Summary
Dieses Protokoll erklärt, wie einzelne Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem zentralen Kern der Amygdala mit hoher Genauigkeit und anatomischer Spezifität mit Laser-Capture-Mikrodissektion zu sammeln. Darüber hinaus erklären wir unsere Verwendung von mikrofluidischem RT-qPCR, um eine Teilmenge des Transkriptoms dieser Zellen zu messen.
Abstract
Die tiefgreifende transkriptionelle Heterogenität in anatomisch angrenzenden Einzelzellen legt nahe, dass eine robuste Gewebefunktionalität durch zelluläre Phänotypvielfalt erreicht werden kann. Einzelzellige Experimente, die die Netzwerkdynamik biologischer Systeme untersuchen, zeigen zelluläre und Gewebereaktionen auf verschiedene Bedingungen bei biologisch sinnvoller Auflösung. Hierin erklären wir unsere Methoden zur Sammlung einzelner Zellen an anatomisch spezifischen Stellen und zur genauen Messung einer Teilmenge ihrer Genexpressionsprofile. Wir kombinieren Lasercapture Microdissection (LCM) mit mikrofluidischen Reverse Transkriptionsquantitativepolymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR). Wir verwenden diese mikrofluidische RT-qPCR-Plattform, um die mikrobielle Fülle von Darminhalten zu messen.
Introduction
Die Messung der Genexpressionsprofile einzelner Zellen hat eine umfassende phänotypische Heterogenität innerhalb eines Gewebes gezeigt. Diese Komplexität hat unser Verständnis der biologischen Netzwerke, die die Gewebefunktion steuern, erschwert. Unsere Gruppe und andere haben dieses Phänomen in vielen Geweben und Bedingungen1,2,3,4,5,6untersucht. Diese Experimente deuten nicht nur darauf hin, dass die Regulierung von Genexpressionsnetzwerken einer solchen Heterogenität zugrunde liegt, sondern auch, dass die einzellige Auflösung eine Komplexität in der Gewebefunktion offenbart, die die Gewebeauflösung nicht zu schätzen weiß. Tatsächlich kann nur eine kleine Minderheit von Zellen auf eine bestimmte Erkrankung oder Herausforderung reagieren, aber die Auswirkungen dieser Zellen auf die allgemeine Physiologie können erheblich sein. Darüber hinaus kann ein systembiologischer Ansatz, der multivariate Methoden auf hochdimensionale Datasets aus mehreren Zelltypen und Geweben anwendet, systemweite Behandlungseffekte aufklären.
Wir kombinieren LCM und mikrofluidische RT-qPCR, um solche Datensätze zu erhalten. Wir verfolgen diesen Ansatz hier im Gegensatz zur Erfassung einzelner Zellen über fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und der Verwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-Seq), um ihr Transkriptom zu messen. Der Vorteil von LCM gegenüber FACS ist, dass die exakte anatomische Spezifität einzelner Zellen mit LCM relativ und absolut dokumentiert werden kann. Während RNA-seq mehr Funktionen messen kann, als RT-qPCR, ist der mikrofluidische RT-qPCR kostengünstiger und hat eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität7.
In diesem repräsentativen Experiment untersuchten wir die Auswirkungen von Opioidabhängigkeit und Naltrexon-gefälltem Opioidentzug auf die neuronale, mikroglia und astrozyte Genexpression der Ratte im zentralen Kern der Amygdala (CeA) und Darmmikroflora Fülle4. Vier Behandlungsgruppen wurden analysiert: 1) Placebo, 2) Morphin, 3) Naltrexon und 4) Entzug (Abbildung 1). Wir fanden heraus, dass die Opioidabhängigkeit die Genexpression nicht wesentlich verändert, sondern dass der Opioid-Entzug die Expression entzündlicher Gene, insbesondere Tnf, induzierte. Astrozyten waren der am stärksten betroffene Zelltyp. Das Darmmikrobiom wurde durch Opioid-Entzug stark beeinflusst, wie durch eineAbnahme des Firmicutes-Zu-Bacteroides-Verhältnisses angezeigt wird, das ein etablierter Marker für Darmdysbiose8,9 ist.
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Protocol
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University und des Drexel University College of Medicine durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University und dem Drexel University College of Medicine IACUC genehmigt.
1. Tiermodell
- Fügen Sie zwei 75 mg langsam freisetzende Morphinsulfat-Pellets oder zwei Placebo-Pellets subkutan bei erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten ein.
- Verwenden Sie ein Kleid und Handschuhe entsprechend für kleinere sterile Operationen. Rasieren Sie die Ratte dorsum mit Clippers, wenn nötig.
- Tragen Sie die Tierarztsalbe auf die Augen des Tieres auf. Anästhetisieren Sie die Ratte mit etwa 20 s Isofluran-Inhalation. Anästhesie wird durch Bewusstseinsverlust bestätigt.
- Machen Sie einen Mittellinienschnitt im Rattendorsum mit perlensterilisierter stumpfer Schere und trennen Sie die Dermis mit einer perlensterilisierten Sonde von der Körperwand. Legen Sie die Pellets unter die Dermis mit Perlensterilisierten Zangen. Den Schnitt mit einer sterilen Nadel schließen.
HINWEIS: Das gesamte Verfahren dauert ca. 5 min pro Ratte. Für jede Ratte werden frische sterile Handschuhe verwendet. - Legen Sie die Ratte in einen Isolationskäfig für die postoperative Genesung. Überprüfen Sie einen Herzschlag und einen regelmäßigen Atemrhythmus. Beobachten Sie die Ratte, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Bewerten Sie postchirurgische Schmerzen.
- Bewerten Sie die Ratten 8 h Postchirurgie und alle 12 h nach für die Genesung und Infektion. Legen Sie Ratten in einen Käfig mit dem Rest der Kohorte, wenn sie vollständig von der Operation erholt sind, etwa 24 h Postchirurgie.
- Geben Sie eine intraperitoneale Naltrexon-Injektion (75 mg/kg) an die G- und die Entzugskohorten nach 6 Tagen Morphin-Exposition.
ANMERKUNG: In diesem repräsentativen Experiment gab es vier Rattenkohorten (siehe Abbildung 1).
2. Probenernte
- Ernten Sie das Gehirn 6 Tage nach dem Einsetzen der Pellet oder 24 h nach der Naltrexon-Injektion.
- Legen Sie das Tier in einer Isofluran-Kammer für ca. 30 s oder bis Bewusstseinsverlust auftritt, angezeigt durch Bewegungsmangel und verminderte Atemfrequenz.
- Verwenden Sie eine scharfe Guillotine, um das Tier schnell zu enthaupten.
- Sezieren Sie das Gehirn aus dem Schädel des Tieres.
- Verwenden Sie einen scharfen Handrasierer, um die folgenden groben Einschnitte auf das entfernte Gehirn zu machen: Schneiden Sie zuerst das Kleinhirn ab und entsorgen Sie es. Zweitens, trennen Sie das Hirnstamm vom Vorderhirn mit einem Querschnitt. Drittens, hemisect das Vorderhirn und/oder Hirnstamm mit einem Mittellinien-Sagittal-Inzission.
- Legen Sie das Vorderhirn und das Hirnstamm in eine Kunststoff-Gewebeeinbettungsform mit 3-4 cm optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT) im Boden der Form. Bedecken Sie den Rest der Probe mit OCT.
- Legen Sie die Kunststoff-Gewebeeinbettungsform mit der mit OCT bedeckten Probe sofort in ein Bad mit Trockeneis und Methanol. Lassen Sie das Methanol nicht in die gewebeeinbettende Form austreten. Halten Sie die Einbettungsform mit der Hirnprobe im Methanol-Eisbad, bis die Gewebesammlung abgeschlossen ist (maximal 10-15 min).
- Legen Sie die Hirnprobe so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank.
- Ernten Sie die Darmproben gleichzeitig.
- Nach einer schnellen Enthauptung, machen Sie einen Mittellinienschnitt in den Bauch des Tieres mit einem Skalpell.
- Finde das Cecum und trenne seine Verbindung zum aufsteigenden Dickdarm.
- Drücken Sie den Cecal-Inhalt in ein 15 ml konisches Rohr.
- Das konische Rohr sofort auf Trockeneis legen und so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank geben.
HINWEIS: Der Dünndarmgehalt kann auch mit den gleichen Methoden wie eine negative Kontrolle gesammelt werden.
3. Schneiden
- Schneiden Sie den halbveränderten Rattenvorhirn mit einem Kryostat.
- Entfernen Sie die Kunststoff-Einbettform mit dem Vorderhirn aus dem Gefrierschrank von -80 °C und legen Sie sie in einen -20 °C-Kryostat.
- Entfernen Sie die OCT-eingebettete, hemisekte Vorhirnprobe aus der Einbettform. Verwenden Sie ein Rasiermesser, um die Ecken der Kunststoffeinbettform bei Bedarf vertikal zu schneiden. Montieren Sie das Vorderhirn für rostrales bis kaudales koronales Schneiden auf einem Kryostatfutter mit OCT.
HINWEIS: Anatomische Sehenswürdigkeiten zur Identifizierung des CeA umfassen den Optiktrakt und die Stria terminalis (Abbildung 2B). Der Optiktrakt verzweigt sich vom optischen Chiasm und verfolgt dorsal-lateral, da das Gehirn rostral bis kaudal geschnitten wird. Wenn der Optiktrakt eine Morphologie hat, die dem ähnelt, was in einem Rattenhirnatlas -2,12 mm10zu sehen ist, können Testscheiben unter dem Mikroskop betrachtet werden. Der Optiktrakt und die Stria terminalis Morphologie können in einem Rattenhirnatlas10 überprüft werden, um das Bregmäat zu identifizieren und festzustellen, ob das CeA die Stria-Terminals umgibt. - Schneiden Sie 10 'm dicke koronale Abschnitte von der halbherzigen Vorhirnrostral bis kaudal, bis Abschnitte, die das CeA enthalten erreicht sind.
HINWEIS: Die Breite und Höhe der Abschnitte beträgt ca. 200 mm. - Sammeln Sie 10 m Abschnitte, die den CeA oder die bevorzugte Hirnregion enthalten, indem Sie 10 m Abschnitte auf glatten Glasgletten auftauen. Legen Sie die Glasgleitet sofort auf eine Metallpfanne, die auf Trockeneis ruht. Legen Sie die Dias mit Hirnprofilen so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank.
HINWEIS: Mehrere Slices können auf derselben Folie platziert werden. Wenn Sie einen anderen Zelltyp-Fleck für Scheiben auf demselben Dia verwenden, lassen Sie etwa 100 mm zwischen den Scheiben, sodass ein hydrophober Stift verwendet werden kann, um zelltypspezifische Antikörperlösungen auf dem Dia zu trennen. Lassen Sie etwa 20 mm vom Rand der Rutsche auf jeder Seite der Scheibe.
4. Immunfluoreszenzfärbung
- Färben Sie die Vorderhirnabschnitte für die Gehirnzelle Ihrer Wahl (z. B. Neuron, Mikroglia, Astrozyten usw.) mit Immunfluoreszenz.
- Entfernen Sie eine oder mehrere Dias mit 10 m Abschnitten des CeA aus dem Gefrierschrank -80 °C.
- Befestigen Sie die Dias mit 75% Ethanol für 30 s. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit.
- Blockieren Sie die Scheiben für 30 s mit 2% Rinderserumantigen (BSA) in 1x Phosphatpufferkochin (PBS). 1x mit PBS waschen.
- Fügen Sie dem Dia eine primäre Antikörperlösung für 2 min hinzu. 1x mit 2% BSA-Lösung waschen.
HINWEIS: Die primäre Antikörperlösung besteht aus 2% primärem Antikörper, 1% RNase Out und 96% derselben BSA PBS-Lösung für den oben genannten Blockierungsschritt (Schritt 4.1.3). Das repräsentative Experiment verwendete einen Anti-NeuN-Antikörper, einen Anti-Cd11-Antikörper und einen Anti-GFAP-Antikörper in den folgenden Mengen: 3 l primär, 1,88 l RNA-Hemmer und 145,12 L BSA-Lösung. - Fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung auf die Folie für 3 min. Waschen Sie 1x mit PBS.
HINWEIS: Die sekundäre Antikörperlösung besteht aus 1 l Ziegenanti-Maus 488 nm Fluoreszenz-Tag (1:500), 2,5 l RNA-Hemmer, 1,3 l DAPI (1:10.000) und 196,5 l mit 2% BSA.
5. Ethanol- und Xylol-Dehydrierungsserie
- Tauchen Sie die Dias in 75% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in einen zweiten Behälter mit 100% Ethanol für 30 s.
- Nach der Ethanol-Dehydrierungsserie tauchen Sie die Dias für 1 min in frisch gegossenes Xylol. Tauchen Sie die Dias unmittelbar danach für 4 min in einen zweiten Behälter mit Xylol.
- Entfernen Sie die Dias aus dem Xylolbad und lassen Sie die Luft im Dunkeln für 5 min trocknen.
- Legen Sie die Dias in einem Trockenbau für 5 min weiter trocknen.
6. Laser-Capture-Mikrodissektion
- Wenn sie gefärbt sind, legen Sie das Dia in das Mikroskop und finden Sie die Region von Interesse (CeA) mit anatomischen Landmarken (d. h. dem optischen Chiasm und Stria terminalis).
- Verwenden Sie Fluoreszenz, um den gefärbten Zelltyp und seinen Kern im Interessenbereich zu identifizieren. Wählen Sie eine Zelle oder mehrere Zellen aus, wenn Sie einzelzellgepoolte Stichproben verwenden. Markieren Sie die von Interesse sindden Zellen mit Der LCM-Software.
- Platzieren Sie die LCM-Kappe auf der Scheibe auf der Interessenregion.
- Verwenden Sie Testaufnahmen eines Infrarotlasers (IR), um die IR-Laserstärke, -größe und -dauer so einzustellen, dass der LCM-Kappenkleber nur über den Bereich der ausgewählten Einzelzelle schmilzt. Dadurch wird sichergestellt, dass keine anderen Zellen als die ausgewählten Zellen gesammelt werden.
HINWEIS: In diesem repräsentativen Experiment wurden 10 Zellpools desselben Zelltyps als Einzelprobe verwendet, um die Zell-zu-Zell-Variabilität in der Genexpression zwischen Proben mit derselben Behandlung zu begrenzen. Diese Methode kann jedoch für echte Einzelzellexperimente verwendet werden1,3. - Wählen Sie die einzelnen Zellen aus, die für die Analyse mit den LCM-Softwaretools gesammelt werden sollen (Abbildung 2C). Die ausgewählten Zellen müssen sich im anatomischen Bereich des CeA (oder der Gehirnregion der Wahl) befinden, die auf dem Hirnatlas der Ratte und dem Bregma10basiert. Die Zellen sollten mindestens 3 m von den angrenzenden gebeizten Kernen entfernt sein.
- Feuern Sie den IR-Laser ab, um die identifizierten Einzelzellen zu sammeln.
- Platzieren Sie die Kappe in der Qualitätskontrollstation (QC), und zeigen Sie sie an, um sicherzustellen, dass nur die gewünschten Zellen ausgewählt wurden. Wenn andere Zellen irrtümlich ausgewählt wurden, kann ein ultravioletter Laser verwendet werden, um die unerwünschten Zellen zu zerstören, während die Kappe in der QC-Station verbleibt.
- Nehmen Sie ein Foto des Gewebeabschnitts auf, von dem aus die Zelle gesammelt wurde, um ihre anatomische Spezifität zu dokumentieren. Zeichnen Sie ggf. den Abstand der Scheibe vom Bregma mit einem Rattenhirnatlas als Referenz10auf.
- Entfernen Sie die LCM-Kappe von der QC-Station, befestigen Sie die Probenextraktionsvorrichtung und die Pipette 5,5 l Lysepuffer an der Probe.
ANMERKUNG: Die Lyse-Pufferlösung besteht aus 0,5 l Lyse-Enhancer und 5 l Resuspensionspuffer. - Das ExtracSure-Gerät auf ein 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr aufstellen und 15 min bei 75 °C auf eine Kochplatte legen.
- Drehen Sie die Probe und den Lysepuffer für 30 s bei niedriger Geschwindigkeit (0,01-0,02 x g) und legen Sie die gesammelte Probe in einen -80 °C-Gefrierschrank.
7. Einzelliges mikrofluidisches RT-qPCR
- Vorverstärkung der einzelzelligen mRNA für 96,96 Dynamic Array Chip
- Kombinieren Sie die vorwärts- und rückwärts mRNA qPCR-Genprimer für alle Gene, die in einem Primerpool zur Vorverstärkung untersucht werden (500 nM Konzentration pro Primer). Zum Beispiel 1 l von 100 -M Primern in 80 l plus 120 l DNA Suspension Buffer.
HINWEIS: Die für das repräsentative Experiment verwendeten Primersequenzen finden Sie in O'Sullivan et al.4. - In einer neuen 96 x 96 PCR-Platte, fügen Sie 1 l 5x VILO zu jedem Brunnen hinzu.
- LCM-Einzelzellproben aus den bei -80 °C gelagerten Proben entfernen, kurz auftauen lassen, bei niedriger Geschwindigkeit (0,01-0,02 x g)kurz zentrieren und 5,5 l der lysierten Einzelzellprobe zur PCR-Platte hinzufügen. Jedes Beispiel wird zu seinem eigenen Brunnen hinzugefügt.
- Die PCR-Platte mit den Proben und VILO in den Thermocycler geben und bei 65 °C 1,5 min erhitzen. Drehen Sie die Platte 1 min bei 1.300 x g bei 4 °C und legen Sie die Platte auf Eis.
- Fügen Sie 0,15 l 10x cDNA-Synthese-Master-Mix, 0,12 L T4 Gene 32-Protein und 0,73 l DNA-Suspensionspuffer zu jedem Brunnen hinzu.
- Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll aus: 25 °C für 5 min, 50 °C für 30 min, 55 °C für 25 min, 60 °C für 5 min, 70 °C für 10 min, 4 °C bis Ende.
- Fügen Sie jedem Brunnen 7,5 l Taq-Polymerase-Master-Mix hinzu.
- Fügen Sie jedem Brunnen 1,5 L des Primerpools (siehe oben) hinzu.
- Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das folgende Vorverstärkungsprotokoll aus: 95 °C für 10 min, gefolgt von 22 Zyklen von 96 °C für 5 Sek., 60 °C für 4 min.
- Fügen Sie jedem Bohrwert 0,6 l Exonuklease-I-Reaktionspuffer 10x, 1,2 l Exonuklease I und 4,2 l DNA-Suspensionspuffer hinzu.
- Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll aus: 37 °C für 30 min, 80 °C für 15 min.
- Fügen Sie jedem Bohrwert 54 L TE-Puffer hinzu. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g bei 5 min. Bei 4 °C lagern, wenn Sie sofort weiter zum nächsten Schritt gehen. Bei -20 °C lagern, wenn Sie mehr als 12 h auf den nächsten Schritt warten.
- Kombinieren Sie die vorwärts- und rückwärts mRNA qPCR-Genprimer für alle Gene, die in einem Primerpool zur Vorverstärkung untersucht werden (500 nM Konzentration pro Primer). Zum Beispiel 1 l von 100 -M Primern in 80 l plus 120 l DNA Suspension Buffer.
- Bereiten Sie die Probenplatte für den 96.96 Dynamic Array Chip vor.
- In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie jedem Bohrgut 0,45 l 20x DNA-Bindungsfarbstoff und 4,55 l low ROX Mastermix hinzu.
- Fügen Sie jedem Bohrwert 3 l vorverstärkte Probe hinzu, drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g,und legen Sie die Platte dann auf Eis.
- Bereiten Sie die Assay-Platte für den 96.96 Dynamic Array Chip vor.
- In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie jedem Bohrgut 3,75 l 2x GE-Assay-Ladereagenz und 1,25 l DNA-Suspensionspuffer hinzu.
- Fügen Sie jedem entsprechenden Brunnen 2,5 l von 10 m qPCR-Grundierung hinzu. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g für 5 min.
- Laden und führen Sie den 96.96 Dynamic Array Chip aus.
- Prime den Chip mit Steuerleitung Flüssigkeit.
- Platzieren Sie den Chip in einem IFC Controller HX, und führen Sie das Prime (136X)-Skript aus.
- Fügen Sie 6 l der Probe von der PCR-Probenplatte in die entsprechenden Probenbohrungen im 96.96 Dynamic Array Chip ein.
- Fügen Sie 6 l der Probe von der PCR-Assayplatte in die entsprechenden Assay-Brunnen im 96.96 Dynamic Array Chip ein.
- Verwenden Sie Nadeln, um alle Luftblasen in den Brunnen des 96.96 Dynamic Array Chip zu knallen.
- Platzieren Sie den 96.96 Dynamic Array Chip im IFC Controller HX, und führen Sie das Load Mix (136x)-Skript aus.
- Entfernen Sie den Chip vom IFC Controller HX, ziehen Sie den Schutzaufkleber ab und legen Sie den 96.96 Dynamic Array Chip in eine mikrofluidische RT-qPCR-Plattform. Führen Sie das GE Fast 96 x 96 PCR-Protokoll (30 Zyklen) aus.
HINWEIS: Die RNA-Qualität und Gültigkeit der Ergebnisse werden mit mehreren Methoden bewertet, einschließlich der Assay-Validierung über Gelelektrophorese, Schmelztemperaturkurven, Proben- und Assay-Replikationen und Standard-Verdünnungsseriendiagrammen. Zusätzlich können Transkriptionsergebnisse durch unabhängige Methoden zur Hirnhalbsektion validiert werden, einschließlich Western Blot und Immunfluoreszenz-Assays.
8. Messung der bakteriellen Fülle mit mikrofluidischem RT-qPCR
- Extrahieren Sie die bakterielle DNA nach den Anweisungen des Stuhl-DNA-Extraktionskits.
- Schätzen Sie die bakterielle DNA-Konzentration mit qPCR.
- Fügen Sie die extrahierte bakterielle DNA zu einer neuen PCR-Platte hinzu. Fügen Sie 1 l extrahierte bakterielle DNA und 9 L DNA Suspension Puffer hinzu.
- Vorbereiten der Assay-Platte für den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.2.1-7.2.2)
- Vorbereitung der Probenplatte für den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.3.1-7.3.2)
- In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie 48 Bohrungen 0,45 l 20x DNA-Bindungsfarbstoff und 4,55 l low ROX Mastermix hinzu.
- Fügen Sie 3 l der Probe von der PCR-Platte, die die bakterielle DNA enthält, in die 48 Brunnen und drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g für 5 min. Bei 4 °C lagern.
- Laden und ausführen Sie den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.4.1-7.4.7).
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Representative Results
Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet. Die gesammelten Zellen wurden dann an der QC-Station betrachtet und der Zellkernfleck (DAPI) überlappte sich mit der einzelligen Selektionsmarkerfluoreszenz. Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder einer Folie mit einem halbherektierten Rattenvorhirn, das das CeA enthält. Nachfolgende Bilder (Abbildung 2B-D) zeigen die Auswahl einzelner Zellen und deren Entfernung aus dem Gewebe für die transkriptomische Analyse. Molekular zeigten die zelltypspezifischen Marker eine erhöhte Expression in diesem Zelltyp (Abbildung 1C). Wir betrachteten Neuronen, Mikroglia und Astrozyten und maßen die Expression von NeuN, Mafund Gfap. Die Zahlen wurden ursprünglich in O'Sullivan et al.4veröffentlicht.
Darüber hinaus können Kontrollen auch in der mikrofluidischen Plattform durchgeführt werden, um die Expressionsbefunde zu validieren (z. B. Analyse anderer Bereiche desselben Gewebes, um die Spezifität des Kerns zu demonstrieren). Ein separates Gewebe könnte auch mit der gewünschten Probe verglichen werden, um die Primerspezifität im Gewebe von Interesse zu demonstrieren. Positive und negative Kontrollgene können ebenfalls einbezogen werden (z. B. Gene, von denen bekannt ist, dass sie entweder im ausgewählten Gewebe fehlen oder hoch gradig exprimiert werden). Drei oder vier Haushaltsgene sollten nicht nur für die Datennormalisierung, sondern auch als Maß für die experimentelle Qualität einbezogen werden. Diese Gene sollten die geringste Varianz in der Expression über alle Proben und Behandlungen zeigen. In diesem repräsentativen Experiment wurde keine alternative Hirnregion assayed, aber die Haushaltsgene Ldha und Actb wurden für die Normalisierung verwendet. Gapdh wurde als interne Kontrolle verwendet.
Abbildung 3 zeigt einige der multivariaten Methoden, die unsere Gruppe zur Analyse unserer Daten verwendet hat. Wir fanden heraus, dass Astrozyten in der Entzugsgruppe der am stärksten betroffene Zelltyp waren. Basierend auf diesen Daten im Zusammenhang mit anderen Studien spekulieren wir, dass Astrozyten eine Schlüsselrolle bei Entzündungen im CeA während des Opioidentzugs spielen und dass dies zu den körperlichen und emotionalen Symptomen beiträgt, die die Drogensuche über negative Verstärkung antreiben. Wir zeigen auch die Darm-Mikroflora-Daten (Abbildung 4).
Abbildung 1: Einzelliges RT-qPCR-Workflow und transkriptionelle Heterogenität. (A) Experimentelles Protokoll (n = 4 für jede Bedingung) (B) Zehnzellgepoolte Probentranskriptommessung. (C) Das Balkendiagramm zeigt median---Ct-Ausdruckswerte an. Neuronen = violett; microglia = gelb; Astrozyten = grün. Fehlerbalken zeigen Standardfehler an. *p < 0,05, ***p < 0,0003; Tukeys ehrlicher Signifikanztest. (D) Die Heatmap zeigt die Expression aller Proben in 40 untersuchten Genen. Reihen sind 10-Zellen-gepoolte Proben (930 neuronale Proben, 950 mikrogliaale Proben, 840 Astrozytenproben als bezeichnet); die Zahlen bezeichnen die Stichprobencluster und die Spalten sind die Gene. Die Figur wird von O'Sullivan et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Laseraufnahme von Mikrodissektionsbildern. (A) Vier Scheiben dehydrierter, halbverstärkter Rattenvorhirn, die das CeA auf einer Rutsche enthalten. Auf der Folie wurden scheiben genau 10 m vom vorherigen Slice platziert. Links ist vorder und rechts ist hinter. Der Abstand zum Bregma kann mit Hilfe eines Rattenhirnatlas und Vonrichtungspunkte, einschließlich des Optiktraktes und der Stria terminalis, geschätzt werden. (B-D) Sequenz der Bilder, die die Auswahl einzelner Zellen im CeA (C) und deren Entfernung aus dem Gewebe zeigen (D). Zur Auswahl dieser Zellen wurden mehrere LCM-Kappen verwendet. Eine Kappe wird verwendet, um 10 Zellen eines Zelltyps auszuwählen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse 1. (A) Ein Cartoon-Schema einer Zelle, die die genesgeprüften und ihre Lage zeigt. Die hier beschrifteten Gensymbole sind eine Referenz für Panel B. (B) Die farbigen Quadrate stellen die relative Genexpression (Median-Ct-Wert) für die in Panel A dargestellten Gene dar. Die Position der Quadrate stellt die zelluläre Lokalisation oder Funktion des entsprechenden Proteins dar. Die Panels zeigen die relative Genexpression an, die durch Farbe über Behandlungen und Zelltypen dargestellt wird. Gelb = hoher Ausdruck; blau = niedriger Ausdruck; weiß = neutraler Ausdruck. Die Figur wird von O'Sullivan et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse 2. (A) Genkorrelationsnetzwerke. Die Pearson-Korrelation wurde auf den Werten von -'Ct innerhalb einer Behandlung und eines Zelltyps durchgeführt. Die Knoten bezeichnen die Gene und ihre Farbe bezeichnet die relativen Expressionsniveaus (der Medianwert --Ct für jedes Gen). Die Kanten bezeichnen Ausdruckskorrelationen, und die Dicke bezeichnet die Stärke der Ausdruckskorrelation . Korrelationen mit einem q-Wert <0.001 werden angezeigt. Schwarze Kanten = positive Korrelationen; grüne Kanten = negative Korrelationen. (B) Bar-Plots ausgewählter Gene, die eine signifikante Differentialgenexpression zeigen. Die Statistiken wurden anhand von verschachtelten ANOVA-#p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001 (n = 4 Tiere für alle Behandlungen) berechnet. Die Figur wird von O'Sullivan et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Relative Fülle der Darmflora. Die Barplots zeigen die relative Häufigkeit von Bakterienarten (--Ct-Werte). #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,008, ***p = 0,0009; zweiseitige ANOVA; n = 4 Tiere pro Behandlung. Die Figur wird von O'Sullivan et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Einzelzellbiologie hat die Heterogenität zellulärer Phänotypen und die Robustheit der Gewebefunktion nachgewiesen. Diese Ergebnisse haben Einblicke in die Organisation biologischer Systeme sowohl auf Makro- als auch auf Mikroserskala gegeben. Hier beschreiben wir die Kombination von zwei Methoden, LCM und mikrofluidische qPCR, um einzellige Transkriptom-Maßnahmen zu erhalten, die anatomische Spezifität und Transkriptionsgenauigkeit zu relativ niedrigen Kosten bieten (Abbildung 1). Unsere Gruppe verfolgt einen systembiologischen Ansatz und misst oft mehrere Gewebe im selben Tier. Wir halten diese Methoden sowohl für flexibel als auch für fruchtbar, um zu bestimmen, wie biologische Systeme auf verschiedene Herausforderungen auf Transkriptionsebene reagieren. Zusätzlich verwenden wir diese Methoden bei der anatomischen Kartierung zellulärer Phänotypen unter Ausgangsbedingungen.
Wir liefern Daten und geänderte Zahlen aus einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung, in der untersucht wird, wie das CeA auf Opioidabhängigkeit und -entzug reagiert4. In diesem Beispiel verwendeten wir dieselbe mikrofluidische qPCR-Plattform, um die relative Häufigkeit der Darmflora zu messen. Die Methoden und Arbeitsabläufe sind in Abbildung 1 zusammengefasst und ursprünglich in O'Sullivan et al.4veröffentlicht worden. Wichtige Erkenntnisse aus mikrofluidischem RT-qPCR mit hohem Durchsatz können anschließend durch Proteinmaßnahmen wie Western Blot oder Immunfluoreszenz4validiert werden.
Eine große Herausforderung dieses systembiologischen Ansatzes besteht darin, spezifische kausale biologische Mechanismen zu bestimmen. Fuzzy-Logik ist eine validierte Lösung, die wir mit Erfolg eingesetzt haben, um Agenten im Gen-Regulierungsnetzwerkverhalten abzuleiten2. Tiermodellmanipulationen können auch eingesetzt werden, um Einblicke in systemische Mechanismen zu geben. Zum Beispiel liefert das gleiche Protokoll, das hierin mit dem Zusatz einer Rattenkohorte mit einer Magenvagotomie bereitgestellt wird, Daten, die Eineneinblick in den Informationsfluss über den Vagusnerv geben.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die hier vorgestellten Arbeiten wurden durch die NIH HLB U01 HL133360 an JS und RV, NIDA R21 DA036372 an JS und EVB und T32 AA-007463 an Jan Hoek zur Unterstützung von SJO'S verliehen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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