Summary
이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.
Abstract
해부학적으로 인접한 단일 세포에서 심오한 전사 이질성은 강력한 조직 기능이 세포 표현형 다양성에 의해 달성될 수 있음을 시사한다. 생물학적 시스템의 네트워크 역학을 조사하는 단세포 실험은 생물학적으로 의미 있는 해상도에서 다양한 조건에 대한 세포 및 조직 반응을 입증합니다. 본 명세서에서, 우리는 해부학적으로 특정 한 위치에서 단 하나 세포를 집합하고 정확하게 그들의 유전자 발현 단면도의 부분 집합을 측정하기 위한 우리의 방법을 설명합니다. 우리는 레이저 포획 미세 해부 (LCM)와 미세 유체 역 전사 정량 중합효소 연쇄 반응 (RT-qPCR)을 결합합니다. 우리는 또한 이 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼을 사용하여 장 내용물의 미생물 풍부를 측정합니다.
Introduction
단일 세포의 유전자 발현 프로파일을 측정하는 것은 조직 내에서 광범위한 표현형 이질성을 입증하였다. 이 복잡성은 조직 기능을 통제하는 생물학 네트워크의 우리의 이해를 복잡하게 했습니다. 우리 그룹과 다른 사람들은 많은 조직과 조건에서이 현상을탐구했다1, 2,3,4,5,6. 이러한 실험은 유전자 발현 네트워크의 조절이 이러한 이질성의 근간을 이룬다는 것을 시사할 뿐만 아니라, 단일 세포 분해능이 조직 수준의 분해능이 인식되지 못하는 조직 기능의 복잡성을 드러낸다. 실제로, 세포의 단지 작은 소수민족은 특정 조건 또는 도전에 반응할 수 있습니다, 그러나 전반적인 생리학에 그 세포의 충격은 실질적일지도 모릅니다. 또한 다중 세포 유형 및 조직에서 고차원 데이터 세트에 다변량 방법을 적용하는 시스템 생물학 접근법은 시스템 전반의 치료 효과를 해명할 수 있습니다.
우리는 이러한 데이터 세트를 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 RT-qPCR을 결합합니다. 우리는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 통해 단 하나 세포를 집합하고 RNA 염기서열 분석 (RNA-seq)를 사용하여 그들의 전사체를 측정하는 것과는 대조적으로 여기에서 이 접근을 취합니다. FACS에 비해 LCM의 장점은 단일 세포의 정확한 해부학적 특이성을 LCM으로 비교적 그리고 절대적으로 문서화할 수 있다는 것입니다. 또한, RNA-seq는 RT-qPCR, 미세유체 RT-qPCR이 저렴하고 더 높은 감도 및 특이성을 가지는 더 많은 특징을 측정할 수 있는 반면7.
이러한 대표적인 실험에서, 우리는 편도체(CeA) 및 장내 미생물 풍부의 중앙 핵에서 쥐 신경, 마이크로글리아 및 성상세포 유전자 발현에 대한 오피오이드 의존성 및 날트렉손 침전된 오피오이드 의 효과를조사하였다 4. 4개의 처리 단을 분석하였다: 1) 위약, 2) 모르핀, 3) 날트렉손, 및 4) 철수(도 1). 우리는 오피오이드 의존성이 유전자 발현을 실질적으로 변경하지 않았다는 것을 발견했지만, 오피오이드 금단은 특히 선동적인 유전자, Tnf의 발현을 유도하였다. 성상 세포는 가장 영향을 받는 세포 유형이었다. 장내 미생물군유전체는 오피오이드 인출에 의해 심오하게 영향을 받았는데, 이는 장이뇨증8,9의확립된 마커인 박테로이드 비율에 대한 Firmicutes의 감소에 의해 나타났다.
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Protocol
이 연구는 토마스 제퍼슨 대학과 드렉셀 대학 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 권고에 따라 수행되었다. 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학과 의학 IACUC의 드렉셀 대학에 의해 승인되었다.
1. 동물 모델
- 2 개의 75 mg 느린 릴리스 모르핀 황산 염 펠 릿 또는 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐에 피하 하 게 두 개의 위약 펠 릿을 삽입 합니다.
- 경미한 멸균 수술에 가운과 장갑을 적절히 사용하십시오. 필요한 경우 쥐 도르섬을 클리퍼로 면도합니다.
- 동물의 눈에 수의사 연고를 바르고 있습니다. 약 20 s의 이소플루란 흡입으로 쥐를 마취시다. 마취는 의식 상실로 확인됩니다.
- 비드 멸균 무딘 가위로 쥐 도르섬에 중간 절개를하고 비드 살균 프로브로 신체 벽에서 진피를 분리하십시오. 비드 멸균 집게로 진피 아래에 펠릿을 삽입합니다. 절개를 멸균 바늘로 닫아 봉합합니다.
참고 : 전체 절차는 쥐 당 약 5 분이 소요됩니다. 신선한 멸균 장갑은 각 쥐에 사용됩니다. - 수술 후 회복을 위해 쥐를 격리 케이지에 넣습니다. 심장 박동과 규칙적인 호흡 리듬을 확인하십시오. 의식이 회복 될 때까지 쥐를 관찰하십시오. 수술 후 통증을 평가하십시오.
- 쥐를 평가 8 수술 후 시간 및 모든 12 복구 및 감염 후 시간. 그들은 완전히 수술에서 회복 될 때 코호트의 나머지와 케이지에 쥐를 배치, 약 24 시간 수술 후.
- 피상성 날트렉손 주사 (75 mg/kg)를 모르핀 노출 6 일 후에 G 및 철수 코호트에 제공합니다.
참고: 이 대표적인 실험에는 4개의 쥐 코호트가 있었다(그림 1참조).
2. 샘플 수확
- 펠릿 삽입 후 6일 간 뇌를 수확하거나 날트렉손 주사 후 24시간 동안 수확하십시오.
- 약 30 s 또는 의식 상실이 발생할 때까지 이소플루란 챔버에 동물을 배치, 운동의 부족과 감소 호흡 속도에 의해 표시.
- 날카로운 기요틴을 사용하여 동물을 빠르게 죽이게 하십시오.
- 동물의 두개골에서 뇌를 해부.
- 날카로운 핸드헬드 면도기를 사용하여 제거 된 뇌에 다음과 같은 총 절개를 만듭니다 : 첫째, 소뇌를 잘라 내고 폐기하십시오. 둘째, 뇌간을 전뇌와 가로 절개를 분리합니다. 셋째, 중추 시상 절개로 전뇌 및 / 또는 뇌간을 헤미크로.
- 전뇌와 뇌간을 금형 바닥에 3-4cm의 최적 절삭 온도 화합물(OCT)이 있는 플라스틱 조직 내장 금형에 넣습니다. 나머지 샘플은 OCT로 덮습니다.
- 즉시 드라이 아이스와 메탄올을 포함하는 욕조에 OCT로 덮여 샘플플라스틱 조직 포함 금형을 놓습니다. 메탄올이 조직 내장 곰팡이에 흘러 들어가지 않도록하십시오. 조직 수집이 완료 될 때까지 메탄올 - 얼음 욕조에서 뇌 샘플과 함께 포함 곰팡이를 유지 (~ 10-15 분 최대).
- 가능한 한 빨리 뇌 샘플을 -80°C 냉동고에 넣습니다.
- 동시에 창자 샘플을 수확.
- 급속한 참수 후, 메스로 동물의 복부에 중간 절개를하십시오.
- 소양(cecum)을 찾아 서갈 대장과의 연결을 끊는다.
- 세칼 내용물15mL 원뿔형 튜브에 짜냅니다.
- 즉시 원두 튜브를 드라이 아이스에 놓고 가능한 한 빨리 -80 °C 냉동고에 넣습니다.
참고 : 소장 내용물도 부정적인 대조군과 동일한 방법을 사용하여 수집 할 수 있습니다.
3. 슬라이스
- 저온 중지를 사용하여 편도된 쥐 전뇌를 슬라이스합니다.
- -80°C 냉동고에서 전뇌로 플라스틱 임베딩 몰드를 제거하고 -20°C 저온 가에 놓습니다.
- 임베딩 몰드에서 OCT 내장 된 hemisected 전뇌 샘플을 제거합니다. 필요한 경우 면도기를 사용하여 플라스틱 임베딩 금형의 모서리를 수직으로 슬라이스합니다. OCT를 사용하여 저온 극저온 척에 코달 코로나 슬라이스로 로스트랄에 대한 전뇌를 마운트합니다.
참고: CeA를 식별하는 해부학 적 랜드 마크는 광학 관 및 줄무아 말단을 포함한다(그림 2B). 광학 관은 광학 chiasm에서 분기하고 두뇌가 꼬리에 rostral로 슬라이스로 등측 측을 추적합니다. 때 광학 관은 쥐 두뇌 지도책 -2.12 mm10에서보인 것과 유사한 형태학이 있을 때, 시험 조각은 현미경의 밑에 볼 수 있습니다. 광학 관 및 stria 말단 의 형태는 쥐 두뇌 지도책(10)에서 bregma 및 CeA가 줄무늬 단자 포위하는지 여부를 확인하기 위하여 검사될 수 있습니다. - CeA를 포함하는 단면도에 도달할 때까지 편수된 전뇌 로스트랄에서 꼬리까지 10 μm 두께의 관상 동맥 부분을 슬라이스합니다.
참고: 단면의 너비와 높이는 약 200mm입니다. - 일반 유리 슬라이드에 10 μm 섹션을 해동하여 CeA 또는 바람직한 뇌 영역을 포함하는 10 μm 섹션을 수집합니다. 즉시 유리 슬라이드를 드라이 아이스 위에 놓는 금속 팬에 놓습니다. 가능한 한 빨리 -80 °C 냉동고에 뇌 섹션슬라이드를 넣어.
참고: 동일한 슬라이드에 여러 조각을 배치할 수 있습니다. 동일한 슬라이드의 슬라이스에 대해 다른 세포 유형 얼룩을 사용하는 경우, 소수성 펜을 사용하여 슬라이드에서 세포 유형 별 항체 용액을 분리할 수 있도록 슬라이스 사이에 약 100mm를 둡니다. 슬라이스의 각 측면에 슬라이드의 가장자리에서 약 20mm를 둡니다.
4. 면역 형광 염색
- 면역형광을 사용하여 선택한 뇌 세포(예: 뉴런, 미세글리아, 성상세포 등)에 대한 전뇌 부분을 염색합니다.
- -80°C 냉동고에서 CeA의 10 μm 섹션으로 하나 이상의 슬라이드를 제거합니다.
- 30s에 75% 에탄올로 슬라이드를 고정합니다.
- 1x 인산완충염 (PBS)에서 2 % 소 혈청 항원 (BSA)으로 30 s의 슬라이스를 차단합니다. PBS로 1x를 씻으소서.
- 슬라이드에 1차 항체 용액을 2분 동안 추가합니다. 2% BSA 용액으로 1x세척하십시오.
참고: 1차 항체 용액은 위의 차단 단계에 대해 2% 1차 항체, 1% RNase Out 및 동일한 BSA PBS 용액의 96%로 구성된다(단계 4.1.3). 대표적인 실험은 항-NeuN 항체, 항-Cd11β 항체 및 항-GFAP 항체를 다음과 같은 수량으로 사용하였다: 1차 3 μL, RNA 억제제의 1.88 μL, 및 BSA 용액의 145.12 μL. - 이차 항체 용액을 슬라이드에 3 분 동안 추가하십시오. PBS로 1x 씻어.
참고: 이차 항체 용액은 염소 항 마우스 488 nm 형광 태그(1:500), RNA 억제제 2.5 μL, DAPI 1.3 μL(1:10,000), 및 2% BSA의 196.5 μL로 구성된다.
5. 에탄올 과 자일렌 탈수 시리즈
- 슬라이드를 30초 동안 75% 에탄올에 담그고, 슬라이드를 30초 동안 95% 에탄올로 담근 직후, 슬라이드를 30초 동안 100% 에탄올로 찍어 30초 동안 100% 에탄올을 넣은 후, 슬라이드를 30초 동안 100% 에탄올을 함유한 두 번째 용기에 담급깁니다.
- 에탄올 탈수 시리즈에 이어, 슬라이드를 갓 붓고 자일렌에 1 분 동안 담그고 즉시 슬라이드를 자일렌의 두 번째 용기에 4 분 동안 담급입니다.
- 자일렌 욕조에서 슬라이드를 제거하고 5 분 동안 어둠 속에서 공기건조시키십시오.
- 슬라이드를 건조기에서 5분 간 더 건조시도록 놓습니다.
6. 레이저 캡처 미세 해부
- 얼룩이 진 경우, 현미경으로 슬라이드를 배치하고 해부학 적 랜드 마크 (즉, 광학 치아와 줄무늬 말단)를 사용하여 관심 영역 (CeA)을 찾습니다.
- 관심 있는 지역에서 염색된 세포 모형 및 그것의 핵을 확인하기 위하여 형광을 이용하십시오. 단일 셀 풀백 샘플을 수행하는 경우 하나의 셀 또는 여러 셀을 선택합니다. LCM 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 셀을 표시합니다.
- LCM 캡을 관심 영역의 슬라이스 위에 놓습니다.
- 적외선(IR) 레이저의 테스트 샷을 사용하여 IR 레이저 강도, 크기 및 지속 시간을 조정하여 LCM 캡 접착제가 선택한 단일 셀의 영역에만 녹도록 합니다. 이렇게 하면 선택한 셀 이외의 다른 셀이 수집되지 않습니다.
참고: 본 대표적인 실험에서, 동일한 세포 유형의 10개의 세포 풀은 동일한 처리를 가진 견본 사이 유전자 발현에 있는 세포 간 가변성을 제한하기 위하여 단 하나 견본으로 이용되었습니다. 그러나, 이 방법은 진정한 단세포 실험1,3에사용될 수 있다. - LCM 소프트웨어 도구를 사용하여 분석을 위해 수집할 개별 셀을 선택합니다(그림2C). 선택된 세포는 쥐 뇌 지도10 및 bregma10에기초하여 CeA (또는 선택의 뇌 영역)의 해부학 영역에 있어야 합니다. 세포는 인접한 염색된 핵으로부터 적어도 3 μm이어야 한다.
- 식별된 단일 셀을 수집하기 위해 IR 레이저를 발사합니다.
- 품질 관리(QC) 스테이션에 캡을 놓고 원하는 셀만 선택되었는지 확인합니다. 다른 세포가 실수로 선택된 경우, 캡이 QC 스테이션에 남아있는 동안 자외선 레이저를 사용하여 원치 않는 세포를 파괴 할 수 있습니다.
- 세포가 수집 된 곳에서 조직 섹션의 사진을 찍어 해부학 적 특이성을 문서화하십시오. 쥐 뇌 아틀라스를기준(10)으로사용하여 적절한 경우 bregma로부터 슬라이스의 거리를 기록한다.
- QC 스테이션에서 LCM 캡을 제거하고 샘플 추출 장치를 부착하고 샘플에 5.5 μL의 포염 버퍼를 피펫합니다.
참고: 용해 완충액은 0.5 μL의 용해 증강제와 5 μL의 재서스펜션 버퍼로 구성됩니다. - ExtracSure 장치를 0.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 장착하고 핫플레이트에 15 분 동안 75 °C에 놓습니다.
- 샘플 및 용해 버퍼를 저속(0.01-0.02 x g)에서30s로 회전시키고 수집된 샘플을 -80°C 냉동고에 넣습니다.
7. 단세포 미세 유체 RT-qPCR
- 96.96 동적 어레이 칩용 단일 셀 mRNA의 전암화
- 전암화(각 프라이머 500 nM 농도)를 위한 프라이머 풀에서 분석되는 모든 유전자에 대해 전진 및 역방향 mRNA qPCR 유전자 프라이머를 결합한다. 예를 들어, 80 μL에서 100 μM 프라이머의 1 μL 플러스 DNA 현탁액 완충액의 120 μL.
참고: 대표적인 실험에 사용되는 프라이머 서열은 O'Sullivan 등에서 찾을 수있습니다. 4. - 새로운 96 x 96 PCR 플레이트에 각 웰에 5x VILO 1 μL을 추가합니다.
- -80°C에 저장된 샘플에서 LCM 단일 세포 샘플을 제거하고, 짧은 해동을 하고, 원심분리기를 저속(0.01-0.02 x g)으로짧게 하고, 용해된 단일 세포 샘플의 5.5 μL을 PCR 플레이트에 추가합니다. 각 샘플은 자체 웰에 추가됩니다.
- 샘플과 VILO가 있는 PCR 플레이트를 열전자전거에 넣고 65°C에서 1.5분 동안 가열합니다.
- 10x cDNA 합성 마스터 믹스의 0.15 μL, 0.12 μL T4 유전자 32 단백질, 및 0.73 μL의 DNA 현탁액 완충액을 각각 잘 첨가합니다.
- PCR 플레이트를 열전도에 넣고 다음 프로토콜을 실행합니다: 5분 동안 25°C, 30분 동안 50°C, 25분 동안 55°C, 5분 동안 60°C, 10분 동안 70°C, 4°C에서 끝까지 실행한다.
- 각 우물에 7.5 μL의 타크 폴리머라제 마스터 믹스를 추가합니다.
- 프라이머 풀의 1.5 μL을 각 우물에 추가합니다(위 참조).
- PCR 플레이트를 열병기에서 놓고 다음과 같은 전암화 프로토콜을 실행합니다: 95°C에서 10분 동안, 5초 동안 96°C의 22 사이클, 60°C를 4분 동안 실행합니다.
- 엑소뉴클레아제 I 반응 완충액 10x, 1.2 μL 외핵구 I, 및 4.2 μL의 DNA 현탁액 완충액을 각각 잘 첨가한다.
- PCR 플레이트를 열전도사이클러에 놓고 다음 프로토콜을 실행합니다: 37°C에서 30분, 80°C에서 15분.
- 각 우물에 TE 버퍼 54 μL을 추가합니다. PCR 플레이트를 1,300 x g에서 5분간 회전시. 다음 단계로 즉시 계속하면 4°C에서 보관하십시오. 다음 단계를 위해 12시간 이상 기다리는 경우 -20°C에서 보관하십시오.
- 전암화(각 프라이머 500 nM 농도)를 위한 프라이머 풀에서 분석되는 모든 유전자에 대해 전진 및 역방향 mRNA qPCR 유전자 프라이머를 결합한다. 예를 들어, 80 μL에서 100 μM 프라이머의 1 μL 플러스 DNA 현탁액 완충액의 120 μL.
- 96.96 동적 어레이 칩용 샘플 플레이트를 준비합니다.
- 새로운 96 웰 PCR 플레이트에 20x DNA 결합 염료의 0.45 μL과 낮은 ROX 마스터믹스의 4.55 μL을 각 웰에 추가합니다.
- 각 우물에 3 μL의 미리 증폭 된 샘플을 추가하고 PCR 플레이트를 1,300 x g에서돌린 다음 얼음위에 접시를 놓습니다.
- 96.96 동적 배열 칩에 대한 분석 판을 준비합니다.
- 새로운 96 웰 PCR 플레이트에서, 2x GE 분석 로딩 시약의 3.75 μL및 1.25 μL의 DNA 현탁액 버퍼를 각각의 웰에 추가합니다.
- 각각의 해당 웰에 2.5 μL의 10 μM qPCR 프라이머를 추가합니다. PCR 플레이트를 1,300 x g에서 5분 동안 돌이내게 합니다.
- 96.96 동적 어레이 칩을 로드하고 실행합니다.
- 제어 라인 유체로 칩을 프라이밍합니다.
- IFC 컨트롤러 HX에 칩을 놓고 프라임(136X) 스크립트를 실행합니다.
- 96.96 동적 어레이 칩의 해당 샘플 웰에 PCR 샘플 플레이트의 샘플 6 μL을 추가합니다.
- 96.96 동적 어레이 칩에서 PCR 분석 판에서 샘플의 6 μL을 해당 분석 우물에 추가합니다.
- 바늘을 사용하여 96.96 다이나믹 어레이 칩의 우물에 기포를 터뜨립니다.
- 96.96 동적 어레이 칩을 IFC 컨트롤러 HX에 넣고 로드 믹스(136x) 스크립트를 실행합니다.
- IFC 컨트롤러 HX에서 칩을 제거하고 보호 스티커를 벗기고 96.96 동적 어레이 칩을 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼에 넣습니다. GE Fast 96 x 96 PCR 프로토콜(30사이클)을 실행합니다.
참고: 결과의 RNA 질 그리고 타당성은 젤 전기 영동을 통한 분석 검증, 용융 온도 곡선, 견본 및 분석 법 복제 및 표준 희석 계열 플롯을 포함하여 다중 방법에 의해 평가됩니다. 추가적으로, 전사 사실 인정은 서쪽 얼룩 및 면역 형광 분석법을 포함하여 두뇌 hemisection에 독립적인 방법에 의해 유효할 수 있습니다.
8. 미세 유체 RT-qPCR로 세균 풍부도 측정
- 대변 DNA 추출 키트의 지시에 따라 세균 DNA를 추출합니다.
- qPCR을 사용하여 세균 DNA 농도를 추정합니다.
- 추출된 박테리아 DNA를 새 PCR 플레이트에 추가합니다. 추출된 세균 DNA 1 μL과 9 μL의 DNA 서스펜션 버퍼를 첨가합니다.
- 48.48 동적 배열 칩에 대한 분석 판 준비(단계 7.2.1-7.2.2 참조)
- 48.48 동적 어레이 칩에 대한 샘플 플레이트 준비(단계 7.3.1-7.3.2 참조)
- 새로운 96웰 PCR 플레이트에 20x DNA 결합 염료0.45 μL과 48개의 웰에 낮은 ROX 마스터믹스 4.55 μL을 추가합니다.
- 세균 DNA를 함유한 PCR 플레이트에서 시료 3 μL을 48개의 웰에 넣고 PCR 플레이트를 1,300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
- 48.48 동적 어레이 칩을 로드하고 실행합니다(단계 7.4.1-7.4.7 참조).
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Representative Results
단일 세포의 선택은 시각적으로 그리고 분자적으로 모두 검증되었다. 시각적으로, 세포 형태는 세포 수집 전에 볼 수 있었다. 수집된 세포는 QC 스테이션및 세포핵 얼룩(DAPI)에서 단일 세포 선택 마커 형광과 중첩된 후 볼 수 있었다. 그림 2A는 CeA를 포함하는 척랫래전뇌를 가진 슬라이드의 대표적인 이미지를 나타낸다. 후속이미지(도 2B-D)는전사분석을 위한 단일 세포 및 이들의 제거를 조직으로부터의 선택과 보여준다. 분자적으로, 세포 유형 별 마커는 그 세포 유형에서 증가된 발현을 입증하였다(도1C). 뉴런, 마이크로글리아, 성상세포를 살펴보고 NeuN, Maf및 Gfap의발현을 각각 측정했습니다. 수치는 원래 오설리반 외4.
또한, 대조군들은 또한 미세유체 플랫폼에서 실행되어 발현 발견(예를 들어, 핵 특이성을 입증하기 위해 동일한 조직의 다른 영역의 분석)을 검증할 수 있다. 별도의 조직은 또한 관심 있는 조직에서 프라이머 특이성을 입증하기 위해 원하는 샘플과 비교될 수 있다. 양성 및 음성 대조군 유전자는 또한 포함될 수 있다(예를 들어, 선택된 조직에서 결석하거나 높게 발현되는 것으로 알려진 유전자). 3개 또는 4개의 하우스키핑 유전자는 데이터 정상화 를 위한 것뿐만 아니라 실험 적 품질의 척도로도 포함되어야 합니다. 이 유전자는 모든 견본 및 처리를 통해 발현에 있는 가장 낮은 분산을 보여주어야 합니다. 이 대표적인 실험에서는, 대체 두뇌 지역은 분석되지 않았습니다, 그러나 하우스키핑 유전자 Ldha 및 Actb는 정규화를 위해 이용되었습니다. Gapdh는 내부 통제로 사용되었습니다.
그림 3은 당사 그룹이 데이터를 분석하는 데 사용한 다변량 방법 중 일부를 표시합니다. 우리는 철수 단에 있는 성상 세포가 가장 영향 받은 세포 모형이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 그밖 연구 결과의 맥락에서 이 데이터에 근거를 두어 우리는 성상 세포가 오피오이드 철수 도중 CeA에 있는 염증에 있는 중요한 역할을 하고 이것이 부정적인 강화를 통해 약 추구를 몰는 물리적, 정서적 현상에 기여한다는 것을 추측합니다. 우리는 또한 창 자 microflora 데이터를 보여 준다(그림 4).
도 1: 단세포 RT-qPCR 워크플로우 및 전사 이질성. (a)실험 프로토콜 (각 조건에 대해 n = 4)(B)10 세포 풀린 샘플 전사체 측정. (C)막대 플롯은 중앙값 -ΔΔCt 표현식 값을 표시합니다. 뉴런 = 보라색; 마이크로글리아 = 노란색; 성상 세포 = 녹색. 오류 막대에 표준 오류가 표시됩니다. * p < 0.05, ***p & 0.0003; 투키의 정직한 중요성 테스트. (D)히트 맵은 40개의 분석 유전자에 걸쳐 모든 샘플의 발현을 나타낸다. 행은 10 세포 풀린 샘플 (930 뉴런 샘플, 950 마이크로 교술 샘플, 840 성상 세포 샘플로 표시); 숫자는 견본 군집을 나타내고 열은 유전자입니다. 그림은 오설리반 외4에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 레이저 캡처 미세 해해 이미지. (A)슬라이드에 CeA를 함유하는 탈수된 축척된 쥐 의 4개의 슬라이스. 슬라이스는 이전 슬라이스로부터 정확히 10 μm 떨어진 슬라이드에 놓였다. 왼쪽은 앞쪽이고 오른쪽은 후방입니다. bregma에서 거리는 쥐 두뇌 지도책 및 획기적인, 광학 관 및 stria 말단을 포함하여 사용하여 추정될 수 있습니다. (B-D) CeA(C)및 조직에서의 이들의제거(D)에서단일 세포의 선택을 보여주는 이미지의 시퀀스. 여러 개의 LCM 캡을 사용하여 이러한 셀을 선택하였다. 하나의 캡은 한 세포 유형의 10 셀을 선택하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표적인 결과 1. (A)분석된 유전자와 그 위치를 표시하는 세포의 만화 도식. 여기에 표기된 유전자 심볼은 패널 A에 나타난 유전자에 대한 상대적인 유전자 발현(중앙값 -ΔΔCt 값)을 나타내는 패널 B.(B)에 대한 참조이다. 사각형의 위치는 해당 단백질의 세포 국소화 또는 기능을 나타낸다. 패널은 처리와 세포 모형에 걸쳐 색깔로 표현된 상대적인 유전자 발현을 표시합니다. 노란색 = 높은 식; 파란색 = 낮은 식; 흰색 = 중립 식입니다. 그림은 오설리반 외4에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 결과 2. (A)유전자 상관 관계 네트워크. Pearson 상관관계는 치료 및 세포 유형 내에서 -ΔΔCt 값상에서 수행되었다. 노드는 유전자를 나타내고 그들의 색깔은 상대적인 발현 수준 (각 유전자에 대한 중앙값 -ΔΔCt 값)을 의미합니다. 가장자리는 식 상관 관계를 나타내고 두께는 식 상관 관계(θ)의 강도를 나타냅니다. q 값 및 lt;0.001과의 상관 관계가 표시됩니다. 검은색 가장자리 = 양수 상관관계; 녹색 가장자리 = 음의 상관 관계입니다. (B)바 플롯은 유의한 차동 유전자 발현을 입증하는 선택 유전자이다. 통계는 중첩된 ANOVA #p < 0.1, *p&0.05, **p&0.01, ***p & 0.0001(모든 치료에 대해 4마리의 동물)을 사용하여 계산하였다. 그림은 오설리반 외4에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 창 자 microflora의 상대적인 풍부. 바플롯은 박테리아 종의 상대적 풍부도를 표시합니다(-ΔΔCt 값). #p < 0.1, *p < 0.05, **p & 0.008, ***p = 0.0009; 양방향 ANOVA; n = 각 치료에 대해 4 마리의 동물. 그림은 오설리반 외4에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단세포 생물학은 세포 표현형의 이질성과 조직 기능의 견고성을 입증했습니다. 이 사실 인정은 거시와 마이크로 규모 둘 다에 생물학 시스템의 조직에 통찰력을 제공했습니다. 여기서, 우리는 비교적 저렴한 비용으로 해부학적 특이성 및 전사 정확도를 제공하는 단일 세포 전사체 측정을 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 qPCR이라는 두 가지 방법의 조합을설명한다(도 1). 우리 그룹은 시스템 생물학 접근법을 취하고 종종 동일한 동물의 여러 조직을 측정합니다. 우리는 생물학 시스템이 전사 수준에서 각종 도전에 어떻게 반응하는지 결정하는 데 유연하고 유익한 이 방법을 찾아내십시오. 추가적으로, 우리는 기준선 조건에 있는 셀 방식 표현형의 해부학 매핑에서 이 방법을 이용합니다.
우리는 CeA가 오피오이드 의존성과 철수에 어떻게 반응하는지 탐구하는 최근 간행물의 데이터 및 수정 된 수치를 제공합니다4. 이 예에서는 동일한 미세 유체 qPCR 플랫폼을 사용하여 장내 미생물의 상대적 풍부도를 측정했습니다. 방법과 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있으며 원래 O'Sullivan 등4에게시되었습니다. 고처리량 미세유체 RT-qPCR에서 중요한 사실 인정은 서쪽 얼룩 면역 형광과 같은 단백질 측정에 의해 이후에 검증될 수 있습니다4.
이 시스템 생물학 접근의 중요한 도전은 특정 인과 생물학 기계장치를 결정하는 것입니다. 퍼지 로직은 유전자 조절 네트워크 동작2에서에이전트를 추론하는 데 성공한 검증된 솔루션입니다. 동물 모델 조작은 또한 전신 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 본원에 제공된 동일한 프로토콜은 위 식육술이 있는 랫트 코호트의 첨가와 함께 미주 신경을 통한 정보의 흐름에 대한 통찰력을 제공하는 데이터를 산출할 것이다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
여기에 제시된 작품은 JS와 RV에 수여 NIH HLB U01 HL133360을 통해 투자되었다, JS와 EVB에 수여 NIDA R21 DA036372, T32 AA-007463 SJO의 지원을 위해 얀 후크에 수여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
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