Summary
Denne protokollen forklarer hvordan man samler enkeltnevroner, mikroglia og astrocytter fra amygdalas sentrale kjerne med høy nøyaktighet og anatomisk spesifisitet ved hjelp av laserfangstmikrodisseksjon. I tillegg forklarer vi vår bruk av mikrofluidic RT-qPCR for å måle et undersett av transkripsjonen av disse cellene.
Abstract
Dyp transkripsjonsheterogenitet i anatomisk tilstøtende enkeltceller tyder på at robust vevsfunksjonalitet kan oppnås ved cellulær fenotypemangfold. Encellede eksperimenter som undersøker nettverksdynamikken i biologiske systemer viser cellulære og vevsresponser på ulike forhold ved biologisk meningsfull oppløsning. Her forklarer vi våre metoder for å samle enkeltceller fra anatomisk spesifikke steder og nøyaktig måle en undergruppe av deres genuttrykksprofiler. Vi kombinerer laserfangstmikrodisseksjon (LCM) med mikrofluidiske omvendttranskripsjon kvantitative polymerasekjedereaksjoner (RT-qPCR). Vi bruker også denne mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen til å måle mikrobiell overflod av tarminnhold.
Introduction
Måling av genuttrykksprofilene til enkeltceller har vist omfattende fenotypisk heterogenitet i et vev. Denne kompleksiteten har komplisert vår forståelse av de biologiske nettverkene som styrer vevsfunksjonen. Vår gruppe og andre har utforsket dette fenomenet i mange vev og forhold1,2,3,4,5,6. Disse eksperimentene antyder ikke bare at regulering av genuttrykksnettverk ligger til grunn for slik heterogenitet, men også at encellede oppløsning avslører en kompleksitet i vevsfunksjonen som vevsnivåoppløsning ikke klarer å sette pris på. Faktisk kan bare et lite mindretall av celler reagere på en bestemt tilstand eller utfordring, men virkningen av disse cellene på generell fysiologi kan være betydelig. I tillegg kan en systembiologitilnærming som bruker multivariatmetoder på høydimensjonale datasett fra flere celletyper og vev belyse behandlingseffekter for hele systemet.
Vi kombinerer LCM og mikrofluidic RT-qPCR for å få slike datasett. Vi tar denne tilnærmingen her i motsetning til å samle enkeltceller via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og ved hjelp av RNA-sekvensering (RNA-seq) for å måle transkripsjonen. Fordelen med LCM over FACS er at den nøyaktige anatomiske spesifisiteten til enkeltceller kan dokumenteres med LCM, relativt og absolutt. Videre, mens RNA-seq kan måle flere funksjoner som RT-qPCR, er mikrofluidic RT-qPCR billigere og har en høyere følsomhet og spesifisitet7.
I dette representative eksperimentet undersøkte vi effekten av opioidavhengighet og naltrekson-utfelt opioidtilbaketrekking på rottenevronal, microglia og astrocyttgenuttrykk i den sentrale kjernen i amygdala (CeA) og tarmmikrofloraoverflod4. Fire behandlingsgrupper ble analysert: 1) Placebo, 2) Morfin, 3) Naltrekson og 4) Seponering (figur 1). Vi fant at opioidavhengighet ikke vesentlig endret genuttrykk, men at opioidabstinens induserte uttrykket av inflammatoriske gener, spesielt Tnf. Astrocytter var den mest berørte celletypen. Tarmmikrobiomet ble dypt påvirket av opioidabstinens som indikert av en reduksjon i Firmicutes til Bacteroides ratio, som er en etablert markør for tarmdysbiose8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Thomas Jefferson University og Drexel University College of Medicine. Protokollen ble godkjent av Thomas Jefferson University og Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Dyremodell
- Sett inn to 75 mg morfinsulfinpellets med langsom frigjøring eller to placebopellets subkutant hos voksne mannlige Sprague-Dawley rotter.
- Bruk en kjole og hansker på riktig måte for mindre steril kirurgi. Barber rottedorsummed clippers om nødvendig.
- Påfør veterinærsalve på dyrets øyne. Bedøve rotten med ca. 20 s isofluran inhalasjon. Anestesi bekreftes ved bevissthetstap.
- Lag et mellomsnitt i rottedorsummed perlesterilisert stump saks og skill dermis fra kroppsveggen med en perlesterilisert sonde. Sett inn pellets under dermis med perlesteriliserte tang. Sutur snittet lukket med en steril nål.
MERK: Hele prosedyren tar ca 5 min per rotte. Ferske sterile hansker brukes til hver rotte. - Plasser rotten i et isolasjonsbur for postkirurgisk gjenoppretting. Se etter hjerteslag og vanlig respiratorisk rytme. Vær oppmerksom på rotten til bevisstheten er gjenvunnet. Vurder for postkirurgisk smerte.
- Vurder rotter 8 h postsurgery og hver 12 timer etter for utvinning og infeksjon. Plasser rotter i et bur med resten av kohorten når de er fullt ut restituert etter operasjonen, ca 24 h etter operasjonen.
- Gi en intraperitoneal naltreksoninjeksjon (75 mg/kg) til G- og abstinenskohortene etter 6 dager med morfineksponering.
MERK: Det var fire rottekohorter i dette representative eksperimentet (se figur 1).
2. Prøvehøsting
- Høst hjernen 6 dager etter pelletinnsettingen eller 24 timer etter naltreksoninjeksjonen.
- Plasser dyret i et isoflurankammer i ca. 30 s eller til bevissthetstap oppstår, indikert ved mangel på bevegelse og redusert respirasjonshastighet.
- Bruk en skarp giljotin til raskt å halshugge dyret.
- Dissekere hjernen ut fra dyrets skalle.
- Bruk en skarp håndholdt barberhøvel for å gjøre følgende grove snitt til den fjernede hjernen: Først skjær av lillehjernen og kast. For det andre, skill hjernestammen fra forhjernen med et tverrgående snitt. For det tredje, hemisect forhjernen og / eller brainstem med en midline sagittal snitt.
- Plasser forhjernen og hjernestammen i en plastvev-embedding mold med 3-4 cm optimal cutting temperatur sammensatte (OCT) i bunnen av formen. Dekk resten av prøven med OCT.
- Plasser umiddelbart plastvevsinnbyggingsformen med prøven dekket med OCT i et bad som inneholder tørris og metanol. Ikke la metanolsølet søle inn i vevsinnbyggingsformen. Hold innebyggingsformen med hjerneprøven i metanol-isbadet til vevssamlingen er ferdig (~ 10-15 min maksimum).
- Plasser hjerneprøven i en fryser på -80 °C så snart som mulig.
- Høst tarmprøvene samtidig.
- Etter rask halshugging, gjør et midtsive snitt i dyrets mage med en skalpell.
- Finn cecum og bryte sin forbindelse til stigende kolon.
- Klem cekalinnholdet inn i et 15 ml konisk rør.
- Plasser umiddelbart det koniske røret på tørris og legg i en -80 °C fryser så snart som mulig.
MERK: Innholdet i tynntarmen kan også samles inn ved hjelp av de samme metodene som en negativ kontroll.
3. Kutting
- Skjær den hemisected rotte forhjernen ved hjelp av en kryostat.
- Fjern plastinnbyggingsformen med forhjernen fra fryseren -80 °C og legg den i en kryostat på -20 °C.
- Fjern OCT-innebygd hemisected forebrain prøve fra innebygging mold. Bruk en barberhøvel til å skjære hjørnene av plastinnestøpingsformen vertikalt om nødvendig. Monter forhjernen for rostral til caudal koronar kutting på en kryostat chuck ved hjelp av OCT.
MERK: Anatomiske landemerker for å identifisere CeA inkluderer optisk epoke og striaterminalis (figur 2B). Optikkgrenene fra optisk chiasm og sporer dorsal-lateral som hjernen er skiver rosenrosentral til caudal. Når optikkkanalen har en morfologi som ligner på det som ses i et rottehjerneatlas bregma -2,12 mm10,kan testskiver ses under et mikroskop. Optisk kanal og stria terminalis morfologi kan kontrolleres i en rotte hjerne atlas10 for å identifisere bregma og om CeA omgir stria terminaler. - Skjær 10 μm tykke koronale seksjoner fra den hemisected forebrain rostral til caudal til seksjoner som inneholder CeA er nådd.
MERK: Bredden og høyden på seksjonene er ca. 200 mm. - Samle 10 μm seksjoner som inneholder CeA, eller den foretrukne hjerneregionen, ved å tine-montering 10 μm seksjoner på vanlig glass lysbilder. Plasser glassskliene umiddelbart på en metallpanne som hviler på tørris. Sett lysbildene med hjerneseksjoner i en -80 °C fryser så snart som mulig.
MERK: Flere stykker kan plasseres på samme lysbilde. Hvis du bruker en annen celletypeflekk for skiver på samme lysbilde, la ca 100 mm mellom skiver, slik at en hydrofobe penn kan brukes til å skille celletypespesifikke antistoffløsninger på lysbildet. La ca 20 mm fra kanten av lysbildet på hver side av skiven.
4. Immunfluorescensfarging
- Beis forhjerneseksjonene for den valgte hjernecellen (f.eks. nevron, mikroglia, astrocytt osv.) ved hjelp av immunfluorescens.
- Fjern ett eller flere lysbilder med 10 μm deler av CeA fra fryseren -80 °C.
- Fest lysbildene med 75% etanol i 30 s. Fjern overflødig væske.
- Blokker skivene i 30 s med 2% storfe serumantigen (BSA) i 1x fosfatbuffersaltvann (PBS). Vask 1x med PBS.
- Legg til en primær antistoffløsning på lysbildet i 2 min. Vask 1x med 2% BSA-løsning.
MERK: Den primære antistoffløsningen består av 2 % primærantistoff, 1 % RNase Out og 96 % av samme BSA PBS-løsning for blokkeringstrinnet ovenfor (trinn 4.1.3). Det representative eksperimentet brukte et anti-NeuN antistoff, et anti-Cd11β antistoff og et anti-GFAP antistoff i følgende mengder: 3 μL primær, 1,88 μL RNA-hemmer og 145,12 μL BSA-løsning. - Tilsett den sekundære antistoffoppløsningen på lysbildet i 3 min. Vask 1x med PBS.
MERK: Den sekundære antistoffoppløsningen består av 1 μL geitantimus 488 nm fluorescerende tag (1:500), 2,5 μL RNA-hemmer, 1,3 μL DAPI (1:10 000) og 196,5 μL av 2 % BSA.
5. Etanol og xylen dehydrering serien
- Dypp lysbildene i 75% etanol i 30 s. Umiddelbart etter, dypp lysbildene i 95% etanol i 30 s. Umiddelbart etter, dypp lysbildene i 100% etanol i 30 s. Umiddelbart etter, dypp lysbildene i en annen beholder som inneholder 100% etanol i 30 s.
- Etter etanol dehydrering serien, dypp lysbildene i nyhellede xylen i 1 min. Umiddelbart etter, dypp lysbildene i en annen beholder av xylen i 4 min.
- Fjern skliene fra xylenbadet og la luften tørke i mørket i 5 min.
- Plasser lysbildene i en tørkeobjekt i 5 min for å tørke videre.
6. Mikrodisseksjon for laserfangst
- Hvis det er farget, plasser lysbildet i mikroskopet og finn regionen av interesse (CeA) ved hjelp av anatomiske landemerker (dvs. optisk chiasm og stria terminalis).
- Bruk fluorescens for å identifisere den fargede celletypen og kjernen i regionen av interesse. Velg én celle eller flere celler hvis du gjør enkeltcelleutvalg. Merk cellene av interesse ved hjelp av LCM-programvare.
- Plasser LCM-hetten på toppen av skiven på interesseområdet.
- Bruk testbilder av en infrarød (IR) laser for å justere IR laserstyrke, størrelse og varighet slik at LCM cap limsmelter bare over området av den valgte enkeltcellen. Dette sikrer at ingen andre celler vil bli samlet inn annet enn cellene som er valgt.
MERK: I dette representative eksperimentet ble 10 cellepuljer av samme celletype brukt som en enkelt prøve for å begrense celle-til-celle-variabiliteten i genuttrykk mellom prøver med samme behandling. Denne metoden kan imidlertid brukes til ekte enkeltcelleeksperimenter1,3. - Velg de enkelte cellene som skal samles inn for analyse ved hjelp av LCM-programvareverktøy (figur 2C). Celler valgt må være i det anatomiske området av CeA (eller hjernen regionen av valget) basert på rotte hjernen atlas og bregma10. Celler bør være minst 3 μm fra de tilstøtende beiste kjerner.
- Brann IR laser for å samle de identifiserte enkeltceller.
- Plasser hetten i kvalitetskontrollstasjonen (QC) og vis den for å sikre at bare de ønskede cellene ble valgt. Hvis andre celler ble feilaktig valgt, kan en ultrafiolett laser brukes til å ødelegge uønskede celler mens hetten forblir i QC-stasjonen.
- Ta et bilde av vevsdelen fra der cellen ble samlet inn for å dokumentere sin anatomiske spesifisitet. Registrer avstanden til skiven fra bregma hvis det er hensiktsmessig ved hjelp av et rottehjerneatlas som referanse10.
- Fjern LCM-hetten fra QC-stasjonen, fest prøveavsugsenheten og pipette 5,5 μL lysisbuffer på prøven.
MERK: Lysisbufferløsningen består av 0,5 μL lyseforsterker og 5 μL resuspensjonsbuffer. - Monter ExtracSure enheten på et 0,5 ml mikrocentrifugerør og legg på en kokeplate ved 75 °C i 15 min.
- Senk ned prøve- og lysisbufferen i 30 s ved lav hastighet (0,01-0,02 x g)og plasser den innsamlede prøven i en fryser på -80 °C.
7. Mikrofluidic RT-qPCR med en celle
- Preamplification av enkeltcelle mRNA for 96.96 Dynamisk Array Chip
- Kombiner forover og omvendt mRNA qPCR genprimere for alle genene som blir analyset i et primerbasseng for preamplification (500 nM konsentrasjon hver primer). For eksempel 1 μL av 100 μM primere i 80 μL pluss 120 μL DNA-suspensjonbuffer.
MERK: Primersekvensene som brukes til det representative eksperimentet finnes i O'Sullivan et al.4. - I en ny 96 x 96 PCR-plate, tilsett 1 μL av 5x VILO til hver brønn.
- Fjern LCM enkeltcelleprøver fra prøvene som er lagret ved -80 °C, la tinkort, sentrifuge kort med lav hastighet (0,01-0,02 x g),og tilsett 5,5 μL av den lysed encellede prøven til PCR-platen. Hver prøve legges til sin egen brønn.
- Plasser PCR-platen med prøvene og VILO i termocycleren og varm ved 65 °C i 1,5 min. Senk platen i 1 min ved 1300 x g ved 4 °C og plasser platen på is.
- Tilsett 0,15 μL av 10x cDNA-syntesemasterblanding, 0,12 μL T4 Gen 32-protein og 0,73 μL DNA-suspensjonsbuffer til hver brønn.
- Plasser PCR-platen i termocycleren og kjør følgende protokoll: 25 °C i 5 min, 50 °C i 30 min, 55 °C i 25 min, 60 °C i 5 min, 70 °C i 10 min, 4 °C til slutt.
- Tilsett 7,5 μL Taq polymerase master mix til hver brønn.
- Tilsett 1,5 μL av primerbassenget (se ovenfor) til hver brønn.
- Plasser PCR-platen i termocycleren og kjør følgende preampliiseringsprotokoll: 95 °C i 10 min, etterfulgt av 22 sykluser på 96 °C i 5 sek, 60 °C i 4 min.
- Tilsett 0,6 μL exonuclease I reaksjonsbuffer 10x, 1,2 μL exonuclease I og 4,2 μL DNA-suspensjonsbuffer til hver brønn.
- Plasser PCR-platen i termocycleren og kjør følgende protokoll: 37 °C i 30 min, 80 °C i 15 min.
- Tilsett 54 μL TE-buffer til hver brønn. Senk PCR-platen ved 1300 x g ved 5 min. Oppbevares ved 4 °C hvis neste trinn fortsetter til neste trinn. Oppbevares ved -20 °C hvis du venter mer enn 12 timer på neste trinn.
- Kombiner forover og omvendt mRNA qPCR genprimere for alle genene som blir analyset i et primerbasseng for preamplification (500 nM konsentrasjon hver primer). For eksempel 1 μL av 100 μM primere i 80 μL pluss 120 μL DNA-suspensjonbuffer.
- Klargjør prøveplaten for 96.96 Dynamic Array Chip.
- I en ny 96-brønn PCR-plate tilsett 0,45 μL 20x DNA-bindingssett og 4,55 μL lav ROX mastermix til hver brønn.
- Tilsett 3 μL forforsterket prøve til hver brønn, sentric PCR-platen på 1300 x g, og legg deretter platen på is.
- Klargjør analyseplaten for 96.96 Dynamic Array Chip.
- I en ny 96-brønn PCR-plate tilsett 3,75 μL av 2x GE-analyselastreagens og 1,25 μL DNA-suspensjonsbuffer til hver brønn.
- Tilsett 2,5 μL av 10 μM qPCR primer til hver tilsvarende brønn. Snurr PCR-platen på 1300 x g i 5 min.
- Last inn og kjør 96.96 Dynamic Array Chip.
- Prime brikken med kontrolllinje væske.
- Plasser brikken i en IFC Controller HX og kjør Prime (136X)-skriptet.
- Tilsett 6 μL av prøven fra PCR-prøveplaten i de tilsvarende prøvebrønnene i 96.96 Dynamic Array Chip.
- Tilsett 6 μL av prøven fra PCR-analyseplaten i de tilsvarende analysebrønnene i 96.96 Dynamic Array Chip.
- Bruk nåler til å pop noen luftbobler i brønnene til 96.96 Dynamic Array Chip.
- Plasser 96.96 Dynamic Array Chip i IFC Controller HX, og kjør skriptet Load Mix (136x).
- Fjern brikken fra IFC Controller HX, fjern beskyttelsesklistremerket og plasser 96.96 Dynamic Array Chip i en mikrofluidisk RT-qPCR-plattform. Kjør GE Fast 96 x 96 PCR-protokollen (30 sykluser).
MERK: RNA-kvaliteten og gyldigheten av resultatene vurderes ved flere metoder, inkludert analysevalidering via gelelektroforese, smeltetemperaturkurver, prøve- og analysereplikater og standard fortynningsserieplott. I tillegg kan transkripsjonelle funn valideres ved uavhengige metoder på hjernehemiseksjon, inkludert vestlige blot og immunofluorescensanalyser.
8. Måle bakteriell overflod med mikrofluidic RT-qPCR
- Trekk ut bakterie-DNA etter instruksjonene i avføringens DNA-ekstraksjonssett.
- Estimer bakteriell DNA-konsentrasjon ved hjelp av qPCR.
- Tilsett det ekstraherte bakterielle DNA-et til en ny PCR-plate. Tilsett 1 μL ekstrahert bakteriell DNA og 9 μL DNA-suspensjonsbuffer.
- Klargjør analyseplaten for 48.48 Dynamic Array Chip (se trinn 7.2.1-7.2.2)
- Klargjør prøveplaten for 48.48 Dynamic Array Chip (se trinn 7.3.1-7.3.2)
- I en ny 96-brønn PCR-plate tilsett 0,45 μL 20x DNA-bindingsvann og 4,55 μL lav ROX mastermix til 48 brønner.
- Tilsett 3 μL av prøven fra PCR-platen som inneholder bakteriell DNA til de 48 brønnene og snurr ned PCR-platen ved 1300 x g i 5 min. Oppbevares ved 4 °C.
- Last inn og kjør 48.48 Dynamic Array Chip (se trinn 7.4.1-7.4.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Valget av enkeltcellene ble validert både visuelt og molekylært. Visuelt ble cellulær morfologi vist før cellesamling. Celler samlet ble deretter sett på QC-stasjonen og cellulære kjerner flekken (DAPI) overlappet med encellede markeringsmarkør fluorescens. Figur 2A viser representative bilder av et lysbilde med hemisected rotte forhjerne som inneholder CeA. Etterfølgende bilder (Figur 2B-D) viser valg av enkeltceller og fjerning fra vevet for transkripsjonsanalyse. Molekylært viste celletypespesifikke markører økt uttrykk i den celletypen (figur 1C). Vi så på nevroner, mikroglia og astrocytter og målte uttrykket av Henholdsvis NeuN, Mafog Gfap. Tallene ble opprinnelig publisert i O'Sullivan et al.4.
Videre kan kontroller også kjøres i den mikrofluidiske plattformen for å validere uttrykksfunnene (f.eks. analyse av andre områder av samme vev for å demonstrere kjernespesifisitet). Et eget vev kan også sammenlignes med den ønskede prøven for å demonstrere primer spesifisitet i vevet av interesse. Positive og negative kontrollgener kan også inkluderes (f.eks. gener som er kjent for å enten være fraværende fra det valgte vevet eller uttrykkes høyt). Tre eller fire rengjøringsgener bør også inkluderes ikke bare for datanormaliseringsformål, men også som et mål på eksperimentell kvalitet. Disse genene bør vise den laveste variansen i uttrykk på tvers av alle prøver og behandlinger. I dette representative eksperimentet ble ingen alternativ hjerneregion analysen, men rengjøringsgener Ldha og Actb ble brukt til normalisering. Gapdh ble brukt som en internkontroll.
Figur 3 viser noen av multivariatmetodene gruppen vår brukte til å analysere dataene våre. Vi fant ut at astrocytter i uttaksgruppen var den mest berørte celletypen. Basert på disse dataene i sammenheng med andre studier spekulerer vi i at astrocytter spiller en nøkkelrolle i betennelse i CeA under opioidabstinens, og at dette bidrar til de fysiske og følelsesmessige symptomene som driver narkotikasøkende via negativ forsterkning. Vi viser også tarmmikrofloradataene (Figur 4).
Figur 1: Encellede RT-qPCR-arbeidsflyt og transkripsjonsheterogenitet. (A) Eksperimentell protokoll (n = 4 for hver tilstand) (B) Ti-celle pooled prøve transkripsjonsmåling. (C) Linjeplott viser median -ΔΔCt uttrykksverdier. Nevroner = lilla; microglia = gul; astrocytter = grønn. Feilfelt viser standardfeil. *p < 0,05, ***p < 0,0003; Tukeys ærlige betydningstest. (D) Varmekartet viser uttrykket for alle prøver over 40 analysegener. Rader er 10-celle pooled prøver (930 nevronale prøver, 950 mikrogliale prøver, 840 astrocyttprøver som denoted); tallene betegner eksempelklyngene, og kolonnene er genene. Tallet er endret fra O'Sullivan et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Laser fange mikrodisseksjon bilder. (A) Fire skiver dehydrert hemisected rotte forhjerne som inneholder CeA på et lysbilde. Skiver ble plassert på lysbildet nøyaktig 10 μm fra forrige skive. Venstre er fremre og høyre er bakre. Avstanden fra bregma kan estimeres ved hjelp av en rotte hjerne atlas og landemerker, inkludert optisk kanal og stria terminalis. - Jeg har ikke noe åsi. Sekvens av bilder som viser valg av enkeltceller i CeA (C) og deres fjerning fra vevet (D). Flere LCM caps ble brukt til å velge disse cellene. En hette brukes til å plukke 10 celler av en celletype. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater 1. (A) En tegneserie skjematisk av en celle som viser genene som er bedømt og deres plassering. Gensymbolene som er merket her er en referanse for panel B. (B) De fargede firkantene representerer relativ genuttrykk (median -ΔΔCt-verdi) for genene som er representert i panel A. Plasseringen av rutene representerer cellulær lokalisering eller funksjon av det tilsvarende proteinet. Panelene viser det relative genuttrykket representert av farge på tvers av behandlinger og celletyper. Gul = høy uttrykk; blå = lavt uttrykk; hvit = nøytralt uttrykk. Tallet er endret fra O'Sullivan et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater 2. (A) Genkorrelasjonsnettverk. Pearson korrelasjon ble utført på -ΔΔCt verdier innenfor en behandling og celletype. Nodene betegner genene og deres farge betyr de relative uttrykksnivåene (median -ΔΔCt-verdien for hvert gen). Kantene betegner uttrykkskorrelasjoner og tykkelsen betyr styrken på uttrykkskorrelasjonen (ρ). Korrelasjoner med en q-verdi <0.001 vises. Svarte kanter = positive korrelasjoner; grønne kanter = negative korrelasjoner. (B) Bar tomter av utvalgte gener som viser betydelig differensial genuttrykk. Statistikken ble beregnet ved hjelp av nestede ANOVA #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001 (n = 4 dyr for alle behandlinger). Tallet er endret fra O'Sullivan et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Relativ overflod av tarmmikroflora. Barplots viser den relative overflod av bakterielle arter (-ΔΔCt verdier). #p < 0.1, *p < 0,05, **p < 0,008, ***p = 0,0009; toveis ANOVA; n = 4 dyr for hver behandling. Tallet er endret fra O'Sullivan et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encellede biologi har vist heterogeniteten av cellulære fenotyper og robusthet av vevsfunksjon. Disse funnene har gitt innsikt i organiseringen av biologiske systemer på både makro- og mikroskalaer. Her beskriver vi kombinasjonen av to metoder, LCM og mikrofluidic qPCR, for å oppnå encellede transkripsjonstiltak som gir anatomisk spesifisitet og transkripsjonsnøyaktighet til en relativt lav pris (figur 1). Vår gruppe tar en systembiologi tilnærming og måler ofte flere vev i samme dyr. Vi finner disse metodene for å være både fleksible og fruktbare når det gjelder å avgjøre hvordan biologiske systemer reagerer på ulike utfordringer på transkripsjonsnivå. I tillegg bruker vi disse metodene i anatomisk kartlegging av cellulære fenotyper i baseline forhold.
Vi gir data og modifiserte tall fra en nylig publikasjon som utforsker hvordan CeA reagerer på opioidavhengighet og tilbaketrekking4. I dette eksemplet brukte vi den samme mikrofluidiske qPCR-plattformen for å måle den relative overfloden av tarmmikrofloraen. Metodene og arbeidsflyten er oppsummert i figur 1 og ble opprinnelig publisert i O'Sullivan et al.4. Store funn fra mikrofluidic RT-qPCR med høy gjennomstrømning kan senere valideres ved proteintiltak som vestlig blot eller immunfluorescens4.
En stor utfordring med denne systembiologitilnærmingen er å bestemme spesifikke årsaksbiologiske mekanismer. Fuzzy logikk er en validert løsning som vi har ansatt med suksess for å utlede agenter i genregulatorisk nettverksatferd2. Manipulering av dyremodeller kan også brukes til å gi innsikt i systemiske mekanismer. For eksempel vil den samme protokollen som er gitt her, med tillegg av en rottekohort med magevagotomy gi data som gir innsikt i informasjonsflyten via vagusnerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbeidet som presenteres her ble finansiert gjennom NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, og T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
