Summary
Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.
Abstract
Anatomik olarak komşu tek hücrelerde derin transkripsiyonel heterojenlik, hücresel fenotip çeşitliliği ile sağlam doku işlevselliğinin sağlanabileceğini düşündürmektedir. Biyolojik sistemlerin ağ dinamiklerini araştıran tek hücreli deneyler, biyolojik olarak anlamlı çözünürlükte çeşitli koşullara hücresel ve doku tepkilerini göstermektedir. Burada, anatomik olarak belirli yerlerden tek hücre toplama ve gen ekspresyonu profillerinin bir alt kümesini doğru bir şekilde ölçme yöntemlerimizi açıklıyoruz. Lazer yakalama mikrodizsikimi (LCM) ile mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonlarını (RT-qPCR) birleştiriyoruz. Ayrıca bağırsak içeriğinin mikrobiyal bolluğunu ölçmek için bu mikroakışkan RT-qPCR platformlarını kullanıyoruz.
Introduction
Tek hücrelerin gen ekspresyonu profillerinin ölçülmesi doku içinde kapsamlı henotibik heterojenite göstermiştir. Bu karmaşıklık doku fonksiyonlarını yöneten biyolojik ağları anlamamızı karmaşık hale getirmiştir. Grubumuz ve diğerleri birçok doku ve koşullarda bu fenomeni araştırdık1,2,3,4,5,6. Bu deneyler sadece gen ekspresyonu ağlarının düzenlenmesinin bu tür heterojenliğin altında yattığını değil, aynı zamanda tek hücreli çözünürlüğün doku düzeyinde çözünürlüğün takdir edemediği doku fonksiyonunda bir karmaşıklığı ortaya koyduğunu da göstermektedir. Gerçekten de, hücrelerin sadece küçük bir azınlık belirli bir durum veya meydan yanıt verebilir, ancak genel fizyoloji si bu hücrelerin etkisi önemli olabilir. Ayrıca, birden fazla hücre tipi ve dokulardan gelen yüksek boyutlu veri kümelerine çok değişkenli yöntemler uygulayan bir sistem biyolojisi yaklaşımı, sistem genelinde ki tedavi etkilerini açıklayabilir.
Bu tür veri kümelerini elde etmek için LCM ve mikroakışkan RT-qPCR'ı birleştiriyoruz. Burada floresan aktive hücre sıralama (FACS) yoluyla tek hücre toplama ve transkripsiyon ölçmek için RNA sıralama (RNA-seq) kullanarak aksine bu yaklaşımı almak. LCM'nin FACS'a göre avantajı, tek hücrelerin kesin anatomik özgüllüğünün LCM ile nispeten ve kesinlikle belgelenebilmiş olmasıdır. Ayrıca, RNA-seq rt-qPCR, mikroakışkan RT-qPCR daha az pahalı ve daha yüksek bir duyarlılık ve özgüllük7sahip daha fazla özellikleri ölçebilir iken .
Bu temsili deneyde, opioid bağımlılığı ve naltrekson-çökelmiş opioid çekilmesinin sıçan nöronal, mikroglia ve astrosit gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırdık. Dört tedavi grubu analiz edildi: 1) Plasebo, 2) Morfin, 3) Naltrekson ve 4) Çekilme(Şekil 1). Opioid bağımlılığının gen ekspresyonunu önemli ölçüde değiştirmediğini, ancak opioid yoksunluğu özellikle Tnf olmak üzere inflamatuar genlerin ekspresyonunu tetiklediğini bulduk. Astrositler en çok etkilenen hücre tipiydi. Bağırsak mikrobiyomu derinden opioid çekilmesi tarafından bteroides oranı Firmicutes bir azalma ile belirtildiği gibi etkilenmiştir, hangi bağırsak dysbiosis kurulan bir belirteçtir8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Thomas Jefferson Üniversitesi ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) önerileri doğrultusunda yapılmıştır. Protokol Thomas Jefferson Üniversitesi ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi IACUC tarafından onaylandı.
1. Hayvan modeli
- Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarında deri altı iki 75 mg yavaş salınımlı morfin sülfat pelet veya iki plasebo pelet takın.
- Küçük steril cerrahi için uygun bir elbise ve eldiven kullanın. Gerekirse makas ile sıçan dorsum tıraş.
- Hayvanın gözlerine veteriner merhemi uygulayın. Yaklaşık 20 s isofluran emdirme ile sıçan anestezi. Anestezi bilinç kaybı ile doğrulanır.
- Boncuk sterilize künt makas ile sıçan dorsum bir orta hat kesi yapmak ve boncuk sterilize sonda ile vücut duvarından dermis ayırın. Boncuk sterilize forceps ile dermis altında pelet yerleştirin. Kesi steril bir iğne ile kapatılmıştır.
NOT: Tüm işlem sıçan başına yaklaşık 5 dakika sürer. Taze steril eldiven her sıçan için kullanılır. - Ameliyat sonrası iyileşme için fareyi izolasyon kafesine yerleştirin. Kalp atışı ve düzenli solunum ritmi olup yok. Bilinç geri kazanılına kadar fareyi gözlemleyin. Ameliyat sonrası ağrıları değerlendirin.
- Sıçanları 8 saat ameliyat sonrası ve her 12 saat sonra iyileşme ve enfeksiyon için değerlendirin. Onlar tam olarak ameliyattan sonra, yaklaşık 24 saat sonra kurtarıldı zaman kohort geri kalanı ile bir kafese sıçan yerleştirin.
- 6 gün morfin maruziyetini takiben G ve Çekilme kohortlarına intraperitoneal naltrekson enjeksiyonu (75 mg/kg) verin.
NOT: Bu temsili deneyde dört fare kohortları vardı (Bkz. Şekil 1).
2. Örnek hasat
- Pelet insanından 6 gün sonra veya naltrekson enjeksiyonundan sonra 24 saat sonra beyni hasat edin.
- Yaklaşık 30 s için bir isoflurane odasına hayvan yerleştirin veya bilinç kaybı meydana gelene kadar, hareket eksikliği ve solunum hızı azalmış gösterilir.
- Hızla hayvan ın kafasını kesmek için keskin bir giyotin kullanın.
- Beynini hayvanın kafatasından çıkar.
- Çıkarılan beyne aşağıdaki brüt kesileri yapmak için keskin bir el jilet kullanın: İlk olarak, beyincik kesi ve atın. İkincisi, beyin sapını ön beyinden enine bir kesi ile ayırın. Üçüncü olarak, hemisect forebrain ve / veya beyin sapı bir orta hat sagittal kesi ile.
- Ön beyin ve beyin sapını, kalıbın alt kısmında 3-4 cm Optimum Kesme Sıcaklığı bileşiği (OCT) içeren plastik bir doku gömme kalıbına yerleştirin. Numunenin geri kalanını OCT ile kaplayın.
- Hemen kuru buz ve metanol içeren bir banyo içine OCT ile kaplı örnek ile plastik doku gömme kalıp yerleştirin. Metanolün doku katıştırma kalıbına dökülmesine izin vermeyin. Doku toplama (~ 10-15 dk maksimum) bitene kadar metanol-buz banyosunda beyin örneği ile gömme kalıp tutun.
- Beyin örneğini mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
- Bağırsak örneklerini aynı anda topla.
- Hızlı decapitation sonra, bir neşter ile hayvanın karnında bir orta hat kesi yapmak.
- Çekiyi bulun ve artan kolonla bağlantısını kes.
- Cecal içeriğini 15 mL konik bir tüpe sıkıştırın.
- Konik tüpü hemen kuru buzüzerine yerleştirin ve mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
NOT: İnce bağırsak içeriği de negatif kontrol ile aynı yöntemlerle toplanabilir.
3. Dilimleme
- Bir kriyostat kullanarak hemisected sıçan ön beynini dilimleyin.
- -80 °C'lik dondurucudan ön beyinli plastik gömme kalıbını çıkarın ve -20 °C kriyostat'a yerleştirin.
- OkT gömülü hemisected ön beyin örneğini katıştırma kalıbından çıkarın. Gerekirse plastik gömme kalıbının köşelerini dikey olarak dilimlemek için bir jilet kullanın. EKIM kullanarak bir kriyostat chuck üzerinde kaudal koronal dilimleme rostral için ön beyin Monte.
NOT: CeA'yı tanımlamak için anatomik işaretler optik sistem ve stria terminalis(Şekil 2B)içerir. Optik kiazma optik sistem dalları ve beyin kaudal rostral dilimlenmiş olarak dorsal-lateral izler. Optik sistem bir sıçan beyin atlas bregma -2.12 mm10görülen benzer bir morfolojiye sahip olduğunda, test dilimleri bir mikroskop altında görülebilir. Optik sistem ve stria terminalis morfolojisi bregma ve CeA stria terminalleri çevreleyen olup olmadığını belirlemek için bir sıçan beyinatlası 10 kontrol edilebilir. - CeA içeren bölümlere ulaşılıncaya kadar hemisected ön beyin rostral'den kaudal kesitlerden 10 μm kalınlığında koronal kesitler.
NOT: Bölümlerin genişliği ve yüksekliği yaklaşık 200 mm'dir. - Düz cam slaytlar üzerine 10 μm kesitleri eriterek CeA veya tercih edilen beyin bölgesini içeren 10 μm'lik bölümleri toplayın. Cam slaytları hemen kuru buz üzerinde kalan metal bir tavaya yerleştirin. Beyin kesitli slaytları mümkün olan en kısa sürede -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
NOT: Aynı slayta birden fazla dilim yerleştirilebilir. Aynı slayttaki dilimler için farklı bir hücre tipi leke kullanıyorsanız, dilimler arasında yaklaşık 100 mm bırakın, böylece bir hidrofobik kalem slayttaki hücre tipine özgü antikor çözümlerini ayırmak için kullanılabilir. Dilimin her iki tarafında salının kenarından yaklaşık 20 mm bırakın.
4. İmmünofluoresan boyama
- İmmünfloresans kullanarak beyin hücresi (örn. nöron, mikroglia, astrosit vb.) için ön beyin bölümlerini lekeleyin.
- -80 °C'lik dondurucudan CeA'nın 10 μm'lik kesitli bir veya daha fazla kaydırağı çıkarın.
- Slaytları 30 s. Fazla sıvıyı çıkarın% 75 etanol ile düzeltin.
- Dilimleri %2 büyükbaş serum antijeni (BSA) ile 1x fosfat tampon salininde (PBS) 30 s'lik olarak bloke edin. PBS ile 1x yıkayın.
- 2 dk. %2 BSA çözeltisi ile 1x yıkayın için slayta birincil antikor çözeltisi ekleyin.
NOT: Primer antikor çözeltisi % 2 primer antikor, %1 RNase Out ve yukarıdaki engelleme adımı için aynı BSA PBS çözeltisinin %96'sı (adım 4.1.3) oluşur. Temsili deneyde aşağıdaki miktarlarda bir anti-NeuN antikor, bir anti-Cd11β antikor ve bir anti-GFAP antikor kullanılmıştır: 3 μL primer, 1.88 μL RNA inhibitörü ve 145.12 μL BSA çözeltisi. - 3 dk. PBS ile 1x yıkayın için slayt ikincil antikor çözeltisi ekleyin.
NOT: Sekonder antikor çözeltisi 1 μL keçi anti-mouse 488 nm floresan etiketi (1:500), 2.5 μL RNA inhibitörü, 1.3 μL DAPI (1:10.000) ve 196.5 μL 2% BSA oluşur.
5. Etanol ve ksilen dehidratasyon serisi
- 30 s. Hemen sonra% 75 etanol içine slaytlar daldırma, 30 s. Hemen sonra% 95 etanol slaytlar daldırma, 30 s. Hemen sonra% 100 etanol içine slaytlar daldırma, 30 s için% 100 etanol içeren ikinci bir kap içine slaytlar daldırma.
- Etanol dehidratasyon serisini takiben, slaytları taze dökülmüş ksilene 1 dk. Hemen sonra, slaytları 4 dk boyunca ikinci bir ksilene kabına batırın.
- Ksilen banyosundan slaytları çıkarın ve 5 dakika boyunca karanlıkta havanın kurumasını bekleyin.
- Slaytları 5 dk daha fazla kuruması için bir kurutucuya yerleştirin.
6. Lazer yakalama mikrodisseksi
- Eğer lekeli, mikroskop içine slayt yerleştirin ve anatomik yerler (yani, optik kiasm ve stria terminalis) kullanarak ilgi bölgesi (CeA) bulmak.
- Lekeli hücre tipini ve çekirdeğini ilgi bölgesindeki tanımlamak için floresan kullanın. Tek hücreli havuzlu örnekleri yapıyorsanız bir hücre veya birden çok hücre seçin. LCM yazılımını kullanarak ilgi hücrelerini işaretleyin.
- LCM kapağını dilimin üzerine ilgi çeken bölgeye yerleştirin.
- Ir lazer gücünü, boyutunu ve süresini ayarlamak için kızılötesi (IR) lazerin test çekimlerini kullanın, böylece LCM kapak yapıştırıcısı yalnızca seçilen tek hücrenin alanı üzerinde erir. Bu, seçilen hücreler dışında başka hücre toplanmamasını sağlar.
NOT: Bu temsili deneyde, aynı tedavi ile örnekler arasında gen ekspresyonundaki hücre-hücre değişkenliğini sınırlamak için tek bir örnek lem olarak aynı hücre tipinde 10 hücre havuzu kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem gerçek tek hücre deneyleri için kullanılabilir1,3. - LCM yazılım araçlarını kullanarak analiz için toplanacak hücreleri seçin(Şekil 2C). Seçilen hücreler sıçan beyin atlası ve bregma10dayalı CeA anatomik alanda olmalıdır (veya tercih edilen beyin bölgesi). Hücreler bitişik lekeli çekirdeklerden en az 3 μm olmalıdır.
- Tanımlanan tek hücreleri toplamak için IR lazer ateş.
- Kapağı kalite kontrol (QC) istasyonuna yerleştirin ve yalnızca istenilen hücrelerin seçildiğinden emin olmak için kapağı görüntüleyin. Diğer hücreler yanlışlıkla seçilirse, kapak QC istasyonunda kalırken istenmeyen hücreleri yok etmek için ultraviyole lazer kullanılabilir.
- Anatomik özgüllüğünü belgelemek için hücrenin toplandığı doku bölümünün fotoğrafını çekin. Bir referans10olarak bir sıçan beyin atlası kullanarak uygunsa bregma gelen dilimin mesafekaydedin.
- LCM kapağını QC istasyonundan çıkarın, numune çıkarma cihazını ve pipet 5,5 μL likte arabelleği numunenin üzerine takın.
NOT: Lysis tampon çözeltisi 0.5 μL lysis arttırıcı ve 5 μL resuspension tamponundan oluşur. - ExtracSure cihazını 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 75 °C'de 15 dakika boyunca bir ocak tabağına yerleştirin.
- Numuneyi ve lisis tamponu düşük hızda (0,01-0,02 x g)30 s'ye aşağı doğru çevirin ve toplanan numuneyi -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
7. Tek hücreli mikroakışkan RT-qPCR
- 96.96 Dinamik Dizme Yongası için tek hücreli mRNA preamplifikasyonu
- Preamplifikasyon için bir astar havuzunda (her astar 500 nM konsantrasyonu) denentüm genler için ileri ve geri mRNA qPCR gen astarlarını birleştirin. Örneğin, 80 μL artı 120 μL DNA Süspansiyon Tamponunda 1 000°L'lik 100 m'lik astar.
NOT: Temsili deney için kullanılan astar dizileri O'Sullivan ve ark.4'tebulunabilir. - Yeni bir 96 x 96 PCR plaka, her kuyuya 1 μL 5x VILO ekleyin.
- -80 °C'de depolanan numunelerden LCM tek hücreli numuneleri çıkarın, kısa bir süre çözülsün, düşük hızda (0,01-0,02 x g)kısa bir süre santrifüj edin ve pcr plakasına 5,5 μL'lik tek hücreli numune ekleyin. Her örnek kendi kuyuya eklenir.
- PCR plakasını numunelerle birlikte termocycler'a yerleştirin ve 65 °C'de 1,5 dk. Plakayı 1 dk 4 °C'de 1 dk x g'de döndürün ve plakayı buzüzerine yerleştirin.
- Her kuyuya 0,15 μL 10x cDNA sentezi ana karışımı, 0,12 μL T4 Gen 32 protein ve 0,73 μL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
- PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki protokolü uygulayın: 5 dk için 25 °C, 30 dk için 50 °C, 25 dk için 55 °C, 5 dk için 60 °C, 10 dk için 70 °C, bitişe kadar 4 °C.
- Her kuyuya 7,5 μL Taq polimeraz ana karışımı ekleyin.
- Her kuyuya 1,5 μL astar havuzu (yukarıya bakın) ekleyin.
- PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki ön amplifikasyon protokolünü çalıştırın: 10 dk için 95 °C, ardından 5 sn için 96 °C 22 devir, 4 dk için 60 °C.
- Her kuyuya 0,6 μL ekoneksikle I reaksiyon tamponu 10x, 1.2 μL ekonükleaz I ve 4.2 μL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
- PCR plakayı termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki protokolü uygulayın: 30 dk için 37 °C, 15 dakika boyunca 80 °C.
- Her kuyuya 54 μL TE tamponu ekleyin. PCR plakasını 5 dk. Mağaza'da 1.300 x g. 4 °C'de döndürün. Bir sonraki adım için 12 saatten fazla bekliyorsanız -20 °C'de saklayın.
- Preamplifikasyon için bir astar havuzunda (her astar 500 nM konsantrasyonu) denentüm genler için ileri ve geri mRNA qPCR gen astarlarını birleştirin. Örneğin, 80 μL artı 120 μL DNA Süspansiyon Tamponunda 1 000°L'lik 100 m'lik astar.
- Örnek plakayı 96.96 Dinamik Dizi Çipi için hazırlayın.
- Yeni bir 96 iyi PCR plaka, her kuyuya 0,45 μL 20x DNA bağlayıcı boya ve 4,55 μL düşük ROX mastermix ekleyin.
- Her kuyuya 3 μL önceden güçlendirilmiş numune ekleyin, PCR plakayı 1.300 x g'dadöndürün, sonra plakayı buza koyun.
- 96.96 Dinamik Dizi Çipi için bir asayasyon plakası hazırlayın.
- Yeni bir 96 iyi PCR plaka, her kuyuya 3,75 μL 2x GE istret reaktifi ve 1,25 μL DNA süspansiyon tamponu ekleyin.
- Her biri iyi karşılık gelen 10 μM qPCR astar 2,5 μL ekleyin. PCR plakayı 1.300 x g'de 5 dk çevirin.
- 96.96 Dinamik Dizi Yongasını yükleyin ve çalıştırın.
- Çipi kontrol hattı sıvısıyla başedin.
- Çipi IFC Denetleyici HX'e yerleştirin ve Prime (136X) komut dosyasını çalıştırın.
- PCR numune plakasından numunenin 6 μL'sini 96.96 Dinamik Dizme Yongasındaki ilgili numune kuyularına ekleyin.
- PCR test plakasından alınan numunenin 6 μL'sini 96,96 Dinamik Dizi Yongasındaki ilgili test kuyularına ekleyin.
- 96.96 Dinamik Dizi Chip kuyularında herhangi bir hava kabarcıkları pop iğneler kullanın.
- 96.96 Dinamik Dizi Yongasını IFC Denetleyici HX'e yerleştirin ve Load Mix (136x) komut dosyasını çalıştırın.
- Çipi IFC Controller HX'ten çıkarın, koruyucu etiketi çıkarın ve 96.96 Dinamik Dizi Yongasını mikroakışkan RT-qPCR platformuna yerleştirin. GE Fast 96 x 96 PCR protokolünü (30 döngü) çalıştırın.
NOT: Sonuçların RNA kalitesi ve geçerliliği jel elektroforez, erime sıcaklık eğrileri, numune ve tahkikat çoğaltmaları ve standart seyreltme serisi çizimler yoluyla taht doğrulama dahil olmak üzere birden fazla yöntemle değerlendirilir. Ayrıca transkripsiyonel bulgular, Batı lekeve immünoforesans tahlilleri de dahil olmak üzere beyin hemiseksiyonu üzerinde bağımsız yöntemlerle doğrulanabilir.
8. Mikroakışkan RT-qPCR ile bakteri bolluğunun ölçülmesi
- Dışkı DNA çıkarma kiti nin yönergelerini izleyerek bakteri DNA'sını ayıklayın.
- QPCR kullanarak bakteriyel DNA konsantrasyonu tahmin edin.
- Çıkarılan bakteriDNA'sını yeni bir PCR plakasına ekleyin. 1 μL çıkarılan bakteri DNA'sı ve 9 μL DNA Süspansiyon tamponu ekleyin.
- 48.48 Dinamik Dizme Yongası için bir adak plakası hazırlayın (bkz. 7.2.1-7.2.2 adımları)
- Örnek plakayı 48.48 Dinamik Dizme Yongası için hazırlayın (bkz. 7.3.1-7.3.2 adımları)
- Yeni bir 96 iyi PCR plaka, 0.45 μL 20x DNA bağlayıcı boya ve 4.55 μL düşük ROX mastermix 48 kuyuekleyin.
- 48 kuyuya bakteri DNA'sını içeren PCR plakasından 3 μL numune ekleyin ve PCR plakasını 5 dk. 4 °C'de 1.300 x g'de aşağı doğru döndürün.
- 48.48 Dinamik Dizi Yongasını yükleyin ve çalıştırın (bkz. 7.4.1-7.4.7 adımları).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücrelerin seçimi hem görsel hem de moleküler olarak doğrulandı. Hücre toplamadan önce hücresel morfoloji sigörüldü. Toplanan hücreler daha sonra QC istasyonunda görüntülendi ve hücresel çekirdek lekesi (DAPI) tek hücre seçim işareti floresanile çakıştı. Şekil 2A, CeA içeren hemisected sıçan ön beyni olan bir slaytın temsili görüntülerini gösterir. Sonraki görüntüler(Şekil 2B-D)tek hücrelerin seçimini ve transkripsiyon analizi için dokudan çıkarılmasını göstermektedir. Moleküler olarak, hücre tipine özgü belirteçler bu hücre tipinde artmış ekspresyon göstermiştir (Şekil 1C). Biz nöronlar baktı, mikroglia, ve astrositler ve NeuNifade ölçülen , Maf, ve Gfap, sırasıyla. Rakamlar aslında O'Sullivan ve ark.4yayınlandı.
Ayrıca, ekspresyon bulgularını doğrulamak için mikroakışkan platformda kontroller de çalıştırılabilir (örneğin, çekirdek özgüllüğünü göstermek için aynı dokunun diğer alanlarının analizi). Ayrı bir doku da ilgi dokuda astar özgüllüğünü göstermek için istenilen örnek ile karşılaştırılabilir. Pozitif ve negatif kontrol genleri de dahil edilebilir (örneğin, genler ya seçilen dokuda yok ya da yüksek ifade) olduğu bilinmektedir. Üç ya da dört temizlik geni de sadece veri normalleştirme amacıyla değil, aynı zamanda deneysel kalitenin bir ölçüsü olarak da eklenmelidir. Bu genler tüm örnekler ve tedaviler arasında ifade de en düşük varyans göstermelidir. Bu temsili deneyde, alternatif bir beyin bölgesi test edilmiştir, ancak ldha ve Actb temizlik genleri normalleştirme için kullanılmıştır. Gapdh bir iç kontrol olarak kullanıldı.
Şekil 3, grubumuzun verilerimizi analiz etmek için kullandığı çok değişkenli yöntemlerden bazılarını görüntüler. Geri çekilme grubundaki astrositlerin en çok etkilenen hücre tipi olduğunu bulduk. Diğer çalışmalar bağlamında bu verilere dayanarak, astrositlerin opioid yoksunluğu sırasında CeA'daki inflamasyonda önemli bir rol oynadığını ve bunun da olumsuz takviye yoluyla uyuşturucu arayışını yönlendiren fiziksel ve duygusal semptomlara katkıda bulunduğu na speküle ediyoruz. Ayrıca bağırsak mikroflora verilerini de gösteririz (Şekil 4).
Şekil 1: Tek hücreli RT-qPCR iş akışı ve transkripsiyonel heterojenite. (A) Deneysel protokol (her koşul için n = 4) (B) On hücreli havuzlu örnek transkripsiyon ölçümü. (C) Çubuk çizimortanca -ΔΔCt ifade değerlerini görüntüler. Nöronlar = mor; microglia = sarı; astrosit = yeşil. Hata çubukları standart hata gösterir. *p < 0.05, ***p < 0.0003; Tukey'nin dürüst anlamlılık testi. (D) Isı haritası 40 testgendeki tüm örneklerin ifadesini gösterir. Satırlar 10 hücreli havuzlu örneklerdir (930 nöronal örnek, 950 mikroglial örnek, 840 astrosit örneği belirtilir); sayılar örnek kümeleri gösterir ve sütunlar genlerdir. Şekil O'Sullivan ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lazer yakalama mikrodiseksiyon görüntüleri. (A) Bir slayt üzerinde CeA içeren susuz hemisected sıçan ön beyni dört dilim. Dilimler slayta bir önceki dilimden tam olarak 10 μm yerleştirildi. Sol anterior, sağ arka. Bregma uzaklığı optik sistem ve stria terminalis de dahil olmak üzere bir sıçan beyin atlası ve işaretleri kullanılarak tahmin edilebilir. (B-D) CeA(C)içinde tek hücrelerin seçimini ve dokudan çıkarılmasını gösteren görüntülerin sırası(D). Bu hücreleri seçmek için birden çok LCM kapağı kullanıldı. Bir kapak, bir hücre türünden 10 hücre seçmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsil sonuçları 1. (A) Bir hücrenin, testleri ve konumlarını gösteren çizgi film şeması. Burada etiketlenen gen sembolleri B paneli için bir referanstır. (B) Renkli kareler, A panelinde temsil edilen genler için göreli gen ekspresyonunu (ortanca -ΔΔCt değeri) temsil eder. Karelerin konumu, ilgili proteinin hücresel lokalizasyonunu veya işlevini temsil eder. Paneller, tedaviler ve hücre tipleri arasında renkle temsil edilen göreli gen ekspresyonunu görüntüler. Sarı = yüksek ifade; mavi = düşük ifade; beyaz = nötr ifade. Şekil O'Sullivan ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsil sonuçları 2. (A) Gen korelasyon ağları. Pearson korelasyon bir tedavi ve hücre tipi içinde -ΔΔCt değerleri üzerinde yapıldı. Düğümler genleri ve renklerini gösterir göreceli ifade düzeylerini belirtir (her gen için ortanca -ΔΔCt değeri). Kenarlar ifade bağıntılarını gösterir ve kalınlık ifade korelasyonunun (ρ) gücünü gösterir. Q-value <0.001 ile korelasyonlar görüntülenir. Siyah kenarlar = pozitif korelasyonlar; yeşil kenarlar = negatif korelasyonlar. (B) Önemli diferansiyel gen ekspresyonu gösteren seçkin genlerin çubuk çizimleri. İstatistikler iç içe anova #p < 0.1, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.0001 (tüm tedaviler için n = 4 hayvan) kullanılarak hesaplanmıştır. Şekil O'Sullivan ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bağırsak mikroflorasının göreceli bolluğu. Barplots bakteri türlerinin göreceli bolluk görüntüler (-ΔΔCt değerleri). #p < 0.1, *p < 0.05, **p < 0.008, ***p = 0.0009; iki yönlü ANOVA; n = Her tedavi için 4 hayvan. Şekil O'Sullivan ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek hücreli biyoloji hücresel fenotiplerin heterojenliğini ve doku fonksiyonunun sağlamlığını göstermiştir. Bu bulgular, biyolojik sistemlerin hem makro hem de mikro ölçeklerde organizasyonu hakkında bilgi verilmiştir. Burada, anatomik özgüllük ve transkripsiyonel doğruluk sağlayan tek hücreli transkripsiyonme ölçüleri elde etmek için iki yöntem, LCM ve mikroakışkan qPCR kombinasyonunu açıklıyoruz(Şekil 1). Grubumuz bir sistem biyolojisi yaklaşımı alır ve genellikle aynı hayvanda birden fazla dokuölçer. Bu yöntemleri, biyolojik sistemlerin transkripsiyonel düzeyde çeşitli zorluklara nasıl yanıt verebileceğimizi belirlemede hem esnek hem de verimli buluyoruz. Ayrıca, bu yöntemleri temel koşullarda hücresel fenotiplerin anatomik haritalamalarında kullanırız.
CeA'nın opioid bağımlılığı ve yoksunluk larına nasıl tepki verebildiğini araştıran yeni bir yayından elde edilen veriler ve değiştirilmiş rakamlar savuruyoruz4. Bu örnekte, bağırsak mikroflorasının göreceli bolluğunu ölçmek için aynı mikroakışkan qPCR platform'u kullandık. Yöntemler ve iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir ve ilk olarak O'Sullivan ve ark.4'teyayınlanmıştır. Yüksek iş lenme mikroakışkan RT-qPCR'den elde edilen önemli bulgular daha sonra Western blot veya immünoforesans4gibi protein önlemleri ile doğrulanabilir.
Bu sistem biyolojisi yaklaşımının en önemli zorluğu spesifik nedensel biyolojik mekanizmalarıbelirlemektir. Bulanık mantık, gen düzenleyici ağ davranışı2'dearacıları çıkarmak için başarı ile istihdam ettiğimiz doğrulanmış bir çözümdür. Hayvan modeli manipülasyonu da sistemik mekanizmalar hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir. Örneğin, mide vagotomi ile bir sıçan kohort eklenmesi ile burada sağlanan aynı protokol vagus siniri üzerinden bilgi akışı içine fikir sağlayan veri verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Burada sunulan çalışma NIH HLB U01 HL133360 JS ve RV, NIDA R21 DA036372 JS ve EVB ve T32 AA-007463 SJO's destek jan Hoek verilen verildi yoluyla finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
