Summary
Questo protocollo spiega come raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell'amigdala con alta precisione e specificità anatomica utilizzando la microdissezione di cattura laser. Inoltre, spieghiamo il nostro uso di RT-qPCR microfluidico per misurare un sottoinsieme del trascrittoma di queste cellule.
Abstract
La profonda eterogeneità trascrizionale nelle singole cellule anatomicamente adiacenti suggerisce che la robusta funzionalità dei tessuti può essere ottenuta dalla diversità del fenotipo cellulare. Gli esperimenti a una cellula che studiano le dinamiche di rete dei sistemi biologici dimostrano risposte cellulari e tissutali a varie condizioni a risoluzione biologicamente significativa. Qui, spieghiamo i nostri metodi per raccogliere singole cellule da luoghi anatomicamente specifici e misurare accuratamente un sottoinsieme dei loro profili di espressione genica. Uniamo la microdisezione di cattura laser (LCM) con le reazioni della catena quantitativa di trascrizione inversa microfluidica (RT-qPCR). Usiamo anche questa piattaforma microfluidica RT-qPCR per misurare l'abbondanza microbica del contenuto intestinale.
Introduction
La misurazione dei profili di espressione genica di singole cellule ha dimostrato un'ampia eterogeneità fenotipica all'interno di un tessuto. Questa complessità ha complicato la nostra comprensione delle reti biologiche che governano la funzione dei tessuti. Il nostro gruppo e altri hanno esplorato questo fenomeno in molti tessuti e condizioni1,2,3,4,5,6. Questi esperimenti non solo suggeriscono che la regolazione delle reti di espressione genica è alla base di tale eterogeneità, ma anche che la risoluzione a singola cellula rivela una complessità nella funzione tissutale che la risoluzione a livello di tessuto non riesce ad apprezzare. Infatti, solo una piccola minoranza di cellule può rispondere a una condizione o a una sfida specifica, ma l'impatto di tali cellule sulla fisiologia generale può essere sostanziale. Inoltre, un approccio di biologia del sistema che applica metodi multivariati a set di dati ad alta dimensione da più tipi di cellule e tessuti può chiarire gli effetti di trattamento a livello di sistema.
Uniamo LCM e RT-qPCR microfluidico per ottenere tali set di dati. Adottiamo questo approccio qui in contrasto con la raccolta di singole cellule tramite lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e l'utilizzo del sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) per misurare il loro trascrittoma. Il vantaggio di LCM rispetto a FACS è che l'esatta specificità anatomica delle singole celle può essere documentata con LCM, relativamente e assolutamente. Inoltre, mentre RNA-seq può misurare più caratteristiche che RT-qPCR, RT-qPCR microfluidico è meno costoso e ha una maggiore sensibilità e specificità7.
In questo esperimento rappresentativo, abbiamo studiato gli effetti della dipendenza da oppioidi e del ritiro degli oppioidi precipitati da naltrexone sul ratto neuronale, microglia, e l'espressione del gene astrocito nel nucleo centrale dell'amigdala (CeA) e della micro abbondanza intestinale4 . Sono stati analizzati quattro gruppi di trattamento: 1) Placebo, 2) Morphine, 3) Naltrexone e 4) Ritiro (Figura 1). Abbiamo scoperto che la dipendenza da oppioidi non alterava sostanzialmente l'espressione genica, ma che il ritiro da oppioidi indusse l'espressione di geni infiammatori, in particolare Tnf. Gli astrociti erano il tipo di cellula più colpita. Il microbioma intestinale è stato profondamente influenzato dal ritiro da oppioidi come indicato da una diminuzione del rapporto Firmicutes a Bacteroides, che è un marcatore stabilito della disbiosi intestinale8,9.
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Protocol
Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni di Animal Care and Use Committee (IACUC) di Thomas Jefferson University e Drexel University College of Medicine. Il protocollo è stato approvato dalla Thomas Jefferson University e Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Modello animale
- Inserire due pellet di solfato di morfina a lento rilascio 75 mg o due pellet placebo sottocutanei in ratti Maschi Maschi Adulti Sprague-Dawley.
- Utilizzare un abito e guanti in modo appropriato per la chirurgia sterile minore. Se necessario, rasare il dorsum del ratto con i tagliacapelli.
- Applicare l'unguento veterinario agli occhi dell'animale. Anestesizzare il ratto con circa 20 s di inalazione di isoflurane. L'anestesia è confermata dalla perdita di coscienza.
- Fare un'incisione mediana nel dorsum di ratto con forbici contundenti sterilizzati e separare il derma dalla parete del corpo con una sonda sterilizzata di perline. Inserire i pellet sotto il derma con pinze sterilizzate con perline. Suturare l'incisione chiusa con un ago sterile.
NOTA: L'intera procedura richiede circa 5 min per ratto. Guanti sterili freschi vengono utilizzati per ogni ratto. - Mettere il ratto in una gabbia di isolamento per il recupero postchirurgico. Verificare la presenza di un battito cardiaco e di un ritmo respiratorio regolare. Osservare il ratto fino a quando la coscienza non viene riconquistata. Valutare il dolore postchirurgico.
- Valutare i ratti 8 h postchirurgia e ogni 12 h dopo per il recupero e l'infezione. Mettere i ratti in una gabbia con il resto della coorte quando sono completamente recuperati dall'intervento chirurgico, circa 24 ore dopo la postchirurgia.
- Dare un'iniezione intraperitoneale di naltrexone (75 mg/kg) alla G e alle coorti di ritiro dopo 6 giorni di esposizione alla morfina.
NOTA: in questo esperimento rappresentativo sono state presenti quattro coorti di ratto (vedere la figura 1).
2. Raccolta dei campioni
- Raccogliere il cervello 6 giorni dopo l'inserimento di pellet o 24 h dopo l'iniezione di naltrexone.
- Posizionare l'animale in una camera isoflurane per circa 30 s o fino a quando non si verifica la perdita di coscienza, indicata da una mancanza di movimento e dalla diminuzione della frequenza respiratoria.
- Utilizzare una ghigliottina affilata per decapitare rapidamente l'animale.
- Disseziona il cervello dal cranio dell'animale.
- Utilizzare un rasoio portatile affilato per effettuare le seguenti incisioni lorde al cervello rimosso: in primo luogo, tagliare il cervelletto e scartare. In secondo luogo, separare il tronco encefalico dal prosencefalo con un'incisione trasversale. In terzo luogo, hemisect il prosencefalo e/o tronco encefalico con un'incisione sagittale linea mediana.
- Collocare il prosencefalo e il tronco encefalico in uno stampo di plastica che incorpora tessuto con 3-4 cm di composto Optimal Cutting Temperature (OCT) nella parte inferiore dello stampo. Coprire il resto dell'esempio con lo Strumento di personalizzazione di Office.
- Posizionare immediatamente lo stampo che incorpora i tessuti di plastica con il campione coperto con OCT in un bagno contenente ghiaccio secco e metanolo. Non lasciare che il metanolo si riversi nello stampo che incorpora i tessuti. Mantenere lo stampo di incorporamento con il campione di cervello nel bagno di metanolo-ghiaccio fino a quando la raccolta dei tessuti è terminata (massimo 10-15 min).
- Collocare il campione cerebrale in un congelatore a -80 gradi centigradi il prima possibile.
- Raccogliere i campioni intestinali contemporaneamente.
- Dopo una rapida decapitazione, fai un'incisione mediana nell'addome dell'animale con un bisturi.
- Trova il cecum e recide la sua connessione al colon ascendente.
- Spremere il contenuto della ceca in un tubo conico da 15 mL.
- Mettere immediatamente il tubo conico sul ghiaccio secco e mettere in un congelatore -80 gradi centigradi il più presto possibile.
NOTA: Il contenuto di intestino tenue può anche essere raccolto utilizzando gli stessi metodi di un controllo negativo.
3. Affettare
- Affettare il prosencefalo del ratto immicato usando un criostato.
- Rimuovere lo stampo di incorporamento in plastica con il prosencefalo dal congelatore -80 gradi centigradi e metterlo in un criostatodiclato -20 .
- Rimuovere il campione del prosencefalo con incorporato nello Strumento di personalizzazione di Office dallo stampo di incorporamento. Utilizzare un rasoio per tagliare gli angoli dello stampo di plastica che incorpora verticalmente, se necessario. Montare il prosencefalo per rostrale a coronale caudale affettare su un mandrino criostato utilizzando OCT.
NOTA: I punti di riferimento anatomici per identificare il CeA includono il tratto ottico e stria terminalis (Figura 2B). Il tratto ottico si ramifica dal chiasma ottico e traccia dorsale-laterale come il cervello è affettato da rostral a caudale. Quando il tratto ottico ha una morfologia simile a quella osservata in un atlante cerebrale di ratto bregma -2,12 mm10, le fette di prova possono essere visualizzate al microscopio. Il tratto ottico e la morfologia stria e stria terminale possono essere controllati in un atlante cerebrale di ratto10 per identificare il bregma e se il CeA circonda i terminali della stria. - Tagliare 10 sezioni coronali di spessore 10 m dal prosencefalo emisected rostral a caudal fino a quando non vengono raggiunte le sezioni contenenti il CeA.
NOTA: la larghezza e l'altezza delle sezioni sono di circa 200 mm. - Raccogliere 10 sezioni che contengono il CeA, o la regione del cervello preferita, con 10 sezioni di scongelamento montato su vetrini di vetro. Posizionare immediatamente i vetrini di vetro su una teglia di metallo appoggiata sul ghiaccio secco. Mettere le vetrine con sezioni cerebrali in un congelatore -80 gradi centigradi il più presto possibile.
NOTA: più sezioni possono essere posizionate sulla stessa diapositiva. Se si utilizza una macchia di tipo di cellula diversa per le sezioni sulla stessa diapositiva, lasciare circa 100 mm tra le fette in modo che una penna idrofobica possa essere utilizzata per separare le soluzioni anticorpali specifiche del tipo di cellula sulla diapositiva. Lasciare circa 20 mm dal bordo della diapositiva su ciascun lato della fetta.
4. Colorazione immunofluorescenza
- Macchiare le sezioni del prosencefalo per la cellula cerebrale di scelta (ad esempio, neurone, microglia, astrocite, ecc.) utilizzando immunofluorescenza.
- Dal congelatore -80 gradi, rimuovere una o più diapositive con 10 o più sezioni del CeA.
- Fissare i vetrini con 75% etanolo per 30 s. Rimuovere il liquido in eccesso.
- Bloccare le fette per 30 s con 2% antigene siero bovino (BSA) in 1x fosfato buffer salina (PBS). Lavare 1x con PBS.
- Aggiungere una soluzione anticorpale primaria alla diapositiva per 2 min.
NOTA: la soluzione anticorpale primaria è composta da 2% anticorpi primari, 1% RNase Out e 96% della stessa soluzione BSA PBS per il passaggio di blocco di cui sopra (passaggio 4.1.3). L'esperimento rappresentativo ha utilizzato un anticorpo anti-NeuN, un anticorpo anti-Cd11 e un anticorpo anti-GFAP nelle seguenti quantità: 3 :L di primario, 1,88 L di inibitore dell'RNA e 145,12 l di soluzione BSA. - Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria alla diapositiva per 3 min.
NOTA: La soluzione anticorpale secondaria è composta da 1 -L di etichetta fluorescente anti-tono capra 488 nm (1:500), 2,5 l di inibitore dell'RNA, 1,3 l di DAPI (1:10,000) e 196,5 - L del 2% BSA.
5. Serie di disidratazione dell'etanolo e dello xilene
- Immergere i vetrini nel 75% etanolo per 30 s. Subito dopo, immergere i vetrini in 95% etanolo per 30 s. Immediatamente dopo, immergere i vetrini in 100% etanolo per 30 s. Immediatamente dopo, immergere i vetrini in un secondo contenitore contenente 100% etanolo per 30 s.
- Dopo la serie di disidratazione dell'etanolo, immergere i vetrini nello xilene appena versato per 1 min.
- Togliere i vetrini dal bagno di xilene e lasciare asciugare l'aria al buio per 5 min.
- Mettere i vetrini in un desiccatore per 5 min ad asciugare ulteriormente.
6. Microdissezione di cattura laser
- Se macchiato, posizionare lo scivolo nel microscopio e trovare la regione di interesse (CeA) utilizzando punti di riferimento anatomici (cioè il chiasma ottico e stria terminalis).
- Utilizzare la fluorescenza per identificare il tipo di cellula macchiata e il suo nucleo nella regione di interesse. Scegliere una o più celle se si esegueno campioni in pool a cella singola. Contrassegnare le celle di interesse utilizzando il software LCM.
- Posizionare il tappo LCM sopra la sezione sulla regione di interesse.
- Utilizzare scatti di prova di un laser a infrarossi (IR) per regolare la forza, le dimensioni e la durata del laser IR in modo che l'adesivo del tappo LCM si sciolga solo sull'area della singola cella selezionata. Ciò garantisce che non verranno raccolte altre celle oltre alle celle selezionate.
NOTA: In questo esperimento rappresentativo, 10 pool di cellule dello stesso tipo di cellula sono stati utilizzati come un singolo campione per limitare la variabilità da cellula a cellula nell'espressione genica tra campioni con lo stesso trattamento. Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato per veri esperimenti a cella singola1,3. - Selezionare le singole celle da raccogliere per l'analisi mediante gli strumenti software di Gestione configurazione locale (Figura 2C). Le cellule selezionate devono trovarsi nell'area anatomica del CeA (o nella regione cerebrale di scelta) in base all'atlante cerebrale del ratto e al bregma10. Le cellule devono essere di almeno 3 m rispetto ai nuclei macchiati adiacenti.
- Accendere il laser a iR per raccogliere le singole celle identificate.
- Posizionare il tappo nella stazione di controllo qualità (QC) e visualizzarlo per assicurarsi che siano state selezionate solo le celle desiderate. Se altre cellule sono state erroneamente selezionate, un laser ultravioletto può essere utilizzato per distruggere le cellule indesiderate mentre il tappo rimane nella stazione QC.
- Scatta una foto della sezione tissutale da cui è stata raccolta la cellula per documentarne la specificità anatomica. Registrare la distanza della fetta dal bregma, se appropriato, utilizzando un atlante cerebrale di topo come riferimento10.
- Rimuovere il tappo LCM dalla stazione QC, collegare il dispositivo di estrazione del campione e la pipetta 5,5 - L del buffer di lisi sul campione.
NOTA: La soluzione del buffer di lisi è costituita da 0,5 luna di potenziatore di lisi e 5 luna di buffer di sospensione. - Montare il dispositivo ExtracSure su un tubo di microcentrifuga da 0,5 ml e posizionarlo su una piastra calda a 75 gradi centigradi per 15 min.
- Ruotare il buffer del campione e del lisi per 30 s a bassa velocità (0,01-0,02 x g) e posizionare il campione raccolto in un congelatore a -80 gradi centigradi.
7. RT-qPCR microfluidico a cella singola
- Preamplificazione dell'mRNA a cella singola per chip a matrice dinamica 96.96
- Combinare i primi geni mRNA qPCR in avanti e in senso inverso per tutti i geni che vengono analisi in un pool di primer per la preamplificazione (500 nM di concentrazione ogni primer). Ad esempio, 1 L di 100 M primer in 80 :L più 120 L di DNA SospensionBuffer.
NOTA: Le sequenze di primer utilizzate per l'esperimento rappresentativo sono disponibili in O'Sullivan etal. - In una nuova piastra 96 x 96 PCR, aggiungere 1 L di 5x VILO ad ogni pozzo.
- Rimuovete i campioni a cella singola di LCM dai campioni conservati a -80 gradi centigradi, scongelatevi brevemente, centrificate brevemente a bassa velocità (0,01-0,02 x g)e aggiungete 5,5 l del campione a cella singola liscito alla piastra PCR. Ogni campione viene aggiunto al proprio pozzo.
- Mettere la piastra PCR con i campioni e VILO nel termociclore e riscaldare a 65 gradi centigradi per 1,5 min.
- Aggiungete 0,15 l di 10x di sintesi del ginocchio di sintesi cDNA, 0,12 proteina T4 Gene 32 e 0,73 l di buffer di sospensione del DNA in ogni pozzo.
- Collocare la piastra PCR nel termociclore ed eseguire il seguente protocollo: 25 gradi centigradi per 5 min, 50 gradi centigradi per 30 min, 55 gradi centigradi per 25 min, 60 gradi centigradi per 5 min, 70 gradi centigradi per 10 min, 4 gradi per terminare.
- Aggiungete ad ogni pozzo 7,5 l di miscela master in polimerasi Taq.
- Aggiungere 1,5 l della piscina delle primer (vedi sopra) a ogni pozzo.
- Posizionare la piastra PCR nel termociclista ed eseguire il seguente protocollo di preamplificazione: 95 s per 10 min, seguito da 22 cicli di 96 s per 5 sec, 60 gradi centigradi per 4 min.
- Aggiungete 0,6 l di buffer di reazione esonuclease I 10x, 1,2 - lexonuclease I e 4,2 L di buffer di sospensione del DNA a ogni pozzo.
- Posizionare la piastra PCR nel termociclore ed eseguire il seguente protocollo: 37 gradi centigradi per 30 min, 80 gradi centigradi per 15 min.
- Aggiungete 54 l di te buffer a ogni pozzetto. Girare la piastra PCR a 1.300 x g a 5 min. Conservare a 4 gradi centigradi se si continua immediatamente con il passo successivo. Conservare a -20 gradi centigradi se si aspettano più di 12 h per il passo successivo.
- Combinare i primi geni mRNA qPCR in avanti e in senso inverso per tutti i geni che vengono analisi in un pool di primer per la preamplificazione (500 nM di concentrazione ogni primer). Ad esempio, 1 L di 100 M primer in 80 :L più 120 L di DNA SospensionBuffer.
- Preparare la piastra di esempio per il chip Array dinamico 96.96.
- In una nuova piastra PCR 96 pozzetto, aggiungere a ogni pozzo 0,45 l di 20 x di un'inttura per il DNA e 4,55 l di mastermix ROX basso.
- Aggiungere 3 ll l di campione preamplificatore ad ogni pozzo, far girare la piastra PCR a 1.300 x g, quindi mettere la piastra sul ghiaccio.
- Preparare la piastra di analisi per il chip array dinamico 96.96.
- In una nuova piastra PCR da 96 pozzetto, aggiungere 3,75 l of 2x GE di reagente di carico di prova e 1,25 l di buffer di sospensione del DNA per ogni pozzo.
- Aggiungere all'incirca ogni pozzetto corrispondente di 2,5 ldi di 10 m qPCR. Girare la piastra PCR a 1.300 x g per 5 min.
- Caricare ed eseguire il chip array dinamico 96.96.
- Prime il chip con fluido della linea di controllo.
- Inserire il chip in un controller IFC HX ed eseguire lo script Prime (136X).
- Aggiungete 6 l del campione della piastra di campione PCR nei pozze di campione corrispondenti nel chip di array dinamico 96,96.
- Aggiungete 6 l del campione dalla piastra di prova PCR nei pozzi di prova corrispondenti nel chip di array dinamico 96,96.
- Utilizzare gli aghi per far scoppiare eventuali bolle d'aria nei pozzi del chip 96.96 Dynamic Array.
- Inserire il chip 96.96 Dynamic Array nel controller IFC HX ed eseguire lo script Load Mix (136x).
- Togliere il chip dal controller IFC HX, staccare l'adesivo protettivo e posizionare il chip 96.96 Dynamic Array in una piattaforma microfluidica RT-qPCR. Eseguire il protocollo GE Fast 96 x 96 PCR (30 cicli).
NOTA: la qualità e la validità dell'RNA dei risultati sono valutate con diversi metodi, tra cui la convalida del saggio tramite elettroforesi in gel, le curve di temperatura di fusione, le repliche di campioni e saggi e i grafici di serie di diluizione standard. Inoltre, i risultati trascrizionali possono essere convalidati con metodi indipendenti sull'emisezione cerebrale, tra cui i saggi di macchie occidentali e immunofluorescenza.
8. Misurare l'abbondanza batterica con RT-qPCR microfluidico
- Estrarre il DNA batterico seguendo le direzioni del kit di estrazione del DNA delle feci.
- Stimare la concentrazione di DNA batterico utilizzando qPCR.
- Aggiungere il DNA batterico estratto a una nuova piastra PCR. Aggiungere 1 l l di DNA batterico estratto e 9 l di buffer di sospensione del DNA.
- Preparare la piastra di analisi per il chip 48.48 Dynamic Array (vedere i passaggi 7.2.1-7.2.2)
- Preparare la piastra di esempio per il chip 48.48 Dynamic Array (vedere i passaggi 7.3.1-7.3.2)
- In una nuova piastra PCR 96 pozzetto, aggiungere 0,45 l of 20x DNA binding dy e 4,55 L di mastermix ROX basso a 48 pozze.
- Aggiungere 3 ll l del campione dalla piastra PCR contenente il DNA batterico ai 48 pozze e far girare la piastra PCR a 1.300 x g per 5 min.
- Caricare ed eseguire il chip 48.48 Dynamic Array (vedere i passaggi 7.4.1-7.4.7).
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Representative Results
La selezione delle singole cellule è stata convalidata sia visivamente che molecolarmente. Visivamente, la morfologia cellulare è stata vista prima della raccolta delle cellule. Le cellule raccolte sono state poi viste alla stazione QC e la macchia dei nuclei cellulari (DAPI) si sovrapponeva alla fluorescenza del marcatore di selezione cellulare. Figura 2A mostra le immagini rappresentative di una diapositiva con prosencefalo del ratto emisected contenente il CeA. Le immagini successive (Figura 2B-D) mostrano la selezione delle singole cellule e la loro rimozione dal tessuto per l'analisi trascrittomica. In modo molecolare, i marcatori specifici del tipo di cella hanno dimostrato un aumento dell'espressione in quel tipo di cella (Figura 1C). Abbiamo esaminato neuroni, microglia e astrociti e misurato l'espressione di NeuN, Maf, e Gfap, rispettivamente. Le cifre sono state originariamente pubblicate su O'Sullivan et al.4.
Inoltre, i controlli possono essere eseguiti anche nella piattaforma microfluidica per convalidare i risultati dell'espressione (ad esempio, l'analisi di altre aree dello stesso tessuto per dimostrare la specificità del nucleo). Un tessuto separato potrebbe anche essere confrontato con il campione desiderato per dimostrare la specificità del primer nel tessuto di interesse. Possono essere inclusi anche i geni di controllo positivi e negativi (ad esempio, geni noti per essere assenti dal tessuto selezionato o espressi molto). Tre o quattro geni delle pulidi dovrebbero essere inclusi non solo ai fini della normalizzazione dei dati, ma anche come misura della qualità sperimentale. Questi geni dovrebbero dimostrare la varianza più bassa nell'espressione in tutti i campioni e trattamenti. In questo esperimento rappresentativo, nessuna regione cerebrale alternativa è stata analizzata, ma i geni delle puliture Ldha e Actb sono stati utilizzati per la normalizzazione. Gapdh è stato utilizzato come controllo interno.
Figura 3 Mostra alcuni dei metodi multivariati utilizzato dal gruppo per analizzare i dati. Abbiamo scoperto che gli astrociti nel gruppo Ritiro erano il tipo di cellula più colpita. Sulla base di questi dati nel contesto di altri studi si ipotizza che gli astrociti svolgano un ruolo chiave nell'infiammazione nel CeA durante il ritiro degli oppiacei e che ciò contribuisca ai sintomi fisici ed emotivi che guidano la ricerca di farmaci attraverso il rinforzo negativo. Mostriamo anche i dati della microflora intestinale (Figura 4).
Figura 1: flusso di lavoro RT-qPCR a cella singola e eterogeneità trascrizionale. (A) Protocollo sperimentale (n - 4 per ogni condizione) (B) Misurazione del trascrittoma del campione raggruppato a dieci celle. (C) Il grafico a barre visualizza i valori dell'espressione mediana --Ct. Neuroni - viola; microglia - giallo; astrociti - verde. Le barre di errore mostrano un errore standard. < 0,05, < 0,003; Test di significato onesto di Tukey. (D) La mappa termica mostra l'espressione di tutti i campioni in 40 geni analizzati. Le righe sono campioni raggruppati a 10 cellule (930 campioni neuronali, 950 campioni microgliali, 840 campioni di astrociti come indicato); i numeri indicano i grappoli campione e le colonne sono i geni. La cifra è stata modificata da O'Sullivan etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini di microdissezione di acquisizione laser. (A) Quattro fette di prosencefalo dirato emicida disidratato contenente il CEA su una diapositiva. Le fette sono state posizionate sulla diapositiva esattamente 10 m dalla fetta precedente. Sinistra è anteriore e destra è posteriore. La distanza dal bregma può essere stimata utilizzando un atlante cerebrale di ratto e punti di riferimento, tra cui il tratto ottico e stria terminalis. (B-D) Sequenza di immagini che mostrano la selezione di singole cellule nel CeA (C) e la loro rimozione dal tessuto (D). Per selezionare queste celle sono stati utilizzati più tappi LCM. Un tappo viene utilizzato per selezionare 10 celle di un tipo di cella. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi 1. (A) Uno schema cartone animato di una cellula che mostra i geni saggiati e la loro posizione. I simboli genici qui etichettati sono un riferimento per il pannello B. (B) I quadrati colorati rappresentano l'espressione genica relativa (valore mediano --Ct) per i geni rappresentati nel pannello A. La posizione dei quadrati rappresenta la localizzazione cellulare o la funzione della proteina corrispondente. I pannelli visualizzano l'espressione genica relativa rappresentata dal colore tra trattamenti e tipi di cellule. Giallo - espressione alta; blu - bassa espressione; bianco: espressione neutra. La cifra è stata modificata da O'Sullivan etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi 2. (A) Reti di correlazione genica. La correlazione di Pearson è stata eseguita sui valori --zCt all'interno di un trattamento e del tipo di cellula. I nodi denotano i geni e il loro colore indica i livelli di espressione relativi (il valore mediano --Ct per ogni gene). I bordi denotano le correlazioni dell'espressione e lo spessore indica l'intensità della correlazione dell'espressione .). Vengono visualizzate le correlazioni con un valore q <0.001. Bordi neri - correlazioni positive; bordi verdi: correlazioni negative. (B) Grafici a barre di geni selezionati che dimostrano un'espressione genica differenziale significativa. Le statistiche sono state calcolate utilizzando aNova nidificata #p < 0,1, .p < 0.05, .p < 0.01, .p < 0.0001 (n - 4 animali per tutti i trattamenti). La cifra è stata modificata da O'Sullivan etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Abbondanza relativa di microflora intestinale. Le barreplote mostrano l'abbondanza relativa di specie batteriche (valori di z-zct). #p < 0,1, p < 0,05, < 0,008 USD, ovvero 0,0009 USD; bidirezionale ANOVA; n 4 animali per ciascun trattamento. La cifra è stata modificata da O'Sullivan etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La biologia a cellula singola ha dimostrato l'eterogeneità dei fenotipi cellulari e la robustezza della funzione tissutale. Questi risultati hanno fornito informazioni sull'organizzazione dei sistemi biologici sia su macro che su microscala. In questo caso, descriviamo la combinazione di due metodi, LCM e qPCR microfluidico, per ottenere misure di trascrittoma a cella singola che forniscono specificità anatomica e precisione trascrizionale a un costo relativamente basso (Figura 1). Il nostro gruppo adotta un approccio di biologia dei sistemi e spesso misura più tessuti nello stesso animale. Troviamo che questi metodi siano flessibili e fruttuosi nel determinare come i sistemi biologici rispondono alle varie sfide a livello trascrizionale. Inoltre, utilizziamo questi metodi nella mappatura anatomica dei fenotipi cellulari in condizioni di base.
Forniamo dati e dati modificati da una recente pubblicazione che esplora come il CEA risponde alla dipendenza da oppiacei e ritiro4. In questo esempio, abbiamo usato la stessa piattaforma qPCR microfluidica per misurare l'abbondanza relativa della microflora intestinale. I metodi e il flusso di lavoro sono riepilogati nella Figura 1 e sono stati originariamente pubblicati in O'Sullivan etal. I principali risultati dell'RT-qPCR microfluidico ad alto throughput possono essere successivamente convalidati mediante misure proteiche come la macchia occidentale o l'immunofluorescenza4.
Una delle principali sfide di questo approccio di biologia dei sistemi è determinare meccanismi biologici causali specifici. La logica fuzzy è una soluzione convalidata che abbiamo impiegato con successo per dedurre gli agenti nel comportamento della rete di regolazione genica2. La manipolazione del modello animale può anche essere impiegata per fornire informazioni sui meccanismi sistemici. Ad esempio, lo stesso protocollo fornito qui con l'aggiunta di una coorte di ratti con una vagotomia gastrica produrrà dati che forniscono informazioni sul flusso di informazioni attraverso il nervo vago.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Il lavoro qui presentato è stato finanziato tramite NIH HLB UL1 33360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS ed EVB, e T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO'S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
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- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
