Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד

Published: March 8, 2020 doi: 10.3791/60612
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מסביר כיצד לאסוף נוירונים בודדים, microglia, ו אסטרוציטים מן הגרעין המרכזי של האמיגדלה עם דיוק גבוהה וספציפיות אנטומיים באמצעות לכידת לייזר מיקרוניתוח לכידה. בנוסף, אנו מסבירים את השימוש שלנו במיקרופלואידיג RT-qPCR כדי למדוד תת-קבוצה של התאים הללו.

Abstract

מעמיק טרוגניות tional בתאים בודדים מבחינה אנטומית מרמז כי הפונקציונליות רקמה חזקה ניתן להשיג על ידי הגיוון פנוטיפ הסלולר. ניסויים בתאים בודדים החוקרים את דינמיקת הרשת של מערכות ביולוגיות מדגימים תגובות תאית ורקמה לתנאים שונים ברזולוציה משמעותית ביולוגית. בזאת, נסביר את השיטות שלנו לאיסוף תאים בודדים ממיקומים ספציפיים מבחינה אנטומית ולמדידת מדויק של תת-ערכה של פרופילי הביטוי הגנטי שלהם. אנו משלבים לכידת לייזר מיקרודיסקציה (LCM) עם שעתוק מיקרופלואידיג הפוך תגובות פולימראז כמותיים (RT-qPCR). אנו משתמשים גם זה מיקרופלואידיק RT-qPCR פלטפורמה כדי למדוד את השפע של מיקרוביאלית של תכולת המעיים.

Introduction

מדידת פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים הפגינו טרוגניות פנוטימית נרחבת בתוך רקמה. מורכבות זו מסובכת את הבנתנו את הרשתות הביולוגי המפקחות על תפקוד הרקמה. הקבוצה שלנו ואחרים חקרו את התופעה הזאת ברקמות ובתנאים רבים1,2,3,4,5,6. ניסויים אלה לא רק להציע כי התקנה של רשתות ביטוי גנים ושתתות כזה, אלא גם כי ברזולוציה תא יחיד מגלה מורכבות בתפקוד רקמות כי ברמת רקמת הרזולוציה לא מעריכים. אכן, רק מיעוט קטן של תאים יכול להגיב למצב מסוים או אתגר, אבל ההשפעה של תאים אלה על הפיזיולוגיה הכללית עשוי להיות משמעותי. בנוסף, גישת ביולוגיה של המערכת החלה על שיטות מרובות לערכות נתונים ממדיות גבוהות מסוגי תאים מרובים ומרקמות שיכולות להבהיר אפקטי טיפול כלל-מערכתיים.

אנו משלבים LCM ו-microfluidic RT-qPCR כדי להשיג מערכות נתונים כאלה. אנו לוקחים את הגישה הזאת כאן בניגוד לאיסוף תאים בודדים באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) ובאמצעות רצפי RNA (RNA-seq) כדי למדוד את ההמרה שלהם. היתרון של LCM על FACS הוא כי הספציפיות האטומי של תאים בודדים יכול להיות מתועד עם LCM, יחסית ובהחלט. עוד, בעוד RNA-seq יכול למדוד יותר תכונות כי RT-qPCR, microfluidic RT-qPCR הוא פחות יקר ויש לו רגישות גבוהה יותר וספציפיות7.

בניסוי מייצג זה, חקרנו את ההשפעות של התלות באופטואיד והנסיגה נלוקסן-משיכה מגנטית על עצבי חולדה, microglia, וביטוי גנים אסטרוציט בגרעין המרכזי של האמיגדלה (מיקרומית) ושפע של הבטן המיקרופלורה4. ארבע קבוצות טיפול נותחו: 1) פלצבו, 2) מורפיום, 3) נלוקסן, ו-4) משיכה (איור 1). מצאנו כי התלות באופנואיד לא שינו באופן משמעותי את הביטוי הגנטי, אבל הנסיגה האופאידית הנגרמת ביטוי של גנים דלקתיים, Tnf בפרט. האסטרוציטים היו סוג התא המושפע ביותר. מיקרובידום הבטן היה מושפע עמוקות על ידי נסיגה מאופנואיד כפי שמצוין על ידי ירידה בתוך היחס בקטטואידים, שהוא מסמן מבוסס על הבטן בתפקוד8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נעשה בהתאם להמלצות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של אוניברסיטת תומס ג'פרסון, אוניברסיטת דרקסל המכללה לרפואה. הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת תומס ג'פרסון ואוניברסיטת דרקסל המכללה לרפואה IACUC.

1. דגם בעלי חיים

  1. הכנס 2 75 mg לשחרר לאט שחרור כדורי מורפיום סולפט או שתי כדורי פלצבו תת-עורי ב בוגרים זכר ספראג-דאולי.
    1. השתמש שמלה וכפפות בהתאם לניתוח סטרילי קטין. תגלח את העכברוש עם. קוצץ העכברושים במידת הצורך
    2. החלת משחה וטרינרית. על עיני החיה שאיפה החולדה עם כ -20. משאיפת האינהלציה הרדמה מאושרת. על-ידי אובדן הכרה
    3. לעשות חתך באמצע קו החולדה dorsum עם חרוז-מספריים קהה מעוקר ולהפריד את דרמיס מן הקיר הגוף עם חרוז-מעוקר לחקור. הכנס את כדורי מתחת דרמיס עם חרוז מלקחיים מעוקר. תפר את החתך סגור. עם מחט סטרילית
      הערה: ההליך כולו לוקח כ 5 דקות לכל חולדה. כפפות נקיות וטריות משמשות לכל חולדה.
    4. הציבו את העכברוש בכלוב. בידוד לצורך התאוששות מניתוח בדוק אם יש דופק. וקצב נשימה רגיל שימו לב לחולדה עד שתודעת התודעה תוחזר. . מעריך את הכאב שלאחר הניתוח
    5. להעריך את החולדות 8 שלאחר הניתוח ואת כל 12 h לאחר התאוששות וזיהום. מניחים חולדות בכלוב עם שאר הקבוצה כאשר הם התאושש לחלוטין מהניתוח, כ 24 הניתוח הפוסט.
  2. ניתן הזרקה נלוקסן הצפק (75 מ"ג/ק"ג) אל G והנסיגה הגדודים הבאים 6 ימים של חשיפת מורפיום.
    הערה: היו ארבעה כנופיית עכברושים בניסוי מייצג זה (ראה איור 1).

2. קצירת דוגמאות

  1. לקצור את המוח 6 ימים לאחר החדרת גלולה או 24 h לאחר הזרקת נלוקסן.
    1. מניחים את בעל החיים בחדר isof, במשך כ -30 ס מ, או עד אובדן התודעה, המצוין בחוסר תנועה וירידה בקצב הנשימה.
    2. השתמשו בגיליוטינה חדה כדי לערוף את ראשו של בעל החיים במהירות.
    3. . מנתח את המוח מהגולגולת של החיה
    4. השתמש בתער כף יד חדה כדי להפוך את החתכים הדוחים הבאים למוח שהוסר: ראשון, לחתוך את המוח החצי ולהשליך. שנית, הפרידו את גזע המוח מהמוח הקדמי עם חתך רוחבי. שלישית, הוא מטעה במוח הקדמי ו/או בגזע המוח עם חתך משונן באמצע הדרך.
    5. מניחים את המוח הקדמי ואת גזע המוח לתוך עובש פלסטיק להטבעת רקמה עם 3-4 ס מ של תרכובת הטמפרטורה אופטימלית (OCT) בחלק התחתון של העובש. לכסות את שאר המדגם עם OCT.
    6. מיד במקום העובש הטבעה רקמות פלסטיק עם המדגם מכוסה ב-OCT לתוך אמבטיה המכילה קרח יבש מתנול. אל תתנו מתנול לשפוך לתוך העובש להטביע את הרקמה. לשמור על עובש הטבעה עם דגימת המוח באמבט מתנול-ice עד אוסף הרקמה הוא סיים (~ 10-15 דקות מקסימום).
    7. מניחים את דגימת המוח למקפיא של 80 ° c בהקדם האפשרי.
  2. . לקצור את דגימות המעיים בו
    1. בעקבות עריפת הראש המהירה, הפוך את קו האמצע לחתך בבטנו של בעל החיים עם אזמל.
    2. מצא את המעי הגס ונתק את החיבור שלו לנקודתיים העולה.
    3. מחצי את התוכן הסרגי לשפופרת חרוט של 15 מ ל.
    4. מיד הניחו את צינור החרוט על קרח יבש והכניסו למקפיא של 80 ° c בהקדם האפשרי.
      הערה: ניתן לאסוף את תוכן המעי הדק גם באמצעות אותן שיטות כמו פקד שלילי.

שלוש פרוסות

  1. . באמצעות קריוסטט
    1. להסיר את העובש הטבעה פלסטיק עם המוח הקדמי של-80 מקפיא ° c ומקום לתוך 20 ° c בהקפאה.
    2. הסר את דגימת המוח המוזתית מדגם OCT מתבנית ההטבעה. השתמש תער כדי לחתוך את הפינות של עובש הטבעה פלסטיק אנכית במידת הצורך. הר המוח הקדמי עבור rostral כדי לחתוך את החיתוך על צ ' אק קריוסטט באמצעות OCT.
      הערה: מוקדי העניין האנטומיים לזיהוי הדמות כוללים את מערכת הראייה ומסוף הניסטריה (איור 2ב'). מערכת הראייה מסתעף מהראיה האופטית ועוקבת אחרי המוח לרוחב, כפי שהמוח מrostral לקידאל. כאשר במערכת האופטית יש מורפולוגיה דומה למה שנראה בתוך המוח החולדה אטלס ברסגמה-2.12 מ"מ10, פרוסות מבחן ניתן לראות תחת מיקרוסקופ. ניתן לבדוק את מורפולוגיה של מערכת הראייה והניסטריה במוח העכברוש10 כדי לזהות את הברגמה והאם היא מקיפה את מסופי הניסטריה.
    3. פרוסה 10 יקרומטר חלקים בעובי של מrostral המוח הקדמי המועבות עד caudal עד שסעיפים המכילים את האשמית מגיעים.
      הערה: הרוחב והגובה של הסעיפים הם כ 200 מ"מ.
    4. לאסוף 10 יקרומטר סעיפים המכילים את השמית, או את אזור המוח המועדף, על ידי הפשרת-הרכבה 10 יקרומטר סעיפים על שקופיות זכוכית רגיל. מיד הניחו את הזכוכית על תבנית מתכת הנשענת על קרח יבש. שימו את השקופיות עם מקטעי מוח לתוך מקפיא מ80 ° c בהקדם האפשרי.
      הערה: ניתן להציב פרוסות מרובות באותה שקופית. אם השימוש בכתם תא שונה לפרוסות באותה שקופית, השאר כ-100 מ"מ בין פרוסות כך שניתן יהיה להשתמש בעט הידרופובי כדי להפריד בין פתרונות נוגדנים ספציפיים לסוג תא בשקופית. השאר כ-20 מ"מ מקצה השקופית בכל צד של הפרוסה.

4. כתמים אימונולואונסנציה

  1. הכתם את סעיפים המוח הקדמי של תא המוח של בחירה (למשל, תא העצב, microglia, astrocyte, וכו ') באמצעות immunofluorescence.
    1. הסר שקופית אחת או יותר עם מקטעים של 10 יקרומטר מהמקפיא ב80 ° c.
    2. תקן את השקופיות עם 75% אתנול עבור 30 s. הסר את עודפי הנוזלים.
    3. לחסום את הפרוסות עבור 30 s עם 2% אנטיגן סרום שור (BSA) ב-1x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS). שטוף 1x עם PBS.
    4. הוסף פתרון נוגדן ראשי לשקופית עבור 2 דקות. שטוף 1x עם פתרון BSA של 2%.
      הערה: פתרון הנוגדן העיקרי מורכב 2% נוגדן ראשוני, 1% RNase Out, ו 96% של הפתרון BSA PBS אותו לשלב חסימת לעיל (שלב 4.1.3). הניסוי המייצג השתמש בנוגדן אנטי NeuN, נוגדן anti-Cd11β, ונוגדן אנטי GFAP בכמויות הבאות: 3 μL של הראשי, 1.88 μL של RNA מעכבי, ו 145.12 μL של פתרון BSA.
    5. הוסף את פתרון הנוגדן המשני לשקופית במשך 3 דקות. שטוף 1x עם PBS.
      הערה: הפתרון נוגדן משני מורכב 1 μL של עז נגד העכבר 488 ננומטר תג פלורסנט (1:500), 2.5 μL של מעכב RNA, 1.3 μL של DAPI (1:10000), ו-196.5 μL של 2% BSA.

5. האתנול וקסילן סדרת התייבשות

  1. טובלים את השקופיות לתוך 75% אתנול עבור 30 s. מיד לאחר מכן, לטבול את השקופיות ב 95% אתנול עבור 30 s. מיד לאחר מכן, טובלים את השקופיות לתוך 100% אתנול עבור 30 s. מיד לאחר מכן, טובלים את השקופיות לתוך מיכל שני המכיל 100% אתנול עבור 30 s.
  2. בעקבות סדרת התייבשות האתנול, טובלים את השקופיות לתוך הטריות שנשפכו במשך 1 דקות. מיד לאחר מכן, טובלים את השקופיות לתוך מיכל שני של קסילן במשך 4 דקות.
  3. הסירו את השקופיות מאמבט הקסילן והרשו לאוויר להתייבש בחשכה במשך 5 דקות.
  4. מקם את השקופיות בdesiccator למשך 5 דקות לייבוש.

6. לכידת לייזר מיקרוניתוח

  1. אם מוכתם, מניחים את השקופית לתוך המיקרוסקופ ומוצאים את אזור העניין (שמית) באמצעות ציוני דרך אנטומיים (כלומר, מסוף הראייה והניזליס).
  2. השתמש בקרינה פלואורסצנטית כדי לזהות את סוג התא המוכתם והגרעין שלו באזור הריבית. בחר תא אחד או תאים מרובים אם ביצוע דגימות של תא יחיד במאגר. סמן את תאי העניין באמצעות תוכנת LCM.
  3. הצב את כובע ה-LCM מעל הפרוסה באזור הריבית.
  4. השתמש בצילומי מבחן של לייזר אינפרא-אדום (IR) כדי לכוונן את עוצמת הלייזר, הגודל והמשך של IR כך שדבק המכסה של LCM נמס רק על פני התא היחיד שנבחר. הדבר מבטיח שתאים אחרים לא ייאספו מלבד התאים שנבחרו.
    הערה: בניסוי מייצג זה, 10 בריכות תאים מאותו סוג תא שימשו כמדגם אחד כדי להגביל את השונות התא לתאים בביטוי הגנים בין דגימות עם אותו טיפול. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטה זו עבור ניסויים תא בודד אמיתי1,3.
  5. בחר את התאים הבודדים שייאספו לצורך ניתוח באמצעות כלי התוכנה של LCM (איור 2ג). התאים הנבחרים חייבים להיות באזור האנטומי של השמית (או באזור המוח של הבחירה) על בסיס אטלס המוח העכברוש וברז10. תאים צריכים להיות לפחות 3 יקרומטר מן הגרעין המוכתמת הסמוכה.
  6. אש לייזר IR לאסוף את התאים היחידים שזוהו.
  7. הצב את המכסה בתחנת בקרת האיכות (QC) והצג אותה כדי לוודא שרק התאים הרצויים נבחרו. אם תאים אחרים נבחרו בטעות, לייזר אולטרה סגול ניתן להשתמש כדי להרוס את התאים לא רצויים בעוד כובע נשאר בתחנת ה-QC.
  8. קח תמונה של קטע הרקמה מהמקום שבו נאסף התא כדי לתעד את המיקום האטומי שלו. הקלט את מרחק הפרוסה מהגמה אם הדבר מתאים באמצעות אטלס המוח העכברוש כהפניה10.
  9. הסר את כובע ה-LCM מתחנת ה-QC, חבר את מכשיר החילוץ לדוגמה ופיפטה 5.5 μL של מאגר הליזה על המדגם.
    הערה: הפתרון של מאגר הליזה מורכב מ-0.5 μL של משפר הליזה ו-5 μL של מאגר מחדש.
  10. להתאים את המכשיר בטוח לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL ולשים על פלטה ב 75 ° c עבור 15 דקות.
  11. ספין למטה לדוגמה מאגר הליזה עבור 30 s במהירות נמוכה (0.01-0.02 x g) ומניחים את המדגם שנאסף לתוך a-80 ° c מקפיא.

7. תא בודד-מיקרופלואידיג RT-qPCR

  1. הגברה מראש של תא יחיד mRNA עבור 96.96 מערך דינאמי שבב
    1. שלב את הצבע הקדמי והאחורי של מאגר המידע של הגנים הקדמיים של המרכז לקבלת הגברה מראש (500 ננומטר לריכוז כל פריימר). לדוגמה, 1 μL של 100 μM התחל ב 80 μL פלוס 120 μL של מאגר ההשעיה של DNA.
      הערה: ניתן למצוא את הרצפים הפריימר המשמשים לניסוי הנציג ב-o ' סאליבן ואח '.4.
    2. בצלחת חדשה 96 x 96 PCR, להוסיף 1 μL של 5x VILO לכל טוב.
    3. הסרת LCM דגימות תא יחיד מן הדגימות המאוחסנות-80 ° c, לאפשר להפשיר בקצרה, צנטריפוגה בקצרה במהירות נמוכה (0.01-0.02 x g), ולהוסיף 5.5 μl של מדגם תא יחיד למטה לצלחת ה-PCR. כל דוגמא מתווספת לבאר שלו.
    4. מניחים את לוחית ה-PCR עם דגימות ו-VILO לתוך הטרטרטרנר וחום ב 65 ° c עבור 1.5 דקות. לסובב את הצלחת 1 דקות ב 1,300 x g ב 4 ° c ומניחים את הצלחת על הקרח.
    5. הוסף 0.15 μL של התמהיל הראשי של הסינתזה של 10x cDNA, 0.12 μL T4 ג'ין 32 חלבון, ו 0.73 μL של מאגר ההשעיה של DNA לכל טוב.
    6. הניחו את לוחית ה-PCR בתוך הציקלהטרטרנר והפעל את הפרוטוקול הבא: 25 ° c עבור 5 דקות, 50 ° צ' צלזיוס עבור 30 דקות, 55 ° c עבור 25 דקות, 60 ° צ' עבור 5 דקות, 70 ° c עבור 10 דקות, 4 ° צלזיוס עד הסוף.
    7. הוסף 7.5 μL של Taq פולימראז מיקס מאסטר לכל טוב.
    8. הוסף 1.5 μL של המאגר התחל (ראה לעיל) לכל טוב.
    9. הניחו את לוחית ה-PCR בציקלניה והפעל את הפרוטוקול הבא: 95 ° c למשך 10 דקות, ואחריו 22 מחזורים של 96 ° צ' עבור 5 שניות, 60 ° c עבור 4 דקות.
    10. הוסף 0.6 μL של אקסקלשכירות אני התגובה מאגר 10x, 1.2 μL שכירות I, ו 4.2 μL של מאגר ההשעיה של DNA לכל טוב.
    11. הניחו את לוחית ה-PCR בטרטרטררר והפעל את הפרוטוקול הבא: 37 ° c עבור 30 דקות, 80 ° צ' עבור 15 דקות.
    12. הוסף 54 μL של מאגר TE לכל טוב. לסובב את הצלחת ה-PCR ב 1,300 x g ב 5 דקות בחנות ב 4 ° צ' אם מייד ממשיך לשלב הבא. חנות ב-20 ° c אם ממתינים יותר מ-12 h לשלב הבא.
  2. הכן את הלוחית לדוגמה עבור שבב 96.96 מערך דינמי.
    1. ב חדש 96 היטב ה-PCR צלחת, להוסיף 0.45 μL של 20 x מאגד DNA לצבוע ו 4.55 μL של שילוב מאסטר רוקס נמוך לכל טוב.
    2. הוסף 3 μL של מדגם מוגבר לכל טוב, לסובב את הצלחת ה-PCR ב 1,300 x g, ואז לשים את הצלחת על הקרח.
  3. הכינו את לוח המידע לשבב המערך הדינאמי 96.96.
    1. ב חדש 96 היטב ה-PCR צלחת, להוסיף 3.75 μL של שיטת GE 2x הטעינה מגיב ו 1.25 μL של מאגר ההשעיה של ה-DNA לכל טוב.
    2. הוסף 2.5 μL של 10 μM התחל לכל אחד המתאים היטב. לסובב את הצלחת ה-PCR ב 1,300 x g עבור 5 דקות.
  4. לטעון ולהפעיל את 96.96 מערך דינמי שבב.
    1. . מראש את השבב עם נוזל שליטה
    2. מקם את השבב בבקר IFC HX והפעל את הסקריפט Prime (136X).
    3. הוסף 6 μL של המדגם מן הצלחת לדוגמה ה-PCR לתוך הבארות לדוגמה המתאימות 96.96 מערך דינמי שבב.
    4. הוסף 6 μL של המדגם מלוחית השיטת ה-PCR לתוך בארות השיטת המתאים ב-96.96 מערך דינאמי של שבב.
    5. השימוש מחטים פופ כל בועות אוויר בבארות של 96.96 מערך דינמי שבב.
    6. מניחים את 96.96 מערך דינמי שבב לתוך הבקר IFC HX ולהפעיל את הסקריפט טען Mix (136x).
    7. הסר את השבב מן IFC בקר HX, לקלף את המדבקה המגן, ולמקם את 96.96 מערך דינמי שבב לתוך מיקרופלואידיc RT-qPCR פלטפורמת. הפעל את GE Fast 96 x 96 PCR פרוטוקול (30 מחזורים).
      הערה: איכות ה-RNA ותוקפו של התוצאות מוערך על ידי שיטות מרובות, כולל אימות שיטה באמצעות אלקטרופורזה בג, עקומות בטמפרטורת ההיתוך, משכפל מדגם ושיטת שכפול, ומגרשים סטנדרטיים מסדרת דילול. בנוסף, ניתן לאמת את ממצאי ההמרה על-ידי שיטות עצמאיות בנוגע להדיית המוח, כולל אבן החשופה המערבית ומחיסולי האימונולוסנס.

8. מדידת השפע החיידקי עם מיקרופלואידיג RT-qPCR

  1. לחלץ את ה-DNA חיידקי בעקבות הכיוונים של הצואה שרפרף ערכת החילוץ.
  2. העריכו את הריכוז DNA חיידקי באמצעות qPCR.
  3. להוסיף את ה-DNA חיידקי מחולץ לצלחת חדש PCR. הוסף 1 μL של ה-DNA חיידקי שחולצו ו 9 μL של מאגר ההשעיה של DNA.
  4. הכן את צלחת ה7.2.1 של שבב המערך הדינאמי 48.48 (ראה שלבים-7.2.2)
  5. הכן את לוח המדגם עבור שבב 48.48 מערך דינאמי (ראה שלבים 7.3.1-7.3.2)
    1. בצלחת חדשה 96 היטב PCR, להוסיף 0.45 μL של 20 x מאגד DNA לצבוע ו 4.55 μL של שילוב מאסטר רוקס נמוך כדי 48 בארות.
    2. הוסף 3 μL של המדגם מלוחית ה-PCR המכילה את ה-DNA החיידקי לבארות 48 וסובב את הצלחת ה-PCR ב-1,300 x g עבור 5 דקות בחנות ב -4 ° c.
  6. טען והפעל את שבב 48.48 מערך דינאמי (ראה שלבים 7.4.1-7.4.7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבחר התאים היחידים אומת הן באופן חזותי והן מעגליות. באופן חזותי, מורפולוגיה סלולרית הוצג לפני איסוף התאים. תאים שנאספו לאחר מכן הנצפים בתחנת ה-QC ואת הכתם של גרעין הסלולר (DAPI) חופפים עם מסמן בחירת התא בודד הפלואורסצנטית. איור 2מראה תמונות מייצגות של שקופית עם ראש העכברוש המוחץ המכיל את הדמות. תמונות עוקבות (איור 2ב-D) מציגות את הבחירה של תאים בודדים והסרתם מהרקמה לניתוח טרנססקריפט. עם זאת, הסמנים הספציפיים לסוג התא הפגינו ביטוי מוגבר בסוג תא זה (איור 1ג). הסתכלנו על נוירונים, microglia, ו אסטרוציטים ומדדתי את הביטוי של neun, maf, ו gfap, בהתאמה. הנתונים פורסמו במקור באוסליבן ואח '4.

יתר על כן, הפקדים יכולים גם להיות מופעל בפלטפורמת microfluidic כדי לאמת את ממצאי הביטוי (למשל, ניתוח של אזורים אחרים של אותה רקמה להפגין הגרעין ספציפיות). ניתן גם להשוות רקמה נפרדת למדגם הרצוי כדי להדגים ספציפיות ברקמת הריבית. גנים שליטה חיוביים ושליליים ניתן לכלול גם (למשל, גנים הידועים להיות נעדרים מן הרקמה הנבחרת או ביטא מאוד). שלושה או ארבעה גנים שירות צריך להיכלל גם לא רק למטרות נורמליזציה נתונים אלא גם כמדד של איכות ניסיוני. גנים אלה צריכים להפגין את השונות הנמוכה ביותר בביטוי על פני כל הדגימות והטיפולים. בניסוי מייצג זה, לא היה אזור מוחי חלופי שהיה מיועד לשימוש, אבל הגנים הללו השתמשו ב- Ldha ובאקוטרה לנורמליזציה. שימוש בגנד שימש כפקד פנימי.

איור 3 מציג חלק מהשיטות הרב שבהן הקבוצה שלנו נהגה לנתח את הנתונים שלנו. מצאנו כי אסטרוציטים בקבוצת הנסיגה היו סוג התא המושפע ביותר. מבוסס על נתונים אלה בהקשר של מחקרים אחרים שאנו משערים כי אסטרוציטים לשחק תפקיד מפתח בדלקת בדמות במהלך נסיגה אופנואיד, וכי זה תורם לתסמינים הפיזיים והרגשיים הנוהגים לחפש סמים באמצעות חיזוק שלילי. כמו כן, אנו מראים את התחושה מיקרופלורה נתונים (איור 4).

Figure 1
איור 1: הפעלת תא בודדת-qPCR ומטרוגניות. (א) הפרוטוקול הניסיוני (n = 4 לכל תנאי) (ב) מדידה במאגר של עשרה תאים, מדידת ההמרה. (C) מגרש בר מציג ערכי ביטוי ΔΔCt-חציון. נוירונים = סגול; מיקרוגלייה = צהוב; אסטרוציטים = ירוק. קווי שגיאה מציגים שגיאה סטנדרטית. * p < 0.05, * * * p < 0.0003; . מבחן המשמעות הכנה של טוקי (ד) מפת החום מראה את הביטוי של כל הדגימות על פני הגנים 40 מאספי. שורות הם 10 תא דגימות במאגר (930 דגימות עצבי, 950 מיקרוגליאל דגימות, 840 אסטרוציט מסומנים); המספרים מציינות את האשכולות המדגם ואת העמודות הם הגנים. הדמות משתנה מאוסליבן ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לכידת לייזר תמונות מיקרודיסקציה. (א) ארבע פרוסות מראש חולדה מיובשת, המכילה את האישה בשקופית. פרוסות הושמו על השקופית בדיוק 10 יקרומטר מהפרוסה הקודמת. השמאל הוא הקדמי והימני הוא אחורי. המרחק מן הברגמה יכול להיות מוערך באמצעות אטלס מוח החולדה וציוני דרך, כולל מערכת האופטית ומסוף הניסטריה. (B-D) רצף התמונות המציג את הבחירה של תאים בודדים בתוך הבית (C) והסרתו מהרקמה (D). כמוסות LCM מרובות שימשו לבחירת תאים אלה. כובע אחד משמש לאיסוף 10 תאים מסוג תא אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות הנציגים 1. (א) תרשים מצויר של תא המציג את הגנים ומיקומם. סמלי הגן המסומנים כאן הם התייחסות ללוח B. (ב) הריבועים הצבעוניים מייצגים ביטוי גנים יחסיים (ערך חציון-ΔΔCt) עבור הגנים המיוצגים בלוח a. מיקום הריבועים מייצג את ההתאמה התאית או הפונקציה של החלבון המתאים. הלוחות מציגים את ביטוי הגנים היחסי המיוצג על-ידי צבע על-פני טיפולים וסוגי תאים. צהוב = ביטוי גבוה; כחול = ביטוי נמוך; לבן = ביטוי נייטרלי. הדמות משתנה מאוסליבן ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התוצאות הייצוגיות 2. (א) רשתות מתאםגנים. מתאם פירסון התבצע על ערכי-ΔΔCt בתוך טיפול וסוג תא. הצמתים מציינות את הגנים וצבעם מסמל את רמות הביטוי היחסיות (ערך החציון-ΔΔCt עבור כל אחד מהגנים). הקצוות מציינות יחסי ביטוי ועובי הביטוי מסמל את חוזק הקורלציה (ρ). מוצגים קשרים עם מ0.001 < ערך q. קצוות שחורים = קשרי מתאמים חיוביים; הקצוות הירוקים = יחסי גומלין שליליים. (ב) מגרשי בר של גנים נבחרים המפגינים ביטוי גנטי משמעותי. הסטטיסטיקות חושבו באמצעות מ#p מקונן ANOVA < 0.1, * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.0001 (n = 4 בעלי חיים עבור כל הטיפולים). הדמות משתנה מאוסליבן ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שפע המעיים של מיקרופלורה. מגרשים להציג את השפע היחסי של מינים חיידקיים (-ΔΔCt ערכים). #p < 0.1, * p < 0.05, * * p < 0.008, * * * p = 0.0009; ANOVA דו-כיוון; n = 4 בעלי חיים לכל טיפול. הדמות משתנה מאוסליבן ואח '4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ביולוגיה של תא בודד הוכיחה את טרוגניות של פנוטיפים סלולריים והחוסן של תפקוד רקמות. ממצאים אלה סיפקו תובנה לארגון של מערכות ביולוגיות בשני מאקרו ומיקרו קשקשים. כאן, אנו מתארים את השילוב של שתי שיטות, LCM ו-microfluidic qPCR, כדי להשיג תא בודד מדדים הטרנססקריפט המספקים הספציפיות האטומית ודיוק הטרנססקריפט בעלות נמוכה יחסית (איור 1). הקבוצה שלנו לוקח הגישה מערכות ביולוגיה ולעתים קרובות מודד רקמות מרובות באותה חיה. אנו מוצאים את השיטות הללו להיות גמישות ופוריות בקביעה כיצד מערכות ביולוגיות מגיבות לאתגרים שונים ברמה הטרנסספית. בנוסף, אנו משתמשים בשיטות אלה במיפוי אנטומי של פנוטיפים סלולריים בתנאים הבסיסיים.

אנו מספקים נתונים ואיורים ששונו מפרסום עדכני החוקרים כיצד התשובה מגיבה לתלות באופטואיד ולנסיגה4. בדוגמה זו, השתמשנו בפלטפורמת qPCR זהה מיקרופלואידיג כדי למדוד את השפע היחסי של מיקרופלורה המעיים. השיטות וזרימת העבודה מסוכמים באיור 1 ופורסמו במקור ב-o ' סאליבן et al.4. ממצאים עיקריים של מיקרופלואידים בתפוקה גבוהה RT-qPCR יכול להיות מאומת לאחר מכן על ידי מדדים חלבונים כגון כתמי מערבי או immunofluorescence4.

האתגר העיקרי של גישה זו מערכות ביולוגיה הוא קביעת מנגנונים ביולוגיים מסוימים ספציפיים. לוגיקה עמומה היא פתרון מאומת כי יש לנו לעבוד עם הצלחה להסיק סוכנים באופן הפעולה התקינה של הרשת גנים2. מניפולציה מודל בעלי חיים עשוי גם להיות מועסק כדי לספק תובנה מנגנונים מערכתית. לדוגמה, אותו פרוטוקול שסופק במסמך זה עם תוספת של מבנה חולדה עם כריתת קיבה וכלי בטן תניב נתונים המספקים תובנה לזרימת המידע דרך העצב התועה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

העבודה המוצגת כאן ממומנת באמצעות NIH HLB U01 HL133360 הוענק JS ו-RV, NIDA R21 DA036372 הוענק JS ו EVB, T32 AA-007463 הוענק יאן הוק תמיכה של SJO של.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-48.48 NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
GFAP Monoclonal Antibody ThermoFisher Scientific A-21294 Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A28175 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

Tags

גנטיקה סוגיה 157 הביטוי הגנטי התא בודד לכידת לייזר מיקרודיסקציה מיקרופלואידיג qPCR תלות באופטואיד היתר האטום האמיגדלה מיקרובידום בלייה
שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S.,… More

O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence. J. Vis. Exp. (157), e60612, doi:10.3791/60612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter