Summary
Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.
Abstract
A heterogeneidade transcricional profunda em células únicas anatomicamente adjacentes sugere que a funcionalidade robusta do tecido pode ser alcançada pela diversidade de fenótipo celular. Experimentos de células únicas que investigam a dinâmica da rede de sistemas biológicos demonstram respostas celulares e teciduais a várias condições em resolução biologicamente significativa. Aqui, explicamos nossos métodos para coletar células únicas de locais anatomicamente específicos e medir com precisão um subconjunto de seus perfis de expressão genética. Combinamos a microdissecção de captura a laser (LCM) com a transcrição reversa microfluida quantitativa de reações em cadeia de polimerase (RT-qPCR). Também usamos esta plataforma microfluida RT-qPCR para medir a abundância microbiana de conteúdo intestinal.
Introduction
Medir os perfis de expressão genética de células únicas demonstrou extensa heterogeneidade ferotípica dentro de um tecido. Essa complexidade complicou nossa compreensão das redes biológicas que regem a função tecidual. Nosso grupo e outros têm explorado esse fenômeno em muitos tecidos e condições1,2,3,4,5,6. Esses experimentos não apenas sugerem que a regulação das redes de expressão genética sustenta tal heterogeneidade, mas também que a resolução de células únicas revela uma complexidade na função tecidual que a resolução do nível tecidual não aprecia. De fato, apenas uma pequena minoria de células pode responder a uma condição ou desafio específico, mas o impacto dessas células na fisiologia global pode ser substancial. Além disso, uma abordagem de biologia do sistema que aplica métodos multivariados a conjuntos de dados de alta dimensão de vários tipos e tecidos celulares pode elucidar efeitos de tratamento em todo o sistema.
Combinamos LCM e RT-qPCR microfluido para obter tais conjuntos de dados. Nós tomamos esta abordagem aqui em contraste com a coleta de células únicas através da triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e usando sequenciamento de RNA (RNA-seq) para medir sua transcrição. A vantagem do LCM sobre o FACS é que a especificidade anatômica exata das células únicas pode ser documentada com LCM, relativamente e absolutamente. Além disso, enquanto o RNA-seq pode medir mais características que RT-qPCR, microfluido RT-qPCR é menos caro e tem uma sensibilidade e especificidade mais elevadas7.
Neste experimento representativo, investigou-se os efeitos da dependência opióide e da retirada de opióides precipitados de naltrexona na expressão genética neuronal, microglia e astrócito de ratos no núcleo central da amígdala (ACE) e da abundância da microflora intestinal4. Foram analisados quatro grupos de tratamento: 1) Placebo, 2) Morfina, 3) Naltrexona e 4) Retirada (Figura 1). Descobrimos que a dependência de opióides não alterou substancialmente a expressão genética, mas essa retirada de opióides induziu a expressão de genes inflamatórios, tnf em particular. Os astrócitos foram o tipo de célula mais afetada. O microbioma intestinal foi profundamente impactado pela retirada de opióides, como indicado por uma diminuição na relação Firmicutes para Bacteroides, que é um marcador estabelecido de disbiose intestinal8,9.
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Protocol
Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Comitê de Cuidados e Uso animal (IACUC) da Universidade Thomas Jefferson e da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel. O protocolo foi aprovado pela Universidade Thomas Jefferson e pela Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Modelo animal
- Insira duas pelotas de sulfato de morfina de liberação lenta de 75 mg ou duas pelotas de placebo subcutâneas em ratos machos adultos sprague-Dawley.
- Use um vestido e luvas apropriadamente para uma pequena cirurgia estéril. Raspe o dorsum de rato com cortadores, se necessário.
- Aplique pomada veterinária nos olhos do animal. Anestesiar o rato com aproximadamente 20 s de inalação de isoflurano. A anestesia é confirmada pela perda de consciência.
- Faça uma incisão midline no dorsum de rato com uma tesoura sem corte esterilizada por contas e separe a derme da parede do corpo com uma sonda esterilizada por contas. Insira as pelotas a derme com fórceps esterilizados por talas. Suturar a incisão fechada com uma agulha estéril.
NOTA: Todo o procedimento leva cerca de 5 min por rato. Luvas estéreis frescas são usadas para cada rato. - Coloque o rato em uma gaiola de isolamento para recuperação pós-cirúrgica. Verifique se há batimentos cardíacos e ritmo respiratório regular. Observe o rato até que a consciência seja recuperada. Avalie para dor pós-cirúrgica.
- Avalie os ratos 8h após a cirurgia e a cada 12 h após a recuperação e infecção. Coloque os ratos em uma gaiola com o resto da coorte quando estiverem totalmente recuperados da cirurgia, cerca de 24h após a cirurgia.
- Injeina naltrexona intraperitoneal (75 mg/kg) às coortes G e de Retirada após 6 dias de exposição à morfina.
NOTA: Havia quatro coortes de ratos neste experimento representativo (ver Figura 1).
2. Colheita de amostras
- Colher o cérebro 6 dias após a inserção da pelota ou 24 h após a injeção de naltrexona.
- Coloque o animal em uma câmara de isoflurano por aproximadamente 30 s ou até que ocorra perda de consciência, indicada pela falta de movimento e diminuição da taxa respiratória.
- Use uma guilhotina afiada para decapitar rapidamente o animal.
- Disseque o cérebro do crânio do animal.
- Use uma navalha afiada para fazer as seguintes incisões brutas ao cérebro removido: Primeiro, corte o cerebelo e descarte. Segundo, separe o tronco cerebral do antecérebro com uma incisão transversa. Em terceiro lugar, hemisecte o antecérebro e/ou tronco cerebral com uma incisão sagital média.
- Coloque o cérebro e o tronco cerebral em um molde plástico de incorporação de tecido com 3-4 cm de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior do molde. Cubra o resto da amostra com OCT.
- Coloque imediatamente o molde de incorporação de tecido plástico com a amostra coberta com OCT em um banho contendo gelo seco e metanol. Não deixe o metanol derramar no molde de incorporação de tecido. Mantenha o molde de incorporação com a amostra cerebral no banho de metanol-gelo até que a coleta de tecidos esteja concluída (~10-15 min no máximo).
- Coloque a amostra cerebral em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.
- Colher as amostras intestinais simultaneamente.
- Após a rápida decapitação, faça uma incisão média no abdômen do animal com um bisturi.
- Encontre o ceco e seque sua conexão com o cólon ascendente.
- Espremer o conteúdo cecal em um tubo cônico de 15 mL.
- Coloque imediatamente o tubo cônico sobre gelo seco e coloque em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.
NOTA: O conteúdo do intestino delgado também pode ser coletado usando os mesmos métodos de um controle negativo.
3. Fatiamento
- Corte o antecérebro de rato hemissiesado usando um criostato.
- Remova o molde de incorporação de plástico com o antecérebro do congelador -80 °C e coloque em um criostato de -20 °C.
- Remova a amostra hemisecenizada do cérebro hemisecção embutida oct do molde de incorporação. Use uma navalha para cortar os cantos do molde de incorporação de plástico verticalmente, se necessário. Monte o antecérebro para corte coronal caudal em um mandril criostato usando OCT.
NOTA: Os marcos anatômicos para identificar o CeA incluem o trato óptico e o terminalis de estria(Figura 2B). O trato óptico se ramifica do quiasma óptico e rastreia dorsal-lateral como o cérebro é cortado rostral para caudal. Quando o trato óptico tem uma morfologia semelhante ao que é visto em um atlas cerebral de ratos bregma -2,12 mm10, as fatias de teste podem ser vistas um microscópio. O trato óptico e a morfologia do terminal istria podem ser verificados em um atlas cerebral de ratos10 para identificar o bregma e se o CeA circunda os terminais de estria. - Corte seções coronais de 10 μm de espessura do cérebro hemiso torto rostral até caudal até que seções contendo o CeA sejam atingidas.
NOTA: A largura e a altura das seções são de aproximadamente 200 mm. - Coletar seções de 10 μm contendo o CeA, ou a região cerebral preferida, descongelando seções de 10 μm em lâminas de vidro simples. Coloque imediatamente o vidro desliza sobre uma panela de metal apoiada em gelo seco. Coloque as lâminas com seções cerebrais em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.
NOTA: Várias fatias podem ser colocadas no mesmo slide. Se usar uma mancha de tipo de célula diferente para fatias no mesmo slide, deixe cerca de 100 mm entre as fatias para que uma caneta hidrofóbica possa ser usada para separar soluções de anticorpos específicas do tipo celular no slide. Deixe cerca de 20 mm da borda do escorregador em cada lado da fatia.
4. Coloração de imunofluorescência
- Manche as seções do cérebro para a célula cerebral escolhida (por exemplo, neurônio, microglia, astrócito, etc.) usando imunofluorescência.
- Remova um ou mais slides com seções de 10 μm do CeA do congelador -80 °C.
- Fixar as lâminas com 75% de etanol para 30 s. Remova o excesso de líquido.
- Bloqueie as fatias para 30 s com 2% de antígeno sérico bovino (BSA) em 1x soro de tampão fosfato (PBS). Lave 1x com PBS.
- Adicione uma solução primária de anticorpos ao slide por 2 min. Lave 1x com 2% de solução BSA.
NOTA: A solução primária de anticorpos é composta por 2% de anticorpo primário, 1% de RNase Out e 96% da mesma solução BSA PBS para o passo de bloqueio acima (passo 4.1.3). O experimento representativo utilizou um anticorpo anti-NeuN, um anticorpo anti-Cd11β e um anticorpo anti-GFAP nas seguintes quantidades: 3 μL de principal, 1,88 μL de inibidor de RNA e 145,12 μL de solução BSA. - Adicione a solução de anticorpos secundárias ao slide por 3 min. Lave 1x com PBS.
NOTA: A solução de anticorpos secundários é composta por 1 μL de cabra anti-mouse 488 nm de marca fluorescente (1:500), 2,5 μL de inibidor de RNA, 1,3 μL de DAPI (1:10.000) e 196,5 μL de 2% de BSA.
5. Série de desidratação de etanol e xileno
- Mergulhe os slides em 75% de etanol para 30 s. Logo em seguida, mergulhe os slides em 95% de etanol para 30 s. Imediatamente depois, mergulhe os slides em 100% de etanol para 30 s. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente contendo 100% de etanol para 30 s.
- Após a série de desidratação do etanol, mergulhe os slides em xileno recém-derramado por 1 min. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente de xileno por 4 min.
- Retire os slides do banho de xileno e deixe o ar secar no escuro por 5 min.
- Coloque os slides em um dessecador por 5 min para secar ainda mais.
6. Microdissecção de captura a laser
- Se manchado, coloque o slide no microscópio e encontre a região de interesse (CeA) usando marcos anatômicos (ou seja, o quiasma óptico e a estria terminal).
- Use fluorescência para identificar o tipo de célula manchada e seu núcleo na região de interesse. Escolha uma célula ou várias células se fizer amostras agrupadas de células únicas. Marque as células de interesse usando o software LCM.
- Coloque a tampa lcm em cima da fatia sobre a região de interesse.
- Use fotos de teste de um laser infravermelho (IR) para ajustar a força, tamanho e duração do laser IR para que o adesivo de tampa LCM derreta apenas sobre a área da célula única selecionada. Isso garante que nenhuma outra célula será coletada além das células selecionadas.
NOTA: Neste experimento representativo, 10 grupos celulares do mesmo tipo de célula foram utilizados como uma única amostra para limitar a variabilidade celular-célula na expressão genética entre amostras com o mesmo tratamento. No entanto, este método pode ser usado para verdadeiros experimentos de células únicas1,3. - Selecione as células individuais a serem coletadas para análise usando as ferramentas de software LCM (Figura 2C). As células selecionadas devem estar na área anatômica do CeA (ou região cerebral de escolha) com base no atlas cerebral de ratos e na bregma10. As células devem estar a pelo menos 3 μm dos núcleos manchados adjacentes.
- Atire o laser ir para coletar as células únicas identificadas.
- Coloque a tampa na estação de controle de qualidade (QC) e visualize-a para garantir que apenas as células desejadas foram selecionadas. Se outras células foram selecionadas erroneamente, um laser ultravioleta pode ser usado para destruir as células indesejadas enquanto a tampa permanece na estação QC.
- Tire uma foto da seção de tecidos de onde a célula foi coletada para documentar sua especificidade anatômica. Registre a distância da fatia da bregma, se for o caso, usando um atlas cerebral de rato como referência10.
- Remova a tampa LCM da estação QC, conecte o dispositivo de extração da amostra e a pipeta de 5,5 μL de tampão de lysis na amostra.
NOTA: A solução de buffer de lysis consiste em 0,5 μL de aprimoramento de lysis e 5 μL de tampão de resuspensão. - Coloque o dispositivo ExtracSure em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e coloque em uma placa de aquecimento a 75 °C por 15 min.
- Gire a amostra e o tampão de lyse para 30 s em baixa velocidade (0,01-0,02 x g) e coloque a amostra coletada em um congelador de -80 °C.
7. RT-qPCR microfluido de célulaúnica
- Pré-amplificação de mRNA de célula única para 96,96 Dynamic Array Chip
- Combine os primers de genes mRNA qPCR para todos os genes que estão sendo ensaios em uma piscina de primer para pré-amplificação (concentração de 500 nM cada primer). Por exemplo, 1 μL de primers de 100 μM em 80 μL mais 120 μL de tampão de suspensão de DNA.
NOTA: As seqüências de primer usadas para o experimento representativo podem ser encontradas em O'Sullivan et al.4. - Em uma nova placa PCR 96 x 96, adicione 1 μL de 5x VILO a cada poço.
- Remova as amostras de células únicas lcM das amostras armazenadas a -80 °C, deixe descongelar brevemente, centrífuga brevemente a uma velocidade baixa (0,01-0,02 x g),e adicione 5,5 μL da amostra de célula única lysed à placa PCR. Cada amostra é adicionada ao seu próprio poço.
- Coloque a placa PCR com as amostras e VILO no termociclador e aqueça a 65 °C por 1,5 min. Gire a placa por 1 min a 1.300 x g a 4 °C e coloque a placa no gelo.
- Adicione 0,15 μL de mistura mestre de síntese de 10x cDNA, 0,12 μL T4 Gene 32 proteína e 0,73 μL de tampão de suspensão de DNA a cada poço.
- Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo: 25 °C para 5 min, 50 °C para 30 min, 55 °C para 25 min, 60 °C para 5 min, 70 °C para 10 min, 4 °C para terminar.
- Adicione 7,5 μL de mistura mestre de polimerase Taq a cada poço.
- Adicione 1,5 μL da piscina de primer (veja acima) a cada poço.
- Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo de pré-amplificação: 95 °C por 10 min, seguido por 22 ciclos de 96 °C por 5 segundos, 60 °C por 4 min.
- Adicione 0,6 μL de exonuclease I amortecedor de reação 10x, 1,2 μL de exonuclease I e 4,2 μL de tampão de suspensão de DNA a cada poço.
- Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo: 37 °C por 30 min, 80 °C por 15 min.
- Adicione 54 μL de tampão TE a cada poço. Gire a placa PCR a 1.300 x g a 5 min. Armazene a 4 °C se continuar imediatamente até o próximo passo. Armazene a -20 °C se esperar mais de 12h para o próximo passo.
- Combine os primers de genes mRNA qPCR para todos os genes que estão sendo ensaios em uma piscina de primer para pré-amplificação (concentração de 500 nM cada primer). Por exemplo, 1 μL de primers de 100 μM em 80 μL mais 120 μL de tampão de suspensão de DNA.
- Prepare a placa de amostra para o chip de matriz dinâmica 96.96.
- Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 0,45 μL de 20x dye de ligação de DNA e 4,55 μL de mastermix ROX baixo para cada poço.
- Adicione 3 μL de amostra pré-amplificada a cada poço, gire a placa PCR a 1.300 x g,em seguida, coloque a placa no gelo.
- Prepare a placa de ensaio para o chip de matriz dinâmica 96.96.
- Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 3,75 μL de 2x ge ensaio de carregamento reagente e 1,25 μL de tampão de suspensão de DNA para cada poço.
- Adicione 2,5 μL de 10 μM qPCR primer a cada poço correspondente. Gire a placa PCR a 1.300 x g por 5 min.
- Carregue e execute o Chip De Matriz Dinâmica 96.96.
- Prime o chip com fluido de linha de controle.
- Coloque o chip em um IFC Controller HX e execute o script Prime (136X).
- Adicione 6 μL da amostra da placa de amostra PCR nos poços de amostra correspondentes no Chip de Matriz Dinâmica 96,96.
- Adicione 6 μL da amostra da placa de ensaio PCR nos poços de ensaio correspondentes no Chip de Matriz Dinâmica 96.96.
- Use agulhas para estourar quaisquer bolhas de ar nos poços do Chip Dynamic Array 96.96.
- Coloque o Chip de Matriz Dinâmica 96.96 no IFC Controller HX e execute o script Load Mix (136x).
- Remova o chip do IFC Controller HX, retire o adesivo protetor e coloque o Chip 96.96 Dynamic Array em uma plataforma RT-qPCR microfluida. Execute o protocolo GE Fast 96 x 96 PCR (30 ciclos).
NOTA: A qualidade e a validade do RNA dos resultados são avaliadas por múltiplos métodos, incluindo validação de ensaios via eletroforese em gel, curvas de temperatura de fusão, réplicas de amostras e ensaios e parcelas padrão da série de diluição. Além disso, os achados transcritos podem ser validados por métodos independentes sobre hemiseção cerebral, incluindo blot ocidental e ensaios de imunofluorescência.
8. Medir a abundância bacteriana com RT-qPCR microfluido
- Extrair o DNA bacteriano seguindo as instruções do kit de extração de DNA das fezes.
- Estimar a concentração de DNA bacteriano usando qPCR.
- Adicione o DNA bacteriano extraído a uma nova placa PCR. Adicione 1 μL de DNA bacteriano extraído e 9 μL de tampão de suspensão de DNA.
- Prepare a placa de ensaio para o chip de matriz dinâmica 48.48 (ver passos 7.2.1-7.2.2)
- Prepare a placa de amostra para o chip de matriz dinâmica 48.48 (ver passos 7.3.1-7.3.2)
- Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 0,45 μL de 20x de dine de ligação de DNA e 4,55 μL de mastermix ROX baixo a 48 poços.
- Adicione 3 μL da amostra da placa PCR contendo o DNA bacteriano aos 48 poços e gire a placa PCR a 1.300 x g por 5 min. Armazene a 4 °C.
- Carregar e executar o Chip 48.48 Dynamic Array (ver passos 7.4.1-7.4.7).
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Representative Results
A seleção das células únicas foi validada visual mente e molecularmente. Visualmente, a morfologia celular foi vista antes da coleta celular. As células coletadas foram então visualizadas na estação QC e a mancha de núcleos celulares (DAPI) se sobrepôs à fluorescência do marcador de seleção de células únicas. A Figura 2A mostra imagens representativas de um slide com o antecérebro de rato hemissilado contendo o CeA. Imagens subseqüentes (Figura 2B-D) mostram a seleção de células únicas e sua remoção do tecido para análise transcriômica. Molecularmente, os marcadores específicos do tipo celular demonstraram maior expressão nesse tipo de célula(Figura 1C). Analisamos neurônios, microglia e astrócitos e medimos a expressão de NeuN, Mafe Gfap,respectivamente. Os números foram originalmente publicados em O'Sullivan et al.4.
Além disso, os controles também podem ser executados na plataforma microfluida para validar os achados de expressão (por exemplo, análise de outras áreas do mesmo tecido para demonstrar a especificidade do núcleo). Um tecido separado também poderia ser comparado com a amostra desejada para demonstrar especificidade do primer no tecido de interesse. Genes de controle positivos e negativos também podem ser incluídos (por exemplo, genes conhecidos por estarem ausentes do tecido selecionado ou expressos altamente). Três ou quatro genes de limpeza também devem ser incluídos não apenas para fins de normalização de dados, mas também como medida de qualidade experimental. Esses genes devem demonstrar a menor variância na expressão em todas as amostras e tratamentos. Neste experimento representativo, nenhuma região cerebral alternativa foi ensaio, mas os genes de limpeza Ldha e Actb foram usados para a normalização. Gapdh foi usado como controle interno.
A Figura 3 exibe alguns dos métodos multivariados que nosso grupo usou para analisar nossos dados. Descobrimos que os astrócitos do grupo Retirada eram o tipo de célula mais afetada. Com base nesses dados no contexto de outros estudos, especula-se que os astrócitos desempenham um papel fundamental na inflamação no CeA durante a retirada de opióides e que isso contribui para os sintomas físicos e emocionais que impulsionam a busca de drogas via reforço negativo. Também mostramos os dados da microflora intestinal(Figura 4).
Figura 1: Fluxo de trabalho RT-qPCR de célula única e heterogeneidade transcricional. (A) Protocolo experimental (n = 4 para cada condição) (B) Medição de transcrição de amostra de dez células agrupada. (C) O enredo da barra exibe valores medianos de expressão ΔΔCt. Neurônios = roxo; microglia = amarelo; astrócitos = verde. As barras de erro mostram erro padrão. *p < 0,05, ***p < 0,0003; O teste de significância honesto de Tukey. (D) O mapa de calor mostra a expressão de todas as amostras em 40 genes ensaios. As linhas são amostras agrupadas de 10 células (930 amostras neuronais, 950 amostras microgliais, 840 amostras de astrócitos como denotadas); os números denotam os clusters de amostra e as colunas são os genes. A figura é modificada de O'Sullivan et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de microdissecção de captura a laser. (A)Quatro fatias de cetador hemisecizado desidratado contendo o CeA em um slide. As fatias foram colocadas no slide exatamente a 10 μm da fatia anterior. Esquerda é anterior e direita é posterior. A distância da bregma pode ser estimada usando um atlas cerebral de ratos e pontos turísticos, incluindo o trato óptico e a estria terminal. (B-D) Sequência de imagens mostrando a seleção de células únicas no CeA (C) e sua remoção do tecido(D). Várias tampas de LCM foram usadas para selecionar essas células. Uma tampa é usada para pegar 10 células de um tipo de célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos 1. (A) Um esquema de desenho animado de uma célula que exibe os genes ensaios e sua localização. Os símbolos genéticos aqui rotulados são uma referência para o painel B. (B) Os quadrados coloridos representam expressão genética relativa (valor mediano -ΔΔCt) para os genes representados no painel A. A localização dos quadrados representa a localização celular ou função da proteína correspondente. Os painéis exibem a expressão genética relativa representada pela cor entre tratamentos e tipos celulares. Amarelo = alta expressão; azul = baixa expressão; branco = expressão neutra. A figura é modificada de O'Sullivan et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos 2. (A)Redes de correlação genética. A correlação de Pearson foi realizada nos valores -ΔΔCt dentro de um tratamento e tipo celular. Os nódulos denotam os genes e sua cor significa os níveis de expressão relativos (o valor mediano -ΔΔCt para cada gene). As bordas denotam correlações de expressão e a espessura significa a força da correlação de expressão (ρ). São exibidas correlações com um valor q <0,001. Bordas pretas = correlações positivas; bordas verdes = correlações negativas. (B) Parcelas de barras de genes selecionados demonstrando expressões genéticas diferenciais significativas. As estatísticas foram calculadas utilizando-se a aninhada ANOVA #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001 (n = 4 animais para todos os tratamentos). A figura é modificada de O'Sullivan et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Abundância relativa de microflora intestinal. As barplots exibem a abundância relativa de espécies bacterianas (-ΔΔCt valores). #p < 0.1, *p < 0.05, **p < 0.008, ***p = 0,0009; ANOVA bidirecional; n = 4 animais para cada tratamento. A figura é modificada de O'Sullivan et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A biologia unicelular demonstrou a heterogeneidade dos fenótipos celulares e a robustez da função tecidual. Esses achados forneceram insights sobre a organização de sistemas biológicos em escalas macro e micro. Aqui, descrevemos a combinação de dois métodos, LCM e qPCR microfluido, para obter medidas de transcriptome unicelular que fornecem especificidade anatômica e precisão transcricional a um custo relativamente baixo (Figura 1). Nosso grupo adota uma abordagem de biologia de sistemas e muitas vezes mede múltiplos tecidos no mesmo animal. Consideramos esses métodos flexíveis e frutíferos na determinação de como os sistemas biológicos respondem a vários desafios no nível transcricional. Além disso, usamos esses métodos no mapeamento anatômico de fenótipos celulares em condições de linha de base.
Fornecemos dados e números modificados de uma publicação recente explorando como o CeA responde à dependência e retirada de opióides4. Neste exemplo, usamos a mesma plataforma microfluida qPCR para medir a abundância relativa da microflora intestinal. Os métodos e o fluxo de trabalho são resumidos na Figura 1 e foram originalmente publicados em O'Sullivan et al.4. Os principais achados do RT-qPCR microfluido de alto throughput podem ser posteriormente validados por medidas proteicas como a mancha ocidental ou a imunofluorescência4.
Um grande desafio dessa abordagem de biologia de sistemas é determinar mecanismos biológicos causais específicos. A lógica fuzzy é uma solução validada que temos empregado com sucesso para inferir agentes no comportamento da rede reguladora de genes2. A manipulação de modelos animais também pode ser empregada para fornecer insights sobre mecanismos sistêmicos. Por exemplo, o mesmo protocolo aqui fornecido com a adição de uma coorte de ratos com uma vagotomia gástrica produzirá dados que fornecem informações sobre o fluxo de informações através do nervo vago.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O trabalho aqui apresentado foi financiado através do NIH HLB U01 HL133360 concedido à JS e RV, NIDA R21 DA036372 concedido à JS e EVB, e T32 AA-007463 concedido a Jan Hoek em apoio à SJO's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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