Summary
Detta protokoll förklarar hur man samlar in enstaka nervceller, mikroglia och astrocyter från den centrala kärnan i amygdala med hög noggrannhet och anatomisk specificitet med hjälp av laser fånga microdissection. Dessutom förklarar vi vår användning av microfluidic RT-qPCR för att mäta en delmängd av transkriptomen i dessa celler.
Abstract
Djupgående transkriptionsheterogenitet i anatomiskt intilliggande enskilda celler tyder på att robust vävnadfunktionalitet kan uppnås genom cellulär fenotypmångfald. Encelliga experiment som undersöker nätverksdynamiken i biologiska system visar cellulära och vävnadssvar på olika villkor vid biologiskt meningsfull upplösning. Häri förklarar vi våra metoder för att samla in enstaka celler från anatomiskt specifika platser och exakt mäta en delmängd av deras genuttrycksprofiler. Vi kombinerar lasercapture microdissection (LCM) med mikrofluidisk omvänd transkription kvantitativa polymeras kedjereaktioner (RT-qPCR). Vi använder också denna mikrofluidiska RT-qPCR plattform för att mäta mikrobiell förekomst av tarminnehåll.
Introduction
Mätning av genuttrycksprofiler na för enskilda celler har visat omfattande fenotypisk heterogenitet i en vävnad. Denna komplexitet har komplicerat vår förståelse av de biologiska nätverk som styr vävnadsfunktionen. Vår grupp och andra har utforskat detta fenomen i många vävnader och villkor1,2,3,4,5,6. Dessa experiment tyder inte bara på att reglering av genuttryck nätverk ligger till grund för en sådan heterogenitet, men också att encellig upplösning avslöjar en komplexitet i vävnadsfunktion som vävnadsnivå upplösning inte uppskattar. Faktum är att endast en liten minoritet av celler kan svara på ett visst tillstånd eller en utmaning, men effekterna av dessa celler på den övergripande fysiologin kan vara betydande. Dessutom kan en systembiologi metod som tillämpar multivariatmetoder på högdimensionella datamängder från flera celltyper och vävnader belysa systemomfattande behandlingseffekter.
Vi kombinerar LCM och microfluidic RT-qPCR för att få sådana datauppsättningar. Vi tar detta tillvägagångssätt här i motsats till att samla enstaka celler via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och använda RNA-sekvensering (RNA-seq) för att mäta deras transkriptom. Fördelen med LCM jämfört med FACS är att den exakta anatomiska specificiteten hos enskilda celler kan dokumenteras med LCM, relativt och absolut. Vidare, medan RNA-seq kan mäta fler funktioner som RT-qPCR, microfluidic RT-qPCR är billigare och har en högre känslighet och specificitet7.
I detta representativa experiment undersökte vi effekterna av opioidberoende och naltrexon-fällt opioidabstinens på råtta neuronal, microglia och astrocyt genuttryck i den centrala kärnan i amygdala (CeA) och gut mikroflora överflöd4. Fyra behandlingsgrupper analyserades: 1) Placebo, 2) Morfin, 3) Naltrexon och 4) Abstinens (figur 1). Vi fann att opioidberoende inte väsentligt förändrade genuttryck, men att opioidabstinens inducerade uttrycket av inflammatoriska gener, Tnf i synnerhet. Astrocyter var den mest drabbade celltypen. Tarmmikrobiomet påverkades djupt av opioidabstinens som indikerades av en minskning av Firmicutes till Bacteroides förhållandet, som är en etablerad markör för tarmdysbios8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med rekommendationerna från Animal Care and Use Committee (IACUC) av Thomas Jefferson University och Drexel University College of Medicine. Protokollet godkändes av Thomas Jefferson University och Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Djurmodell
- Sätt in två 75 mg långfrigöring morfin pellets eller två placebo pellets subkutant hos vuxna manliga Sprague-Dawley råttor.
- Använd en klänning och handskar på lämpligt sätt för mindre steril kirurgi. Raka råttdorsumen med klippare om det behövs.
- Applicera veterinärsalva nett a-talet på djurets ögon. Anestesi råttan med cirka 20 s isoflurane inandning. Anestesi bekräftas av medvetslöshet.
- Gör ett mittinsnitt i råttdorsum med bead-steriliserad trubbig sax och separera dermis från kroppen väggen med en bärdsteriliserad sond. Sätt in pellets under dermis med pärdsteriliserade pincett. Suture snittet avslutades med en steril nål.
OBS: Hela proceduren tar ca 5 min per råtta. Färska sterila handskar används för varje råtta. - Placera råttan i en isoleringsbur för postkirurgisk återhämtning. Kontrollera om det finns hjärtslag och regelbunden andningsrytm. Observera råttan tills medvetandet återvunnits. Bedömning för postsurgical smärta.
- Bedöm råttorna 8 h postsurgery och varje 12 h efter för återhämtning och infektion. Placera råttor i en bur med resten av kohorten när de är helt återhämtat sig från operation, ca 24 h postsurgery.
- Ge en intraperitoneal naltrexoninjektion (75 mg/kg) till G- och abstinenskohorterna efter 6 dagars morfinexponering.
OBS: Det fanns fyra råtta kohorter i detta representativa experiment (se figur 1).
2. Provtagning
- Skörda hjärnan 6 dagar efter pelletinsättningen eller 24 h efter naltrexoninjektionen.
- Placera djuret i en isoflurankammare i cirka 30 s eller tills medvetslöshet uppstår, indikeras av brist på rörelse och minskad andningsfrekvens.
- Använd en skarp giljotin för att snabbt halshugga djuret.
- Dissekera hjärnan ut ur djurets skalle.
- Använd en skarp handhållen rakhyvel för att göra följande grova snitt till den borttagna hjärnan: Först skiva av lillhjärnan och kasta. För det andra, separera hjärnstammen från framhjärnan med ett tvärgående snitt. Tredje, hemisect framhjärnan och / eller hjärnstammen med en midline sagittal snitt.
- Placera framhjärnan och hjärnstammen i en plastvävnad-bädda in mögel med 3-4 cm optimal skärtemperatur förening (OKT) i botten av formen. Täck resten av provet med ULT.
- Placera omedelbart plastvävnad-bädda in mögel med provet täckt med OCT i ett bad som innehåller torris och metanol. Låt inte metanolspillet i vävnadsinbäddningsformen. Håll inbäddning mögel med hjärnan provet i metanol-isbad tills vävnad insamling är klar (~ 10-15 min max).
- Placera hjärnprovet i en -80 °C frys så snart som möjligt.
- Skörda tarmen prover samtidigt.
- Efter snabb halshuggning, gör ett mittinsnitt i djurets buk med en skalpell.
- Hitta cecum och bryta dess anslutning till stigande kolon.
- Pressa det cecal innehållet i en 15 mL konisk slang.
- Placera omedelbart koniska röret på torris och lägg i en -80 °C frys så snart som möjligt.
NOTERA: Tunntarmens innehåll kan också samlas in med samma metoder som en negativ kontroll.
3. Skivning
- Skiva den hemisected råtthjärnan snett med hjälp av en cryostat.
- Ta bort plastinbäddningmögel med framhjärnan från -80 °C frysen och placera i en -20 °C cryostat.
- Ta bort OCT-inbäddade hemisected forebrain provet från inbäddning mögel. Använd en rakhyvel för att skära hörnen av plast inbäddning mögel vertikalt om det behövs. Montera framhjärnan för rostral till caudal korona skivning på en cryostat chuck med OCT.
OBS: Anatomiska landmärken för att identifiera CeA inkluderar optik och stria terminalis (figur 2B). Den optiska tarmkanalen grenar från den optiska chiasm och spår dorsala-laterala som hjärnan är skivad rostral till caudal. När det optiska området har en morfologi som liknar vad som ses i en råtta hjärnan atlas bregma -2,12 mm10,kan testskivor ses under ett mikroskop. Den optiska tarmkanalen och stria terminalis morfologi kan kontrolleras i en råtta hjärnan atlas10 för att identifiera bregma och om CeA omger stria terminaler. - Skiva 10 μm tjocka koronala sektioner från hemisected framhjärnan rostral till caudal tills sektioner som innehåller CeA nås.
OBS: Sektionernas bredd och höjd är ca 200 mm. - Samla 10 μm sektioner som innehåller CeA, eller den föredragna hjärnregionen, genom att tina upp 10 μm sektioner på vanliga glasdiabilder. Placera omedelbart glasrutschbanorna på en metallpanna som vilar på torris. Lägg rutschkanorna med hjärnsektioner i en -80 °C frys så snart som möjligt.
Flera segment kan placeras på samma bild. Om du använder en annan celltypfläck för skivor på samma bild, lämna ca 100 mm mellan skivor så att en hydrofoba penna kan användas för att separera celltypsspecifika antikroppslösningar på bilden. Låt ca 20 mm från kanten på bilden på varje sida av skivan.
4. Immunfluorescensfärgning
- Färga framhjärnan avsnitt för hjärnan cell val (t.ex. neuron, microglia, astrocyt, etc.) med hjälp av immunfluorescens.
- Ta bort en eller flera diabilder med 10 μm sektioner av CeA från -80 °C frysen.
- Fäst rutschkanorna med 75% etanol för 30 s. Ta bort överflödig vätska.
- Blockera skivorna för 30 s med 2% bovint serumantigen (BSA) i 1x fosfat buffertsaline (PBS). Tvätta 1x med PBS.
- Lägg till en primär antikroppslösning i bilden i 2 min. Tvätta 1x med 2% BSA-lösning.
OBS: Den primära antikroppslösningen består av 2 % primär antikropp, 1% RNase Out och 96 % av samma BSA PBS-lösning för blockeringssteget ovan (steg 4.1.3). I det representativa experimentet användes en anti-NeuN-antikropp, anti-Cd11β-antikroppar och en anti-GFAP-antikropp i följande mängder: 3 μL primär, 1,88 μL RNA-hämmare och 145,12 μL BSA-lösning. - Tillsätt den sekundära antikroppslösningen i bilden i 3 min. Tvätta 1x med PBS.
OBS: Den sekundära antikroppslösningen består av 1 μL getantimus 488 nm lysrör (1:500), 2,5 μL RNA-hämmare, 1,3 μl DAPI (1:10,000) och 196,5 μL av 2% BSA.
5. Etanol- och xylenuttorkningsserie
- Doppa rutschkanorna i 75% etanol för 30 s. Omedelbart efter, doppa rutschkanorna i 95% etanol för 30 s. Omedelbart efter, doppa rutschkanorna i 100% etanol för 30 s.
- Efter etanoluttorkningsserien doppar du rutschkanorna i nyhälld xylen i 1 min. Omedelbart efter, doppa rutschkanorna i en andra behållare med xylen i 4 min.
- Ta bort rutschkanorna från xylenbadet och låt luften torka i mörker i 5 min.
- Placera rutschkanorna i en exsickator i 5 min för att torka ytterligare.
6. Laser fånga mikrodissekering
- Om färgas, placera bilden i mikroskopet och hitta den region av intresse (CeA) med hjälp av anatomiska landmärken (dvs. den optiska chiasm och stria terminalis).
- Använd fluorescens för att identifiera den färgade celltypen och dess kärna i intresseområdet. Välj en cell eller flera celler om du gör encellpoolade exempel. Markera cellerna av intresse med hjälp av LCM programvara.
- Placera LCM-locket ovanpå segmentet på intresseområdet.
- Använd testbilder av en infraröd (IR) laser för att justera IR-laserstyrka, storlek och varaktighet så att LCM-lockets lim endast smälter över området för den valda encellen. Detta säkerställer att inga andra celler samlas in förutom de celler som valts.
OBS: I det här representativa experimentet användes 10 cellpooler av samma celltyp som ett enda prov för att begränsa cell-till-cellvariabiliteten i genuttryck mellan prover med samma behandling. Den här metoden kan dock användas för verkliga experiment med en cell1,3. - Välj de enskilda celler som ska samlas in för analys med hjälp av LCM-programverktygen (bild 2C). Celler som väljs måste vara i det anatomiska området i CeA (eller hjärnan s val) baserat på råtthjärnan atlas och bregma10. Cellerna ska vara minst 3 μm från den intilliggande färgade kärnorna.
- Avfyra IR-lasern för att samla in de identifierade enskilda cellerna.
- Placera locket i kvalitetskontrollstationen (QC) och visa det för att säkerställa att endast de önskade cellerna har valts. Om andra celler av misstag valdes, kan en ultraviolett laser användas för att förstöra oönskade celler medan locket kvar i QC-stationen.
- Ta ett foto av vävnadssektionen från där cellen samlades in för att dokumentera dess anatomiska specificitet. Registrera avståndet för segmentet från bregma om det är lämpligt med hjälp av en råtthjärnaatlas som referens10.
- Ta bort LCM-locket från QC-stationen, fäst provextraktionsanordningen och pipetten 5,5 μL lysbuffert på provet.
OBS: Lysisbuffertlösningen består av 0,5 μL lysförstärkare och 5 μL återsuspensionsbuffert. - Montera ExtracSure-enheten på ett 0,5 ml mikrocentrifugrör och placera på en värmeplatta vid 75 °C i 15 min.
- Snurra ner provet och lysisbufferten för 30 s vid låg hastighet (0,01-0,02 x g)och placera det insamlade provet i en -80 °C frys.
7. Mikrofluidisk RT-qPCR med en cell
- Föramplring av encelliga mRNA för 96,96 Dynamic Array Chip
- Kombinera framåt och omvänd mRNA qPCR gen primers för alla gener som analyseras i en primer pool för förökning (500 nM koncentration varje primer). Till exempel 1 μL 100 μM primers i 80 μL plus 120 μL DNA Suspension Buffer.
OBS: Primer sekvenser som används för det representativa experimentet finns i O'Sullivan et al.4. - I en ny 96 x 96 PCR-platta, tillsätt 1 μL 5x VILO till varje brunn.
- Ta bort LCM-encelliga prover från de prover som lagras vid -80 °C, låt tina en kort stund, centrifugera kort med låg hastighet (0,01-0,02 x g)och tillsätt 5,5 μL i det lysedena encelliga provet till PCR-plattan. Varje prov läggs till sin egen brunn.
- Placera PCR-plattan med proverna och VILO i termocykeln och värm vid 65 °C i 1,5 min. Snurra plattan i 1 min vid 1 300 x g vid 4 °C och placera plattan på is.
- Tillsätt 0,15 μL 10x cDNA-syntesmastermix, 0,12 μL T4 Gene 32 protein och 0,73 μL DNA-suspensionsbuffert i varje brunn.
- Placera PCR-plattan i termokonttern och kör följande protokoll: 25 °C i 5 min, 50 °C i 30 min, 55 °C i 25 min, 60 °C i 5 min, 70 °C i 10 min, 4 °C till.
- Tillsätt 7,5 μL Taq polymeras master mix till varje brunn.
- Tillsätt 1,5 μL av primerpoolen (se ovan) i varje brunn.
- Placera PCR-plattan i termocykeln och kör följande förförstärkaresprotokoll: 95 °C i 10 min, följt av 22 cykler av 96 °C för 5 sek, 60 °C i 4 min.
- Tillsätt 0,6 μL exonuclease I reaktionsbuffert 10x, 1,2 μL exonuclease I och 4,2 μL DNA-suspensionsbuffert till varje brunn.
- Placera PCR-plattan i termocykeln och kör följande protokoll: 37 °C i 30 min, 80 °C i 15 min.
- Tillsätt 54 μL TE-buffert i varje brunn. Snurra PCR-plattan vid 1 300 x g vid 5 min. Förvara vid 4 °C om du omedelbart fortsätter till nästa steg. Förvaras vid -20 °C om du väntar mer än 12 timmar för nästa steg.
- Kombinera framåt och omvänd mRNA qPCR gen primers för alla gener som analyseras i en primer pool för förökning (500 nM koncentration varje primer). Till exempel 1 μL 100 μM primers i 80 μL plus 120 μL DNA Suspension Buffer.
- Förbered provplattan för 96.96 Dynamic Array Chip.
- I en ny 96 brunn PCR-platta, tillsätt 0,45 μL 20x DNA-bindningsfärg och 4,55 μL låg ROX mastermix till varje brunn.
- Tillsätt 3 μL förförstärkt prov i varje brunn, snurra PCR-plattan vid 1 300 x goch lägg sedan plattan på is.
- Förbered analysplattan för 96,96 Dynamic Array Chip.
- I en ny 96 brunn PCR-platta, tillsätt 3,75 μL 2x GE-analysladdningsreagens och 1,25 μL DNA-fjädringsbuffert i varje brunn.
- Tillsätt 2,5 μL på 10 μM qPCR primer till varje motsvarande brunn. Snurra PCR-plattan vid 1 300 x g i 5 min.
- Ladda och kör 96,96 Dynamic Array Chip.
- Prime chipet med styrledningsvätska.
- Placera chipet i en IFC Controller HX och kör prime-skriptet (136X).
- Tillsätt 6 μL av provet från PCR-provplattan i motsvarande provbrunnar i 96.96 Dynamic Array Chip.
- Tillsätt 6 μL av provet från PCR-analysplattan i motsvarande analysbrunnar i 96,96 Dynamic Array Chip.
- Använd nålar för att pop några luftbubblor i brunnarna i 96,96 Dynamic Array Chip.
- Placera 96,96 Dynamic Array Chip i IFC Controller HX och kör load mix -skriptet (136x).
- Ta bort chipet från IFC Controller HX, dra av skyddsmärket och placera 96,96 Dynamic Array Chip i en mikrofluidisk RT-qPCR-plattform. Kör GE Fast 96 x 96 PCR-protokollet (30 cykler).
OBS: RNA:s kvalitet och giltighet bedöms med flera metoder, inklusive analysvalidering via gelelektrofores, smältande temperaturkurvor, prov- och analysreplikat och standardfördelningar i utspädningsserien. Dessutom kan transkriptionsresultat valideras genom oberoende metoder för hjärnhemisektion inklusive västra blot och immunofluorescensanalyser.
8. Mätning av bakterieöverflöd med mikrofluidisk RT-qPCR
- Extrahera bakterie-DNA efter anvisningarna i avföringenS DNA-extraktions.
- Uppskatta bakterie-DNA-koncentrationen med qPCR.
- Tillsätt det extraherade bakterie-DNA:t till en ny PCR-platta. Tillsätt 1 μL extraherat bakteriellt DNA och 9 μL DNA Suspension-buffert.
- Förbered analysplattan för 48,48 Dynamic Array Chip (se steg 7.2.1-7.2.2)
- Förbered provplattan för 48,48 Dynamic Array Chip (se steg 7.3.1-7.3.2)
- I en ny 96 brunn PCR-platta, tillsätt 0,45 μL 20x DNA-bindningsfärg och 4,55 μL låg ROX mastermix till 48 brunnar.
- Tillsätt 3 μL av provet från PCR-plattan som innehåller bakterie-DNA till 48 brunnarna och snurra ner PCR-plattan vid 1 300 x g i 5 min. Förvara vid 4 °C.
- Ladda och kör 48,48 Dynamic Array Chip (se steg 7.4.1-7.4.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Urvalet av encellerna validerades både visuellt och molekylärt. Visuellt, cellulära morfologi visades före cellinsamling. Celler som samlats in visades sedan på QC-stationen och den cellulära kärnorna (DAPI) överlappade med fluorescensen för encellvalsmarkör. Figur 2A visar representativa bilder av en bild med hemisected råtta förhjärnan som innehåller CeA. Efterföljande bilder (figur 2B-D) visar valet av enstaka celler och deras avlägsnande från vävnaden för transkriptomisk analys. Molekylärt visade celltypsspecifika markörer ökat uttryck i den celltypen (figur 1C). Vi tittade på nervceller, mikroglia, och astrocyter och mätte uttrycket av NeuN, Maf, och Gfap, respektive. Siffrorna publicerades ursprungligen i O'Sullivan et al.4.
Vidare kan kontroller också köras i den mikrofluidiska plattformen för att validera uttrycksresultaten (t.ex. analys av andra områden av samma vävnad för att visa kärnans specificitet). En separat vävnad kan också jämföras med önskat prov för att visa primer specificitet i vävnaden av intresse. Positiva och negativa kontrollgener kan också inkluderas (t.ex. gener som är kända för att antingen vara frånvarande från den valda vävnaden eller uttryckas högt). Tre eller fyra hushållsgener bör också inkluderas inte bara för datanormalisering, utan också som ett mått på experimentell kvalitet. Dessa gener bör visa den lägsta variansen i uttryck över alla prover och behandlingar. I detta representativa experiment, ingen alternativ hjärnregion var analyseras, men hushållning gener Ldha och Actb användes för normalisering. Gapdh användes som intern kontroll.
Figur 3 visar några av de multivariatmetoder som vår grupp använde för att analysera våra data. Vi fann att astrocyter i uttagsgruppen var den mest drabbade celltypen. Baserat på dessa data i samband med andra studier spekulerar vi att astrocyter spelar en nyckelroll i inflammation i CeA under opioidtillbakadragande och att detta bidrar till de fysiska och känslomässiga symptom som driver drogsökande via negativ förstärkning. Vi visar också tarmmikrofloran data(Figur 4).
Bild 1: Encellig RT-qPCR-arbetsflöde och transkriptionsheterogenitet. A) Experimentellt protokoll (n = 4 för varje villkor)(B) Tiocells poolad provtranskriptommätning. (C)Stapeldiagram visar median-ΔΔCt-uttrycksvärden. Nervceller = lila; mikroglia = gul; astrocyter = grön. Felstaplar visar standardfel. *p < 0,05, ***p < 0,0003; Tukeys ärliga signifikanstest. (D) Värmekartan visar uttrycket av alla prover över 40 analyserade gener. Rader är 10-cells poolade prover (930 neuronala prover, 950 mikrogliaalprover, 840 astrocyteprover som betecknas); siffrorna anger provkluster och kolumnerna är generna. Figuren ändras från O'Sullivan et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Laserfångamikrodissektionsbilder. (A)Fyra skivor uttorkad halvisekted råttframhjärnan som innehåller CeA på en bild. Skivor placerades på bilden exakt 10 μm från föregående skiva. Vänster är främre och höger är bakre. Avståndet från bregma kan uppskattas med hjälp av en råtta hjärnan atlas och landmärken, inklusive den optiska tarmkanalen och stria terminalis. (B-D) Sekvens av bilder som visar valet av enskilda celler i CeA(C)och deras avlägsnande från vävnaden (D). Flera LCM-lock användes för att markera dessa celler. Ett lock används för att plocka 10 celler av en celltyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativt resultat 1. (A) En tecknad schematisk av en cell som visar de gener som analyserats och deras plats. De gensymboler som är märkta här är en referens för panel B. (B) De färgade rutorna representerar relativt genuttryck (median -ΔΔCt-värde) för de gener som representeras i panel A. Platsen för rutorna representerar den cellulära lokaliseringen eller funktionen hos motsvarande protein. Panelerna visar det relativa genuttryck som representeras av färg över behandlingar och celltyper. Gul = högt uttryck; blå = lågt uttryck; vit = neutralt uttryck. Figuren ändras från O'Sullivan et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativt resultat 2. (A)Nätverk för genkorrelation. Pearsonkorrelation utfördes på -ΔΔCt-värdena inom en behandlings- och celltyp. Noderna anger generna och deras färg betyder de relativa uttrycksnivåerna (medianvärdet -ΔΔCt för varje gen). Kanterna betecknar uttryckskorrelationer och tjockleken betyder uttryckskorrelationens styrka (ρ). Korrelationer med ett q-värde <0.001 visas. Svarta kanter = positiva korrelationer; gröna kanter = negativa korrelationer. (B)Stapelområden med utvalda gener som visar signifikant differentiellt genuttryck. Statistiken beräknades med kapslad ANOVA #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001 (n = 4 djur för alla behandlingar). Figuren ändras från O'Sullivan et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Relativt överflöd av tarmmikroflora. Barplots visar det relativa överflödet av bakteriearter (-ΔΔCt-värden). #p < 0.1, *p < 0.05, **p < 0.008, ***p = 0.0009; tvåvägs ANOVA; n = 4 djur för varje behandling. Figuren ändras från O'Sullivan et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encellig biologi har visat heterogeniteten hos cellulära fenotyper och robusthet av vävnadsfunktion. Dessa resultat har gett insikt i organisationen av biologiska system på både makro- och mikroskalor. Här beskriver vi kombinationen av två metoder, LCM och microfluidic qPCR, för att få encelliga transkriptomåtgärder som ger anatomisk specificitet och transkriptionsnoggrannhet till en relativt låg kostnad (figur 1). Vår grupp tar ett systembiologi och mäter ofta flera vävnader i samma djur. Vi tycker att dessa metoder är både flexibla och givande för att avgöra hur biologiska system reagerar på olika utmaningar på transkriptionsnivå. Dessutom använder vi dessa metoder i anatomisk mappning av cellulära fenotyper under baslinjeförhållanden.
Vi tillhandahåller data och ändrade siffror från en nyligen publicerad publikation som undersöker hur Cea svarar på opioidberoende och tillbakadragande4. I det här exemplet använde vi samma mikrofluidiska qPCR-plattform för att mäta det relativa överflödet av tarmmikrofloran. Metoderna och arbetsflödet sammanfattas i figur 1 och publicerades ursprungligen i O'Sullivan et al.4. Viktiga resultat från högpresterande mikrofluidiska RT-qPCR kan därefter valideras genom proteinåtgärder såsom västra blot eller immunofluorescens4.
En stor utmaning i detta system biologi strategi är att bestämma specifika kausala biologiska mekanismer. Luddig logik är en validerad lösning som vi har använt med framgång för att sluta agenter i genreglerande nätverk beteende2. Djurmodell manipulation kan också användas för att ge insikt i systemiska mekanismer. Till exempel kommer samma protokoll som häri med tillägg av en råtta kohort med en mag vagotomy ger data som ger insikt i flödet av information via vagus nerv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Det arbete som presenteras här finansierades genom NIH HLB U01 HL133360 tilldelas JS och RV, NIDA R21 DA036372 tilldelas JS och EVB, och T32 AA-007463 tilldelas Jan Hoek till stöd för SJO'S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
