksen og karbenicillin) i løpet av de siste 14 dagene, samt p-piller og røyking.
3. Utarbeidelse av strømningssløyfen
- Klipp tre heparinbelagte polyvinylkloridrør med en lengde på 75 cm og indre diameter på 3,2 mm. Legg rørene med de nevrovaskulære laserkuttede implantatene med eller uten fibrin-heparinbelegget. Husk å la en kar losset som en kontroll.
- Plasser den ene enden av røret i et reservoar fylt med 0,9% NaCl, koble slangen til pumpehodet, og sett den andre enden inn i en målesylinder.
- Juster innstillingene for den peristaltiske pumpen for å oppnå en strømningshastighet på 150 ml/min ved å bruke en timer mens du kontrollerer fyllnivået i målesylinderen.
4. Ytelse av Hemokompatibilitet Testing
- Bruk en 12 ml sprøyte til å fylle rørene med blod. La 6 ml blodstrøm menme jevnt inn i hvert rør som inneholder en prøve eller losset kontroll.
- Lag en krets og lukk rørene tett med en 0,5 cm lengde på silikontilkoblingsrør. Plasser rørene i et vannbad på 37 °C og start perfusjonen i 60 min.
5. Analyse av fullblodstelling
- Sett 1,2 ml blod etter prøvetaking (baseline) eller etter perfusjon i en monovette som inneholder EDTA og vend forsiktig røret 5x.
- Sett monovetten inn i blodanalysatoren og utfør en blodtellingsanalyse for hver prøve. Deretter inkuberer monovettene på is i 15-60 minutter etter blodtellingsmålingen for videre analyse, som beskrevet i avsnitt 7.
6. Innsamling av citratplasma
- Fyll monovettene som inneholder sitrat med 1,4 ml blod (nytrukket eller etter sirkulasjon) og vend forsiktig 5x.
- Sentrifugerrørene i 18 min ved 1800 x g ved romtemperatur (RT). Aliquot tre 250 μL prøver av plasmafraksjonen i 1,5 ml reaksjonsrør og fryse plasmaprøvene i flytende nitrogen. Oppbevar dem ved -20 °C til analyse.
7. Innsamling av EDTA Plasma
- Inkuber monovettene på is i 15–60 minutter etter måling av blodtelling. Deretter sentrifugerer rørene i 20 min ved 2500 x g og 4 °C.
- Aliquot tre 250 μL prøver av plasmafraksjonen i 1,5 ml reaksjonsrør etter sentrifugering og fryse rørene i flytende nitrogen. Oppbevar dem ved -80 °C til analyse.
8. Innsamling av CTAD Plasma
- Fyll monovettene som inneholder CTAD-blandingen med 2,7 ml blod (nytrukket eller etter inkubasjon) og vend forsiktig 5x. Etterpå inkuberer monovettene på is i 15-60 min. Deretter sentrifugerer rørene i 20 min ved 2500 x g og 4 °C.
- Overfør 700 μL av den midterste plasmafraksjonen til et 1,5 ml reaksjonsrør og sentrifuger de fylte reaksjonsrørene i 20 min ved 2500 x g og 4 °C.
- Aliquot to 100 μL prøver av den midterste fraksjonen i 1,5 ml reaksjonsrør etter sentrifugering og fryse rørene i flytende nitrogen. Oppbevar dem ved -20 °C til analyse.
MERK: Innsamlingen av EDTA plasma og CTAD plasma kan utføres sammen fordi driftsforholdene er de samme.
9. Måling av humant TAT fra citratplasma
- Tin sitratplasmai et vannbad på 37 °C.
- Bruk TAT enzymbundet Immunosorbentanalysesett (ELISA) i henhold til produsentens instruksjoner. Rekonstruere plasmastandarder og kontroll og fortynn vaskeløsningen, anti-human-TAT peroksidase (POD)-konjugert antistoff og kromogenoppløsning. La alle reagensene og mikrotiterplaten stå ved RT (15–25 °C) i 30 minutter før testen startes.
- Rør 50 μL av prøvebufferen i hver brønn av mikrotiterplaten og tilsett 50 μL av prøvebufferen (tom), plasmastandard, plasmakontroll og ufortynnet plasmaprøve i duplikater til brønnplaten. Forsegle platen og inkuber ved 37 °C i 15 min med mild risting. Vask deretter platen 3x med 300 μL vaskeløsning.
- Tilsett 100 μL av POD-konjugert anti-human-TAT antistoff til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved 37 °C i 15 min med mild risting. Vask deretter platen 3x med 300 μL vaskeløsning.
- Tilsett 100 μL av den nylagde kromogenløsningen til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 30 min.
- Fjern tetningsfilmen og tilsett 100 μL stoppløsning til hver brønn. Les den optiske tettheten (OD) med et fotometer på 490-500 nm. Tilpass standard kurvedataene som en trendlinje og beregn konsentrasjonen av prøvene.
10. Måling av PMN-elastase fra citratplasma
- Tin sitratplasmaet i et vannbad ved 37 °C.
- Bruk polymorfukleukleær (PMN)-elastase ELISA-settet i henhold til produsentens instruksjoner: rekonstruere PMN-elastase-kontrollen og PMN-elastase-standarden for å klargjøre en standardkurve ved hjelp av settets fortynningsbuffer.
- Fortynn vaskeløsningen i henhold til produsentens beskrivelse. La alle reagensene og mikrotiterplaten stå ved RT i 30 minutter før testen startes. Fortynn sitratplasmaprøvene til 1:100 med fortynningsbufferen.
- Tilsett 100 μL av prøvebufferen (tom), PMN-elastase standardkurve (15,6−1,000 ng/ ml), PMN-elastase kontroller (høye og lave konsentrasjoner), og fortynnet plasmaprøver i duplikater til brønnplaten. Forsegle platen og inkuber ved RT i 60 min med mild risting. Etterpå vasker du platen 4x med 300 μL vaskeløsning.
- Tilsett 150 μL av det enzymkonjugerte antistoffet til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 60 min med mild risting. Etterpå vasker du platen 4x med 300 μL vaskeløsning.
- Tilsett 200 μL av 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB)-substrat løsning til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 20 min i mørket. Fjern deretter tetningsfilmen og tilsett 50 μL av stoppløsningen til hver brønn.
- Les OD med et fotometer på 450 nm med referanseavlesning på 630 nm. Tilpass standard kurvedataene som en trendlinje og beregn konsentrasjonen av prøvene.
11. Måling av Terminal Complement Complex (TCC) fra EDTA Plasma
- Tin EDTA-plasmaet i et vannbad ved 37 °C, og oppbevar esi på is etter avriming.
- Bruk komplementet kaskade SC5b-9 ELISA kit i henhold til produsentens instruksjoner: fortynn vaskeløsningen som beskrevet i produsentens protokoll. La alle reagensene og mikrotiterplaten stå ved RT i 30 minutter før testen startes. Fortynn EDTA plasmaprøvene til 1:10 med settets fortynningsbuffer.
- Tilsett 300 μL vaskeløsning til hver brønn for å rehydrere overflaten og aspirer etter 2 min. Tilsett 100 μL av prøvebufferen (tom), SC5b-9-standarder, SC5b-9-kontroller (høye og lave konsentrasjoner), og de fortynnede plasmaprøvene i duplikater til brønnplaten.
- Forsegle platen og inkuber ved RT i 60 min. Deretter vasker du platen 5x med 300 μL vaskeløsning.
- Tilsett 50 μL av det enzymkonjugerte antistoffet til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 30 min. Vask deretter platen 5x med 300 μL vaskeløsning.
- Tilsett 100 μL av TMB-substratløsningen til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 15 min i mørket.
- Fjern tetningsfilmen og tilsett 100 μL av stoppløsningen til hver brønn. Les OD med et fotometer på 450 nm. Tilpass standard kurvedataene som en trendlinje og beregn konsentrasjonen av prøvene.
12. Måling av β-tromboglobulin fra CTAD Plasma
- Tin CTAD plasma i et vannbad ved 37 °C.
- Bruk β-tromboflebulin (β-TG) ELISA-settet i henhold til produsentens instruksjoner: rekonstruere β-TG-kontrollen og β-TG-standarden og fortynn vaskeløsningen ved hjelp av destillert H2O. Rekonstruere POD-konjugert antistoff ved hjelp av den medfølgende fosfatbufferen. La alle reagensene og mikrotiterplaten stå ved RT i 30 minutter før testen startes.
- Forbered standardkurven og kontrollen i henhold til produsentens instruksjoner med den medfølgende fosfatbufferen. Fortynn Plasmaprøvene for CTAD til 1:21.
- Tilsett 200 μL av fosfatbufferen (tom), β-TG-standarder, β-TG-kontroller (høye og lave konsentrasjoner), og fortynnet plasmaprøver i duplikater til brønnplaten. Forsegle platen og inkuber ved RT i 60 min. Etterpå vasker du platen 5x med 300 μL vaskeoppløsning.
- Tilsett 200 μL av det enzymkonjugerte antistoffet til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 60 min. Etterpå vasker du platen 5x med 300 μL vaskeoppløsning.
- Tilsett 200 μL av TMB-substratløsningen til hver brønn. Forsegle platen og inkuber ved RT i 5 min i mørket. Fjern tetningsfilmen og stopp reaksjonen ved å tilsett 50 μL av 1 M svovelsyre (H2SO4) til hver brønn.
- La platen stå i 15–60 min, og les deretter OD med et fotometer på 450 nm. Tilpass standard kurvedataene som en trendlinje og beregn konsentrasjonen av prøvene.
13. Prøveforberedelse for skanning av elektronmikroskopi
- Fjern implantatet fra røret ved hjelp av tang og skyll implantatet kort ved å dyppe det i 0,9% NaCl løsning 3x.
- Oppbevares i glutaraldehydoppløsning (2 % glutaraldehyd i fosfatbufret saltvann [PBS-buffer uten Ca2+/Mg2+]) over natten ved 4 °C.
- Deretter inkuberer implantatene i PBS-buffer i 10 min. Dehydrerprøvene ved å inkubere i etanol med økende konsentrasjon i 10 min hver: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%og 100%. Oppbevar de hydrerte prøvene i 100% etanol til videre analyse.
- Utfør kritisk punkttørking i henhold til instruksjonene fra tørkeenheten ellerlitteraturen 10 like før du skanner elektronmikroskopi (SEM).
14. Skanning elektron mikroskopi
- Fest de tørkede implantatene til en prøvebærer for skannemikroskopet og sputter prøvene med gullpalladium.
- Introduser de sputtered implantatene i prøvekammeret. Ta bilder i 100-, 500-, 1000- og 2500 ganger forstørrelse av områdene med den representative overflaten og cellevedhesjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort oppsummert, menneskelig fullblod ble samlet i heparin-lastet monovettes deretter samlet og brukes til å evaluere baseline nivåer av celletall samt plasmatiske hemokompatibilitet markører.
Deretter ble slangen som inneholdt de nevrovaskulære implantatprøvene fylt, og blodet ble perfundert i 60 min ved 150 ml/min og 37 °C ved bruk av peristaltisk pumpe. Igjen ble antall celler analysert i alle grupper, og plasmaprøvene ble utarbeidet for ELISA-analyser (figur 1). Kvantifiseringen av blodceller og blodparametre, som hemoglobin og hematokrit, ble utført direkte etter blodinnsamling, samt etter perfusjon i strømningssløyfemodellen for alle prøvetyper og kontrollen. Det ble ikke oppdaget endringer angående antall WBCer (figur 2A), RbCer (figur 2B) eller hematokritverdiene (figur 2C). En reduksjon i hemoglobinnivåer ble imidlertid påvist etter inkubasjon av blod i strømningssløyfemodellen sammenlignet med baselineverdiene, som skyldtes perfusjon av blod i strømningssløyfesystemet (figur 2D). I tillegg ble det observert en reduksjon i blodplatetall på grunn av blodperfusjon. Videre ble denne effekten økt når en ubestrøket stent var tilstede i slangen, noe som indikerer vedheft av blodplater til biomaterialet. Likevel ble det tydelig vist at tapet av blodplater var betydelig høyere når den ubestrøkede stenten ble inkubert med blod, i motsetning til den fibrin-heparinbelagte stent (Figur 2E).
Potensielle endringer av de hematologiske plasmamarkørene ble også undersøkt i testgruppene etter perfusjon og sammenlignet med baselineverdiene til det nytegnede blodet. TAT-kompleks konsentrasjon, som gjenspeiler aktiveringsstatusen til koagulasjonssystemet, ble mildt økt på grunn av blodperfusjon (figur 3A). I den nakne metallstentgruppen ble det imidlertid oppdaget en betydelig økning i TAT, noe som indikerer en dyp aktivering av koagulasjonssystemet. Den fibrin-heparinbelagte stent forhindret aktivering av koagulasjonssystemet, siden ingen økning i TAT ble bestemt.
Perfusjonen førte til økt aktivering av komplementkaskade, som ble bestemt ved måling av SC5b-9 (figur 3B). Inkubasjon med ubestrøkede eller fibrin-heparinbelagte stenter økte imidlertid ikke SC5b-9-konsentrasjonen ytterligere. Lignende resultater ble oppnådd ved analyse av aktiveringen av nøytrofile granulocytter gjennom kvantifisering av PMN-elastasekonsentrasjoner (figur 3C).
Visualisering av stentoverflaten ble utført ved hjelp av SEM. Klare forskjeller mellom de to stentgruppene ble oppdaget etter blodinkubasjon. Mens på overflaten av den ubestrøkede stent et tett nettverk av blodceller og proteiner var til stede, ble det ikke oppdaget noen vedhelang av proteiner eller celler på overflaten av fibrin-heparinbelagt stent (Figur 4).
Figur 1: Skjematisk oversikt over hemokompatibilitetsevalueringen av stenter i en veletablert flytsløyfemodell. Friskt menneskelig helblod samles inn fra friske donorer i blodrør som inneholder heparin for antikoagulasjon. For hver donor blir et tomt rør samt rør som er forhåndslastet med prøvematerialet, deretter fylt med friskt blod og inkubert i strømningssløyfen med en hastighet på 150 ml/min ved 37 °C i 60 min. I tillegg tilberedes plasmaprøver fra nytrukket blod for å oppnå baselineverdiene for hver donor. Etter inkubasjonen fremstilles og analyseres plasmaprøvene fra testslangen, med og uten prøvematerialer, ved hjelp av en bestemt ELISA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av ulike celletyper og blodparametere før og etter inkubasjon av forskjellige stentimplantater i strømningssløyfemodellen. Fastsettelse av hvite blodlegemer (A), røde blodlegemer (B), hematokrit (C), hemoglobin (D)og blodplater (E) ble utført. Dataene vises som gjennomsnitt ± SEM (n = 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemmelse av blodplate- eller immunsystemaktiveringsmarkører før og etter inkubasjon med nevrovaskulære implantater. Markørene for (A) aktivering av blodkoagulasjon (TAT), (B) komplementsystem (SC5b-9), og (C) nøytrofiler (PMN-elastase) ble kvantifisert ved hjelp av ELISA. Analysen ble utført på plasmaprøver oppnådd fra nytrukket blod eller blod inkubert med forskjellige stenter i strømningssløyfemodellen. Dataene vises som gjennomsnitt ± SEM (n = 5, p* < 0,5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skanne elektronmikroskopisk analyse av stenter etter inkubasjon med blod. Aggregeringen av blodplasmaproteiner og blodplater på ubestrøket stentmateriale ble observert. Til sammenligning viste stentmaterialer med fibrin-heparinbelegget ikke vedhesjon av celler eller andre blodkomponenter på overflaten (forstørrelse på 500-, 1000- og 2500 ganger). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver en omfattende og pålitelig metode for hemokompatibilitetstesting av blodkontaktimplantater i samsvar med ISO 10993-4 i en skjærstrømningsmodell som ettergir menneskelig blodstrøm. Denne studien er basert på testing av laserkuttede nevrovaskulære implantater, men kan utføres med en rekke prøver. Resultatene viser at denne metoden muliggjør bred analyse av ulike parametere som blodlegemer, utbredelsen av flere hemokompatibilitetsmarkører og mikroskopisk visualisering av enhetens overflate etter blodprøve. Ved hjelp av denne protokollen kan potensielle forskjeller angående hemokompatibilitet en annen enhet oppdages.
Et alternativ til in vitro hemokompatibilitet ser ut til å være in vivo dyretesting, som er forbundet med flere ulemper, for eksempel høyere variasjon og forvrengning av enhetsrelaterte effekter på grunn av de overveldende kortsiktige effektene av vevsskade6.
For in vitro hemokompatibilitetstesting er tre typer modeller tilgjengelige: (1) statiske blodinkubasjonsmodeller, (2) agiterte blodinkubasjonsmodeller og (3) skjærstrømningsmodeller. Den statiske modellen gir en enkel og rask metode for å bestemme trombogenitet ved å inkubere enheten direkte med blod, men det fører bare til rudimentære resultater angående hemokompatibilitet11. For å overvinne de viktigste ulempene ved statiske modeller (dvs. sedimentering av blodceller og den store luftkontaktoverflaten), kan den agitating blodinkubasjonsmodellen brukes, der et testkammer som inneholder implantatene er fylt med blod og ruges på en gyngeplattform12. Disse modelltypene er imidlertid fortsatt dårligere sammenlignet med de eksisterende skjærstrømningsmodellene, for eksempel strømningssløyfen som presenteres her. Kvintessensen av disse modellene er at vaskulær menneskelig blodstrøm kan imiteres; Dermed kan en nær skildring av den virkelige interaksjonen mellom implantatet og blodcellene vises13. I tillegg til flow loop-modellen finnes modeller som Chandler-sløyfen eller flere perfunderte strømningskammer14,15,16.
Chandler-sløyfen er et lukket rørsystem som delvis er fylt med luft og klemmes inn i en roterende enhet, noe som resulterer i blodsirkulasjon gjennom slangen17. I dagens strømningssløyfesystem er røret helt fylt med blod, og strømmen tvinges ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Når du bruker Chandler loop-modellen, står operatørene overfor to store ulemper på grunn av kravet om å inkludere luft inn i testslangen. For det første er det kjent at den konstante interaksjonen mellom blod og luft utløser aggregering av leukocytter og blodplater samt proteindenaturering18,19. For det andre er blodsirkulasjonsraten begrenset, fordi luften alltid forblir på det høyeste punktet i sløyfen20.
Disse ulempene kan overvinnes når du bruker strømningssløyfesystemet. Siden det ikke finnes luftvæskegrensesnitt i systemet, oppstår det ingen blodplateaktivering. Dermed har modellen en lav bakgrunn for trombotiske hendelser, slik at en lav konsentrasjon av antikoagulantia, vanligvis 1 IE / ml eller 1,5 IE / ml heparin, er tilstrekkelig til å forhindre koagulering, selv om høye strømningshastigheter brukes6. Den justerbare pumperegulerte blodstrømmen og den fritt valgbare rørdiameteren gjør det mulig for operatøren å etterligne de fysiologiske forholdene i en vene eller arterie, noe som tilsvarer implantatet som skal testes, og oppnå relevante testresultater21. Denne fordelen er imidlertid samtidig en begrensning, på grunn av det mekaniske stresset som påføres blodet gjennom pumpen, og ødeleggelsen av erytrocytter (dvs. hemolyse) kan forekomme2. Dette som oppstår indre blodskader reduserer metodens følsomhet og hindrer langvarig eksponering for blodet21. Likevel har flere studier vist effektiv bruk av flow loop-modellen for hemokompatibilitetsevaluering22,23,24.
Imidlertid inkluderer det viktigste gapet mellom alle in vitro-modeller og in vivo-mekanismene det manglende endotelet, som uttrykker cytokiner, antitrombotiske komponenter og vedhendemolekyler; Derfor spiller denne komponenten en avgjørende rolle i samspillet mellom implantatet og sirkulerende blod25. Til slutt er flow loop-modellen justerbar, effektiv, pålitelig og kostnadseffektiv for å vurdere hemokompatibiliteten til implantater før klinisk bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
For utførelsen av skanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den delen av Medical Materials Science and Technology ved Universitetssykehuset Tuebingen. Forskningen ble støttet av Departementet for utdanning, ungdom og sport i CR innenfor National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) og av Czech Science Foundation prosjekt Nr. 18-01163S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W.
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
