Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الجمع بين الليزر التقاط Microdissection وMicrofluidic qPCR لتحليل الملامح النسخية للخلايا المفردة: نهج بيولوجيا النظم للاعتماد على المواد الأفيونية

Published: March 8, 2020 doi: 10.3791/60612
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

Summary

يشرح هذا البروتوكول كيفية جمع الخلايا العصبية المفردة وmicroglia والخلايا الفلكية من النواة المركزية للأميغدالا بدقة عالية وخصوصية تشريحية باستخدام المجهر الالتقاط بالليزر. بالإضافة إلى ذلك، نشرح استخدامنا لـ RT-qPCR الميكروسيولية لقياس مجموعة فرعية من النسخ من هذه الخلايا.

Abstract

تشير التغايرية النسخة العميقة في الخلايا المفردة المجاورة تشريحياً إلى أنه يمكن تحقيق وظائف الأنسجة القوية من خلال تنوع النمط الظاهري الخلوي. وتبين التجارب أحادية الخلية التي تحقق ديناميات الشبكة للنظم البيولوجية استجابات خلوية وأنسجة لمختلف الظروف بدقة بيولوجية. هنا، نشرح أساليبنا لجمع خلايا مفردة من مواقع محددة تشريحياً وقياس مجموعة فرعية بدقة من ملامح التعبير الجيني الخاصة بهم. نحن نجمع بين microdissection التقاط الليزر (LCM) مع النسخ العكسية microfluidic التفاعلات المتسلسلة البوليميراز الكمية (RT-qPCR). كما نستخدم هذه المنصة MICROfluidic RT-qPCR لقياس الوفرة الميكروبية لمحتويات الأمعاء.

Introduction

وقد أظهرت قياس ملامح التعبير الجيني للخلايا واحدة التغايرية واسعة فينوتيبيك داخل الأنسجة. وقد أدى هذا التعقيد إلى تعقيد فهمنا للشبكات البيولوجية التي تحكم وظيفة الأنسجة. وقد استكشفت مجموعتنا وغيرها هذه الظاهرة في العديد من الأنسجة والظروف1،2،3،4،5،6. هذه التجارب لا تشير فقط إلى أن تنظيم شبكات التعبير الجيني تكمن وراء هذا التغاير ، ولكن أيضا أن دقة الخلية الواحدة يكشف عن تعقيد في وظيفة الأنسجة أن القرار على مستوى الأنسجة لا نقدر. في الواقع، مجرد أقلية صغيرة من الخلايا قد تستجيب لحالة محددة أو التحدي، ولكن تأثير تلك الخلايا على علم وظائف الأعضاء عموما قد يكون كبيرا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لنهج بيولوجيا النظام الذي يطبق أساليب متعددة المتغيرات على مجموعات البيانات عالية الأبعاد من أنواع الخلايا والأنسجة المتعددة توضيح آثار العلاج على مستوى النظام.

نحن نجمع LCM وMICROfluidic RT-qPCR للحصول على مجموعات البيانات هذه. نحن نتخذ هذا النهج هنا على النقيض من جمع الخلايا المفردة عبر فرز الخلايا المنشط ة بالفلور (FACS) واستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لقياس النسخ الخاصة بهم. ميزة LCM على FACS هي أنه يمكن توثيق التحديد التشريحي الدقيق للخلايا المفردة باستخدام LCM ، نسبيًا ومطلقًا. وعلاوة على ذلك، في حين أن الجيش الملكي النيبالي-seq يمكن قياس المزيد من الميزات التي RT-qPCR، microfluidic RT-qPCR هو أقل تكلفة ولديه حساسية أعلى وخصوصية7.

في هذه التجربة التمثيلية ، قمنا بالتحقيق في آثار الاعتماد على المواد الأفيونية وانسحاب المواد الأفيونية النالتريكسون المعجل على الخلايا العصبية الجرذانية ، microglia ، والتعبير الجيني الفلكي في النواة المركزية للأميغدالا (CeA) ووفرة البكتيريا الأمعاء4. تم تحليل أربع مجموعات العلاج: 1) وهمي، 2) المورفين، 3) نالتريكسون، و 4) الانسحاب(الشكل 1). وجدنا أن الاعتماد على المواد الأفيونية لم يغير بشكل كبير التعبير الجيني ، ولكن انسحاب المواد الأفيونية أدى إلى التعبير عن الجينات الالتهابية ، Tnf على وجه الخصوص. الخلايا الفلكية كانت أكثر أنواع الخلايا تضرراً. تأثر ميكروبيوم الأمعاء بشدة بانسحاب المواد الأفيونية كما هو مبين في انخفاض نسبة Firmicutes إلى البكتيريا ، وهي علامة ثابتة على خلل التنسج الأمعاء8،9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة توماس جيفرسون وكلية الطب في جامعة دريكسل. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل جامعة توماس جيفرسون وكلية الطب في جامعة دريكسل IACUC.

1. نموذج الحيوان

  1. إدراج اثنين 75 ملغ بطيئة الإفراج عن حبيبات كبريتات المورفين أو اثنين من الكريات وهمي تحت الجلد في الفئران الذكور الكبار سبراغ-داولي.
    1. استخدام ثوب والقفازات بشكل مناسب لجراحة العقيمة البسيطة. اُزل ّ دورسوم الجرذ مع المقصات إذا لزم الأمر.
    2. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على عيون الحيوان. تهوّن الجرذ بحوالي 20 ق من استنشاق الإيزوفران. يتم تأكيد التخدير عن طريق فقدان الوعي.
    3. جعل شق خط الوسط في دورسوم الفئران مع مقص خرز ة معقمة حادة وفصل الأدمة من جدار الجسم مع مسبار خرزة تعقيمها. إدراج الكريات تحت الأدمة مع ملقط التعقيم عن بُرُب. خياطة شق مغلقة مع إبرة معقمة.
      ملاحظة: يستغرق الإجراء بأكمله حوالي 5 دقيقة لكل فأر. وتستخدم قفازات معقمة جديدة لكل الفئران.
    4. ضع الجرذ في قفص العزل للتعافي بعد الجراحة. تحقق من وجود نبض قلب وإيقاع تنفسية منتظم. مراقبة الفئران حتى يتم استعادة وعيه. تقييم لألم ما بعد الجراحة.
    5. تقييم الفئران 8 ح جراحة ما بعد وكل 12 ح بعد للشفاء والعدوى. وضع الفئران في قفص مع بقية الفوج عندما يتم استردادها تماما من الجراحة, حوالي 24 ساعة بعد الجراحة.
  2. إعطاء حقن النالتريكسون داخل البلتون (75 ملغ /كغ) إلى G والأفواج الانسحاب بعد 6 أيام من التعرض للمورفين.
    ملاحظة: كانت هناك أربعة أفواج فئران في هذه التجربة التمثيلية (انظر الشكل 1).

2- حصاد العينات

  1. حصاد الدماغ 6 أيام بعد إدراج بيليه أو 24 ساعة بعد حقن النالتريكسون.
    1. وضع الحيوان في غرفة الايفورلوران لحوالي 30 ثانية أو حتى يحدث فقدان الوعي، وأشار إلى نقص الحركة وانخفاض معدل التنفس.
    2. استخدام المقصلة حادة لقطع رأس الحيوان بسرعة.
    3. تشريح الدماغ من جمجمة الحيوان.
    4. استخدام شفرة حلاقة حادة المحمولة لجعل الشقوق الإجمالية التالية إلى الدماغ إزالتها: أولا، شريحة قبالة المخيخ والتخلص منها. ثانياً، فصل جذع الدماغ عن الدماغ الأمامي مع شق عرضي. ثالثا, hemisect الدماغ الأمامي و / أو brainstem مع شق القوس منتصف الخط.
    5. ضع الدماغ الأمامي وجذع الدماغ في قالب تضمين الأنسجة البلاستيكية مع 3-4 سم من مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) في الجزء السفلي من القالب. تغطية بقية العينة مع OCT.
    6. ضع على الفور قالب تضمين الأنسجة البلاستيكية مع العينة المغطاة بـ OCT في حمام يحتوي على الثلج الجاف والميثانول. لا تدع الميثانول يتسرب إلى قالب تضمين الأنسجة. الحفاظ على القالب التضمين مع عينة الدماغ في حمام الميثانول الجليد حتى يتم الانتهاء من جمع الأنسجة (~ 10-15 دقيقة كحد أقصى).
    7. ضع عينة الدماغ في ثلاجة -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
  2. حصاد عينات الأمعاء في وقت واحد.
    1. بعد قطع الرأس السريع، قم بعمل شق في منتصف بطن الحيوان باستخدام مشرط.
    2. العثور على أعور وقطع صلته اعلى القولون.
    3. اعصر محتويات السُقُل في أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. وضع فورا أنبوب مخروطي على الجليد الجاف ووضعها في الثلاجة -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: يمكن أيضًا جمع محتويات الأمعاء الدقيقة باستخدام نفس الطرق كتحكم سلبي.

3. تشريح

  1. شريحة الدماغ الفئران hemisected باستخدام cryostat.
    1. قم بإزالة قالب التضمين البلاستيكي مع الدماغ الأمامي من الفريزر -80 درجة مئوية ووضعه في cryostat -20 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة عينة الدماغ الأمامية المضمّنة من التضمين. استخدام شفرة حلاقة لشريحة زوايا البلاستيك تضمين العفن عموديا إذا لزم الأمر. جبل الدماغ الأمامي لrostral لتشريح الإكليل caudal على تشاك cryostat باستخدام OCT.
      ملاحظة: المعالم التشريحية لتحديد CeA تشمل الجهاز البصري والمحطة الطرفية stria(الشكل 2B). فروع الجهاز البصري من chiasm البصرية والمسارات الظهرية الجانبية كما هو شرائح الدماغ rostral إلى caudal. عندما يكون الجهاز البصري لديه مورفولوجيا مماثلة لما ينظر إليه في أطلس الدماغ الفئران bregma -2.12 ملم10، يمكن عرض شرائح الاختبار تحت المجهر. يمكن التحقق من الجهاز البصري ومورفولوجيا المحطة الطرفية stria في أطلس دماغ الفئران10 لتحديد bregma وما إذا كان CeA يحيط بمحطات stria.
    3. شريحة 10 ميكرومتر المقاطع الإكليلية سميكة من rostral الدماغ الأمامي hemisected إلى caudal حتى يتم الوصول إلى المقاطع التي تحتوي على CeA.
      ملاحظة: عرض وارتفاع المقاطع حوالي 200 مم.
    4. جمع 10 ميكرومتر أقسام تحتوي على CeA، أو منطقة الدماغ المفضلة، عن طريق ذوبان تركيب 10 مقاطع ميكرومتر على الشرائح الزجاجية العادية. وضع على الفور الشرائح الزجاجية على مقلاة معدنية يستريح على الجليد الجاف. وضع الشرائح مع أقسام الدماغ في الثلاجة -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: قد يتم وضع شرائح متعددة على نفس الشريحة. إذا كنت تستخدم بقعة نوع خلية مختلفة للشرائح على نفس الشريحة، اترك حوالي 100 مم بين الشرائح بحيث يمكن استخدام القلم الكاره للماء لفصل حلول الأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية على الشريحة. اترك حوالي 20 مم من حافة الشريحة على كل جانب من الشريحة.

4. تلطيخ الفلورة المناعية

  1. وصمي أقسام الدماغ الأمامي لخلية الدماغ التي تختارها (على سبيل المثال، الخلايا العصبية، microglia، الخلايا الفلكية، الخ) باستخدام الفلورة المناعية.
    1. قم بإزالة شريحة واحدة أو أكثر مع أقسام 10 ميكرومتر من CeA من الفريزر -80 درجة مئوية.
    2. إصلاح الشرائح مع الإيثانول 75٪ لمدة 30 s. إزالة السائل الزائد.
    3. منع شرائح لمدة 30 ثانية مع 2٪ مستضد مصل البقر (BSA) في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS). غسل 1x مع برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة حل الأجسام المضادة الأولية إلى الشريحة لمدة 2 دقيقة. غسل 1x مع 2٪ محلول BSA.
      ملاحظة: يتكون محلول الأجسام المضادة الأساسي من 2% الأجسام المضادة الأولية، 1% RNase Out، و 96% من نفس حل PBS BSA لخطوة الحجب أعلاه (الخطوة 4.1.3). واستخدمت التجربة التمثيلية جسماً مضاداً لـ "نوين"، وجسماً مضاداً لـ Cd11α، وجسماً مضاداً مضاداً لـ "جي إف بي" بالكميات التالية: 3 ميكرولتر من المواد الأولية، و1.88 ميكرولتر من مثبطات الحمض النووي الريبي، و145.12 ميكرولتر من محلول BSA.
    5. إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية إلى الشريحة لمدة 3 دقيقة. غسل 1x مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يتكون محلول الأجسام المضادة الثانوي من 1 ميكرولتر من علامة الفلورسنت المضادة للفأرة 488 نانومتر (1:500)، و2.5 ميكرولتر من مثبط الحمض النووي الريبي، و1.3 ميكرولتر من DAPI (1:10,000)، و196.5 ميكرولتر من 2٪ BSA.

5. الإيثانول وسلسلة الجفاف زيلين

  1. تراجع الشرائح في الإيثانول 75٪ لمدة 30 ثانية مباشرة بعد، تراجع الشرائح في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية مباشرة بعد، تراجع الشرائح إلى 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية مباشرة بعد، تراجع الشرائح في حاوية ثانية تحتوي على الإيثانول 100٪ لمدة 30 ثانية.
  2. بعد سلسلة الجفاف الإيثانول، تراجع الشرائح في xylene سكب حديثا لمدة 1 دقيقة. مباشرة بعد، تراجع الشرائح في حاوية ثانية من زيلين لمدة 4 دقيقة.
  3. إزالة الشرائح من حمام زيلين والسماح للهواء الجاف في الظلام لمدة 5 دقيقة.
  4. ضع الشرائح في مجفف لمدة 5 دقيقة لتجف أكثر.

6. التقاط الليزر microdissection

  1. إذا ملطخة، ضع الشريحة في المجهر والعثور على المنطقة ذات الاهتمام (CeA) باستخدام المعالم التشريحية (أي شيام البصرية والمحطة الطرفية stria).
  2. استخدام الفلورسينس لتحديد نوع الخلية الملطخة ونوتها في المنطقة ذات الاهتمام. اختر خلية واحدة أو خلايا متعددة إذا كنت تقوم بعينات مجمعة لخلية واحدة. وضع علامة على الخلايا ذات الاهتمام باستخدام برنامج LCM.
  3. ضع غطاء LCM فوق الشريحة على المنطقة المثيرة للاهتمام.
  4. استخدم لقطات اختبار ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) لضبط قوة الليزر بالأشعة تحت الحمراء وحجمها والمدة بحيث تذوب مادة غطاء LCM فقط على مساحة الخلية المفردة المحددة. وهذا يضمن أنه لن يتم جمع أي خلايا أخرى غير الخلايا المحددة.
    ملاحظة: في هذه التجربة التمثيلية، تم استخدام 10 تجمعات خلايا من نفس نوع الخلية كعينة واحدة للحد من التباين بين الخلية والخلية في التعبير الجيني بين العينات بنفس العلاج. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتجارب الخلية المفردة الحقيقية1،3.
  5. حدد الخلايا الفردية التي سيتم جمعها للتحليل باستخدام أدوات برامج LCM(الشكل 2C). يجب أن تكون الخلايا المختارة في المنطقة التشريحية لـ CeA (أو منطقة الدماغ المختارة) استنادًا إلى أطلس دماغ الفئران والبريجة10. يجب أن تكون الخلايا على الأقل 3 ميكرومتر من النوى الملطخة المجاورة.
  6. اطلاق النار على الليزر الأشعة تحت الحمراء لجمع الخلايا واحدة محددة.
  7. ضع الغطاء في محطة مراقبة الجودة (QC) وعرضها لضمان تحديد الخلايا المطلوبة فقط. إذا تم اختيار خلايا أخرى عن طريق الخطأ، يمكن استخدام الليزر فوق البنفسجي لتدمير الخلايا غير المرغوب فيها بينما يبقى الغطاء في محطة مراقبة الجودة.
  8. التقاط صورة لقسم الأنسجة من حيث تم جمع الخلية لتوثيق خصوصيتها التشريحية. تسجيل مسافة الشريحة من البريجما إذا كان ذلك مناسبا باستخدام أطلس الدماغ الفئران كمرجع10.
  9. قم بإزالة غطاء LCM من محطة مراقبة الجودة، وإرفاق جهاز استخراج العينة، وميكروس 5.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانسياليس على العينة.
    ملاحظة: يتكون محلول العازلة للإنحلال من 0.5 ميكرولتر من محسن الليزس و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق.
  10. تناسب الجهاز ExtracSure على أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 مل ووضعها على لوحة ساخنة في 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  11. قم بتدوير العينة والمخزن المؤقت للانفصال لمدة 30 ث بسرعة منخفضة (0.01-0.02 x g)ووضع العينة التي تم جمعها في ثلاجة -80 درجة مئوية.

7. خلية واحدة microfluidic RT-qPCR

  1. Preamplification من مرنا خلية واحدة ل96.96 رقاقة الصفيف الديناميكي
    1. الجمع بين التمهيديات الجينية mRNA qPCR إلى الأمام والخلف لجميع الجينات التي يتم تعيينها في تجمع التمهيدي لpreamplification (تركيز 500 nM كل التمهيدي). على سبيل المثال، 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر في 80 ميكرولتر بالإضافة إلى 120 ميكرولتر من عازل تعليق الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن العثور على تسلسل التمهيدي المستخدمة للتجربة التمثيلية في أوسوليفان وآخرون4.
    2. في لوحة جديدة 96 × 96 PCR، إضافة 1 ميكرولتر من 5x VILO إلى كل بئر.
    3. إزالة عينات الخلية الواحدة LCM من العينات المخزنة في -80 درجة مئوية، والسماح للذوبان لفترة وجيزة، والطرد المركزي لفترة وجيزة بسرعة منخفضة (0.01-0.02 × ز)،وإضافة 5.5 ميكرولتر من عينة خلية واحدة لخلية واحدة إلى لوحة PCR. يتم إضافة كل عينة إلى بئر الخاصة بها.
    4. ضع لوحة PCR مع العينات وفيلو في cycler الحرارة والحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. قم بتدوير اللوحة لمدة دقيقة واحدة عند 1300 × ز عند 4 درجات مئوية ووضع اللوحة على الجليد.
    5. إضافة 0.15 ميكرولتر من 10x cDNA التوليف مزيج رئيسي، 0.12 ميكرولتر T4 جين 32 البروتين، و 0.73 ميكرولتر من الحمض النووي تعليق العازلة إلى كل بئر.
    6. ضع لوحة PCR في cycler وتشغيل البروتوكول التالي: 25 درجة مئوية لمدة 5 سنوات، 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، 60 درجة مئوية لمدة 5 سنوات، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 4 درجات مئوية لإنهاء.
    7. إضافة 7.5 ميكرولتر من مزيج ماجستير من طاقة البوليميراز إلى كل بئر.
    8. أضف 1.5 ميكرولتر من تجمع التمهيدي (انظر أعلاه) إلى كل بئر.
    9. ضع لوحة PCR في cycler وتشغيل بروتوكول preamplification التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، تليها 22 دورة من 96 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 4 ثوان.
    10. إضافة 0.6 ميكرولتر من exonuclease أنا رد فعل العازلة 10x، 1.2 ميكرولتر exonuclease I، و 4.2 μL من الحمض النووي تعليق العازلة إلى كل بئر.
    11. ضع لوحة PCR في cycler وتشغيل البروتوكول التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    12. إضافة 54 ميكرولتر من العازلة TE إلى كل بئر. قم بتدوير لوحة PCR عند 1300 × ز عند 5 درجات في المتجر عند درجة حرارة 4 درجة مئوية إذا استمر على الفور في الخطوة التالية. تخزين في -20 درجة مئوية إذا كان الانتظار أكثر من 12 ساعة للخطوة التالية.
  2. إعداد لوحة العينة لرقاقة الصفيف الديناميكي 96.96.
    1. في لوحة جديدة 96 جيدا PCR، إضافة 0.45 ميكرولتر من 20x صبغة ملزمة الحمض النووي و 4.55 ميكرولتر من mastermix ROX منخفضة إلى كل بئر.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من عينة مضخمة إلى كل بئر، تدور لوحة PCR في 1300 × ز،ثم وضع لوحة على الجليد.
  3. إعداد لوحة الاسهي لرقاقة 96.96 صفيف ديناميكي.
    1. في لوحة جديدة 96 جيدا PCR، إضافة 3.75 ميكرولتر من 2x GE فحص تحميل كاشف و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي تعليق العازلة إلى كل بئر.
    2. أضف 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر qPCR التمهيدي لكل بئر المقابلة. قم بتدوير لوحة PCR عند 1300 × ز لمدة 5 سنوات.
  4. تحميل وتشغيل 96.96 رقاقة الصفيف الديناميكي.
    1. رئيس رقاقة مع السائل خط التحكم.
    2. ضع الشريحة في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية HX وتشغيل البرنامج النصي Prime (136X).
    3. أضف 6 ميكرولتر من العينة من لوحة عينة PCR إلى آبار العينة المقابلة في شريحة الصفيف الديناميكي 96.96.
    4. أضف 6 ميكرولتر من العينة من لوحة تحليل PCR إلى آبار العينات المقابلة في شريحة الصفيف الديناميكي 96.96.
    5. استخدام الإبر لموسيقى البوب أي فقاعات الهواء في الآبار من 96.96 رقاقة الصفيف الديناميكي.
    6. ضع شريحة الصفيف الديناميكي 96.96 في وحدة تحكم IFC HX وتشغيل برنامج Load Mix (136x).
    7. قم بإزالة الشريحة من وحدة تحكم IFC HX، وقشر الملصق الواقي، ووضع شريحة الصفيف الديناميكي 96.96 في منصة RT-qPCR microfluidic. تشغيل بروتوكول جنرال إلكتريك السريع 96 × 96 PCR (30 دورة).
      ملاحظة: يتم تقييم جودة الحمض النووي الريبي وصلاحية النتائج من خلال طرق متعددة، بما في ذلك التحقق من صحة القياس عن طريق الكهربية الهلامية، ومنحنيات درجة الحرارة الذوبان، وعينة وعينات يكرر، ومخططات سلسلة تخفيف القياسية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحقق من صحة النتائج النسخية من خلال طرق مستقلة على تشريح الدماغ بما في ذلك بقع اللطخة الغربية واختبارات الفلورالمناعي.

8. قياس وفرة البكتيرية مع microfluidic RT-qPCR

  1. استخراج الحمض النووي البكتيري بعد الاتجاهات من طقم استخراج الحمض النووي البراز.
  2. تقدير تركيز الحمض النووي البكتيري باستخدام qPCR.
  3. أضف الحمض النووي البكتيري المستخرج إلى لوحة PCR جديدة. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي البكتيري المستخرج و 9 ميكرولتر من المخزن المؤقت تعليق الحمض النووي.
  4. إعداد لوحة التقطيع لرقاقة الصفيف الديناميكي 48.48 (انظر الخطوات 7.2.1-7.2.2)
  5. إعداد لوحة العينة لرقاقة الصفيف الديناميكي 48.48 (انظر الخطوات 7.3.1-7.3.2)
    1. في لوحة جديدة 96 جيدا PCR، إضافة 0.45 ميكرولتر من 20x صبغة ملزمة الحمض النووي و 4.55 ميكرولتر من ماجستير روكس منخفضة إلى 48 الآبار.
    2. أضف 3 ميكرولتر من العينة من لوحة PCR التي تحتوي على الحمض النووي البكتيري إلى الآبار الـ 48 وتدور أسفل لوحة PCR عند 1300 × ز لمدة 5 دقيقة.
  6. تحميل وتشغيل رقاقة الصفيف الديناميكي 48.48 (انظر الخطوات 7.4.1-7.4.7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم التحقق من صحة اختيار الخلايا المفردة بصريًا وجزيئيًا. بصريا، تم عرض مورفولوجيا الخلوية قبل جمع الخلايا. ثم تم عرض الخلايا التي تم جمعها في محطة مراقبة الجودة وتداخلت وصمة النواة الخلوية (DAPI) مع علامة اختيار الخلية الواحدة. يوضح الشكل 2A صورًا تمثيلية لشريحة تحتوي على الدماغ الأمامي للفئران المنقسمة التي تحتوي على CeA. الصور اللاحقة(الشكل 2B-D)تظهر اختيار الخلايا المفردة وإزالتها من الأنسجة للتحليل النسخي. جزيئياً، أظهرت العلامات الخاصة بنوع الخلية زيادة التعبير في هذا النوع من الخلايا(الشكل 1C). بحثنا في الخلايا العصبية، microglia، والخلايا الفلكية وقياس التعبير من NeuN، ماف، وGfap،على التوالي. وقد نُشرت هذه الأرقام في الأصل في صحيفة أوسوليفان وآخرون4.

علاوة على ذلك، يمكن أيضًا تشغيل الضوابط في منصة microfluidic للتحقق من صحة نتائج التعبير (على سبيل المثال، تحليل مناطق أخرى من نفس الأنسجة لإثبات خصوصية النواة). ويمكن أيضا مقارنة الأنسجة منفصلة إلى العينة المطلوبة لإثبات خصوصية التمهيدي في الأنسجة ذات الاهتمام. ويمكن أيضا إدراج جينات التحكم الإيجابية والسلبية (على سبيل المثال، الجينات المعروفة إما أن تكون غائبة عن الأنسجة المختارة أو أعرب عنها بشكل كبير). وينبغي أيضا إدراج ثلاثة أو أربعة جينات التدبير المنزلي ليس فقط لأغراض تطبيع البيانات ولكن أيضا كمقياس للجودة التجريبية. يجب أن تظهر هذه الجينات أدنى تباين في التعبير عبر جميع العينات والعلاجات. في هذه التجربة التمثيلية ، لم يتم تعيين أي منطقة دماغ بديلة ، ولكن تم استخدام جينات التدبير المنزلي Ldha و Actb للتطبيع. تم استخدام Gapdh كرقابة داخلية.

يعرض الشكل 3 بعض الطرق المتعددة المتغيرات التي استخدمتها مجموعتنا لتحليل بياناتنا. وجدنا أن الخلايا الفلكية في مجموعة الانسحاب كانت أكثر أنواع الخلايا تضرراً. استنادا إلى هذه البيانات في سياق دراسات أخرى نتكهن بأن الخلايا الفلكية تلعب دورا رئيسيا في التهاب في CeA أثناء انسحاب المواد الأفيونية وأن هذا يساهم في الأعراض الجسدية والعاطفية التي تدفع البحث عن المخدرات عن طريق التعزيز السلبي. كما نعرض بيانات البكتيريا الأمعاء(الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: سير عمل RT-qPCR أحادي الخلية والتغايرية النسخة. (أ)بروتوكول تجريبي (ن = 4 لكل شرط)(B)عشرة خلايا مجمعة قياس النسخ. (C)شريط مؤامرة يعرض قيم التعبير المتوسط -ΟCt. الخلايا العصبية = الأرجواني; microglia = أصفر؛ الخلايا الفلكية = الأخضر. تعرض أشرطة الخطأ خطأ ً قياسياً. *p < 0.05, ***p < 0.0003; اختبار أهمية (توكي) الصادق (د)تُظهر خريطة الحرارة تعبير جميع العينات عبر 40 جينًا من الجينات المنسّبة. الصفوف هي عينات مجمعة من 10 خلايا (930 عينة عصبية، 950 عينة ميكروجلية، 840 عينات من الخلايا الفلكية كما هو موضح)؛ الأرقام تدل على مجموعات العينة والأعمدة هي الجينات. تم تعديل هذا الرقم من أوسوليفان وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور التقاط الليزر microdissection. (أ)أربع شرائح من الدماغ الأمامي الفئران المجففة التي تحتوي على CeA على شريحة. تم وضع شرائح على الشريحة بالضبط 10 ميكرون من الشريحة السابقة. اليسار هو الأمامي واليمين هو الخلفي. يمكن تقدير المسافة من البريجما باستخدام أطلس دماغ الفئران والمعالم ، بما في ذلك الجهاز البصري والمحطة الطرفية stria. (B-D) تسلسل الصور التي تبين اختيار خلايا واحدة في CeA(C)وإزالتها من الأنسجة(D). تم استخدام قبعات LCM متعددة لتحديد هذه الخلايا. يتم استخدام غطاء واحد لاختيار 10 خلايا من نوع خلية واحدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النتائج التمثيلية 1. (أ)رسم كاريكاتوري لخلية تعرض الجينات المنسّقة وموقعها. الرموز الجينية المسماة هنا هي مرجع لللوحة B.(B)تمثل المربعات الملونة التعبير الجيني النسبي (متوسط -قيمة Ct) للجينات الممثلة في اللوحة A. يمثل موقع المربعات التعريب الخلوي أو وظيفة البروتين المقابل. تعرض اللوحات التعبير الجيني النسبي الذي يمثله اللون عبر العلاجات وأنواع الخلايا. الأصفر = التعبير العالي؛ الأزرق = التعبير المنخفض؛ أبيض = تعبير محايد. تم تعديل هذا الرقم من أوسوليفان وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية 2. (أ)شبكات ارتباط الجينات. تم تنفيذ ارتباط بيرسون على قيم -ΟΟCt داخل نوع العلاج والخلية. العقد تدل على الجينات ولونها يدل على مستويات التعبير النسبي (متوسط -ΟCt قيمة لكل جين). تشير الحواف إلى ارتباطات التعبير ويدل السماكة على قوة ارتباط التعبير (ο). يتم عرض الارتباطات مع q-value <0.001. الحواف السوداء = الارتباطات الإيجابية؛ الحواف الخضراء = الارتباطات السلبية. (ب)شريط المؤامرات من الجينات المختارة مما يدل على التعبير الجيني التفاضلي كبيرة. تم حساب الإحصاءات باستخدام المتداخلة ANOVA #p < 0.1، *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.0001 (ن = 4 الحيوانات لجميع العلاجات). تم تعديل هذا الرقم من أوسوليفان وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الوفرة النسبية للميكروبات الأمعاء. تعرض المخططات البرية الوفرة النسبية للأنواع البكتيرية (-قيم CtCt). #p < 0.1، *p < 0.05، **p < 0.008، ***p = 0.0009؛ في اتجاهين ANOVA; ن = 4 الحيوانات لكل علاج. تم تعديل هذا الرقم من أوسوليفان وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أظهرت البيولوجيا وحيدة الخلية عدم تجانس الأنماط الظاهرية الخلوية ومتانة وظيفة الأنسجة. وقد وفرت هذه النتائج نظرة ثاقبة على تنظيم النظم البيولوجية على المستويين الكلي والجزئي. هنا ، نصف الجمع بين طريقتين ، LCM وqPCR microfluidic ، للحصول على مقاييس النسخ أحاديالخلية التي توفر خصوصية تشريحية ودقة النسخ بتكلفة منخفضة نسبيًا(الشكل 1). تأخذ مجموعتنا نهجًا بيولوجياً للأنظمة وغالباً ما تقيس أنسجة متعددة في نفس الحيوان. ونجد أن هذه الأساليب مرنة ومثمرة في تحديد كيفية استجابة النظم البيولوجية لمختلف التحديات على المستوى النسخي. بالإضافة إلى ذلك، نستخدم هذه الأساليب في رسم الخرائط التشريحية للأنماط الظاهرية الخلوية في ظروف خط الأساس.

نحن نقدم بيانات وأرقام معدلة من منشور حديث يستكشف كيفية استجابة CeA للاعتماد على المواد الأفيونية والانسحاب4. في هذا المثال، استخدمنا نفس منصة qPCR الميكروسائلية لقياس الوفرة النسبية للميكروبات الأمعاء. وتُلخص الأساليب وسير العمل في الشكل 1 ونُشرت أصلاً في أوسوليفان وآخرون4. يمكن التحقق من النتائج الرئيسية من الإنتاجية العالية microfluidic RT-qPCR في وقت لاحق من خلال تدابير البروتين مثل لطخة الغربية أو الفلور المناعي4.

ويتمثل أحد التحديات الرئيسية لهذا النهج البيولوجي للنظم في تحديد آليات بيولوجية سببية محددة. المنطق غامض هو حل التحقق من صحتها التي قمنا بتوظيفها مع النجاح لاستنتاج وكلاء في سلوك شبكة تنظيم الجينات2. ويمكن أيضا استخدام التلاعب بالنماذج الحيوانية لتوفير نظرة ثاقبة على الآليات النظامية. على سبيل المثال ، فإن نفس البروتوكول المقدم هنا مع إضافة مجموعة الفئران مع بضع الفصان المعدي سوف ينتج بيانات توفر نظرة ثاقبة لتدفق المعلومات عبر العصب المبهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل العمل المقدم هنا من خلال المعاهد القومية للصحة HLB U01 HL133360 الممنوحة لJS و RV، NIDA R21 DA036372 منحت لJS و EVB، وT32 AA-007463 منحت ليان هوك دعما لSJO's.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-48.48 NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
GFAP Monoclonal Antibody ThermoFisher Scientific A-21294 Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A28175 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

Tags

علم الوراثة، العدد 157، التعبير الجيني خلية واحدة، التقاط الليزر microdissection، qPCR microfluidic، الاعتماد على المواد الأفيونية، خصوصية تشريحية، أميغدالا، ميكروبيوم الأمعاء، جليا
الجمع بين الليزر التقاط Microdissection وMicrofluidic qPCR لتحليل الملامح النسخية للخلايا المفردة: نهج بيولوجيا النظم للاعتماد على المواد الأفيونية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S.,… More

O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence. J. Vis. Exp. (157), e60612, doi:10.3791/60612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter