Summary
Denne protokol forklarer, hvordan man indsamler enkelte neuroner, mikroglia, og astrocytter fra den centrale kerne af amygdala med høj nøjagtighed og anatomisk specificitet ved hjælp af laser capture mikrodissection. Derudover forklarer vi vores brug af mikrofluidic RT-qPCR til at måle en delmængde af transskriptionen af disse celler.
Abstract
Dyb transskriptionel heterogenitet i anatomisk tilstødende enkelte celler tyder på, at robust vævfunktionalitet kan opnås ved cellulær fænotype mangfoldighed. Encellede forsøg med at undersøge de biologiske systemers netværksdynamik viser cellulære og vævsreaktioner på forskellige tilstande ved biologisk meningsfuld opløsning. Heri forklarer vi vores metoder til indsamling af enkelte celler fra anatomisk specifikke steder og måler nøjagtigt en delmængde af deres genekspressionsprofiler. Vi kombinerer laser capture microdissection (LCM) med mikrofluidisk omvendt transskription kvantitative polymerase kædereaktioner (RT-qPCR). Vi bruger også denne mikrofluidiske RT-qPCR platform til at måle den mikrobielle overflod af tarmindhold.
Introduction
Måling af genekspressionsprofiler for enkelte celler har vist omfattende fænotypisk heterogenitet i et væv. Denne kompleksitet har kompliceret vores forståelse af de biologiske netværk, der styrer vævsfunktionen. Vores gruppe og andre har udforsket dettefænomen i mange væv og betingelser1,2,3,4,5,6. Disse eksperimenter tyder ikke kun på, at regulering af genekspressionsnetværk ligger til grund for en sådan heterogenitet, men også at encelleopløsning afslører en kompleksitet i vævsfunktionen, som opløsning på vævsniveau ikke værdsætter. Faktisk kan blot et lille mindretal af celler reagere på en bestemt tilstand eller udfordring, men virkningen af disse celler på den samlede fysiologi kan være betydelig. Derudover kan en systembiologitilgang, der anvender multivariate metoder til højdimensionelle datasæt fra flere celletyper og væv, belyse behandlingseffekter for hele systemet.
Vi kombinerer LCM og microfluidic RT-qPCR for at opnå sådanne datasæt. Vi tager denne tilgang her i modsætning til indsamling af enkelte celler via fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og ved hjælp af RNA-sekventering (RNA-seq) til at måle deres transkription. Fordelen ved LCM i forhold til FACS er, at den nøjagtige anatomiske specificitet af enkelte celler kan dokumenteres med LCM, relativt og absolut. Yderligere, mens RNA-seq kan måle flere funktioner, RT-qPCR, microfluidic RT-qPCR er billigere og har en højere følsomhed og specificitet7.
I dette repræsentative eksperiment undersøgte vi virkningerne af opioidafhængighed og naltrexon-udfældet opioidabstinenser på rotteneuronal, mikroglia og astrocytgenekspression i den centrale kerne af amygdala (Cea) og tarmmikrofloraoverflod4. Fire behandlingsgrupper blev analyseret: 1) Placebo, 2) Morfin, 3) Naltrexon, og 4) Tilbagetrækning (Figur 1). Vi konstaterede, at opioidafhængighed ikke i væsentlig grad ændrede genekspressionen, men at opioidabstinenser induceret ekspression af inflammatoriske gener, især Tnf. Astrocytter var den mest berørte celletype. Tarmmikrobiomet blev dybt påvirket af opioidabstinenser som indikeret af et fald i Firmicutes til Bacteroides-forholdet, som er en etableret markør for tarmdysbiosis8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Thomas Jefferson University og Drexel University College of Medicine. Protokollen blev godkendt af Thomas Jefferson University og Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Dyremodel
- Indsæt to 75 mg slow-release morfinsulfat pellets eller to placebo pellets subkutant hos voksne mandlige Sprague-Dawley rotter.
- Brug en kjole og handsker passende til mindre steril kirurgi. Barber rottedorsum med klippere, hvis det er nødvendigt.
- Påfør dyrlægen salve til dyrets øjne. Bedøve rotten med ca. 20 s af isofluran indånding. Anæstesi bekræftes ved tab af bevidsthed.
- Lav en midterlinje snit i rotte dorsum med perle-steriliseret stump saks og adskille dermis fra kroppenvæggen med en perle-steriliseret sonde. Sæt pillerne under dermis med perlesteriliserede pincet. Sutur snittet lukket med en steril nål.
BEMÆRK: Hele proceduren tager ca. 5 min pr. rotte. Der anvendes friske sterile handsker til hver rotte. - Anbring rotten i et isolationsbur med henblik på postkirurgisk genfinding. Kontroller for et hjerteslag og regelmæssig respiratorisk rytme. Overhold rotten, indtil bevidstheden er genvundet. Vurder for postkirurgiske smerter.
- Vurder rotterne 8 h efter operationen og hver 12 timer efter for nyttiggørelse og infektion. Placer rotter i et bur med resten af kohorten, når de er fuldt inddrives fra kirurgi, omkring 24 h postkirurgi.
- Giv G og Abstinenskohorterne en intraperitoneal naltrexoninjektion (75 mg/kg) efter 6 dages eksponering for morfin.
BEMÆRK: Der var fire rottekohorter i dette repræsentative eksperiment (se figur 1).
2. Høst af prøver
- Høst hjernen 6 dage efter pellet indsættelse eller 24 h efter naltrexon injektion.
- Anbring dyret i et isoflurankammer i ca. 30 s, eller indtil der opstår bevidstløshed, indikeret af manglende bevægelse og nedsat respirationsfrekvens.
- Brug en skarp guillotine til hurtigt at halshugge dyret.
- Dissekere hjernen ud fra dyrets kranium.
- Brug en skarp håndholdt barberkniv til at gøre følgende grove indsnit til den fjernede hjerne: Først skive lillehjernen og kassér. For det andet adskille hjernestammen fra forhjernen med et tværgående snit. For det tredje, hemisect forhjernen og / eller hjernestammen med en midterlinjen sagittal snit.
- Placer forhjernen og hjernestammen i en plastvæv-indlejring skimmel med 3-4 cm optimal skæring temperatur sammensatte (OLT) i bunden af formen. Dæk resten af prøven med OLT.
- Straks placere plastvæv-indlejring skimmel med prøven dækket med OLT i et bad, der indeholder tøris og methanol. Lad ikke methanolen spilde ind i vævsindlejringsformen. Hold indlejring skimmel med hjernen prøve i methanol-is bad, indtil væv indsamling er færdig (~ 10-15 min maksimum).
- Brainprøven anbringes i en -80 °C fryser så hurtigt som muligt.
- Høst tarmprøverne samtidigt.
- Efter hurtig halshugning, foretage en midterlinjen snit i dyrets mave med en skalpel.
- Find cecum og afskære sin forbindelse til den opstigende kolon.
- Klem det cecal indhold i en 15 ml konisk rør.
- Anbring straks det koniske rør på tøris og sættes i en -80 °C fryser så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Tyndtarmens indhold kan også indsamles ved hjælp af de samme metoder som en negativ kontrol.
3. Udskæring
- Skær den hemisected rotte forhjernen ved hjælp af en kryoat.
- Fjern plast indlejring formen med forhjernen fra -80 °C fryser og sted i en -20 °C kryoat.
- Fjern OLT-indlejret hemisected forhjernen prøve fra indlejring skimmel. Brug en barbermaskine til at skære hjørnerne af plast indlejring formen lodret, hvis det er nødvendigt. Monter forhjernen for rostral til caudal koronal udskæring på en cryostat chuck ved hjælp af OCT.
BEMÆRK: Anatomiske landemærker til at identificere CeA omfatter optiske tarmkanalen og stria terminalis (Figur 2B). Den optiske tarmkanalen grene fra den optiske chiasm og spor ryg-lateral som hjernen er skåret rostral til caudal. Når den optiske tarmkanalen har en morfologi svarende til, hvad der ses i en rotte hjerne atlas bregma -2,12 mm10, test skiver kan ses under et mikroskop. Den optiske tarmkanalen og stria terminalis morfologi kan kontrolleres i en rotte hjerne atlas10 at identificere bregma og omCea omgiver stria terminaler. - Skær 10 μm tykke koronale sektioner fra den hemisected forhjernen rostral til caudal indtil sektioner, der indeholder CeA er nået.
BEMÆRK: Sektionernes bredde og højde er ca. 200 mm. - 10 μm sektioner, der indeholder CeA, eller den foretrukne hjerneregion, indsamles ved optøning af 10 μm sektioner på almindelige glasglas. Placer straks glasgliderne på en metalpande, der hviler på tøris. Sæt objektglassene med hjernesektioner i en -80 °C fryser så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Der kan placeres flere udsnit på samme slide. Hvis du bruger en anden celletypeplet til skiver på samme dias, skal du lade ca. 100 mm mellem skiverne stå, så en hydrofob pen kan bruges til at adskille celletypespecifikke antistofopløsninger på sliden. Efterlad ca. 20 mm fra kanten af slæden på hver side af skiven.
4. Immunofluorescensfarvning
- Plette forhjernen sektioner for hjernen celle valg (f.eks neuron, mikroglia, astrocyte, osv.) ved hjælp af immunfluorescens.
- Fjern en eller flere objektglas med 10 μm dele af CeA fra fryseren -80 °C.
- Fastgør objektglassene med 75% ethanol i 30 s. Fjern den overskydende væske.
- Skiverne blokeres i 30 s med 2% bovinserumantigen (BSA) i 1x fosfatbuffersaltvand (PBS). Vask 1x med PBS.
- Der tilsættes en primær antistofopløsning til slidglasset i 2 min. Vask 1x med 2% BSA-opløsning.
BEMÆRK: Den primære antistofopløsning består af 2 % primært antistof, 1 % RNase Out og 96 % af samme BSA PBS-opløsning til blokeringstrinnet ovenfor (trin 4.1.3). Det repræsentative eksperiment anvendte et anti-NeuN antistof, et anti-Cd11β antistof og et anti-GFAP antistof i følgende mængder: 3 μL primær, 1,88 μL RNA-hæmmer og 145,12 μL BSA-opløsning. - Den sekundære antistofopløsning tilsættes til slæden i 3 min. Vask 1x med PBS.
BEMÆRK: Den sekundære antistofopløsning består af 1 μL gedeantimusemærke 488 nm fluorescerende tag (1:500), 2,5 μL RNA-hæmmer, 1,3 μL DAPI (1:10.000) og 196,5 μL af 2% BSA.
5. Ethanol og xylendehydrering sat i
- Dyp objektglassene i 75% ethanol i 30 s. Umiddelbart efter dyppes objektglassene i 95% ethanol i 30 s. Umiddelbart efter dyppes objektglassene i 100% ethanol i 30 s. Straks efter dyppes objektglassene i en anden beholder, der indeholder 100% ethanol til 30 s.
- Efter ethanoldehydreringsserien dyppes objektglassene i friskhældt xylen i 1 min. Umiddelbart efter dyppes objektglassene i en anden beholder med xylen i 4 min.
- Fjern glider fra xylen bad og lad luften tørre i mørke i 5 min.
- Placer glider i en ekssikkator i 5 min for at tørre yderligere.
6. Laser capture mikrodissection
- Hvis farves, skal du placere slæden ind i mikroskopet og finde den interesseregion (CeA) ved hjælp af anatomiske landemærker (dvs. den optiske chiasme og stria terminalis).
- Brug fluorescens til at identificere den farvede celletype og dens kerne i den pågældende region. Vælg en celle eller flere celler, hvis du laver enkeltcellegrupperede prøver. Marker de celler af interesse ved hjælp af LCM software.
- Placer LCM-dækslet oven på udsnittet på det interesseområde.
- Brug testbilleder af en infrarød (IR) laser til at justere IR laserstyrke, størrelse og varighed, så LCM cap klæbemiddel smelter kun over området af den valgte enkelt celle. Dette sikrer, at ingen andre celler indsamles ud over de valgte celler.
BEMÆRK: I dette repræsentative eksperiment blev der anvendt 10 cellepuljer af samme celletype som en enkelt prøve for at begrænse celle-til-celle-variationen i genekspression mellem prøver med samme behandling. Denne metode kan dog bruges til ægte enkeltcelleeksperimenter1,3. - Vælg de enkelte celler, der skal indsamles til analyse ved hjælp af LCM-softwareværktøjerne (Figur 2C). De valgte celler skal være i det anatomiske område af CeA (eller den foretrukne hjerneregion) baseret på rottehjerneatlasset og bregma10. Cellerne skal være mindst 3 μm fra de tilstødende farvede kerner.
- Affyr IR-laseren for at indsamle de identificerede enkelte celler.
- Placer hætten i kvalitetskontrolstationen (QC), og se den for at sikre, at kun de ønskede celler blev valgt. Hvis andre celler fejlagtigt blev valgt, kan en ultraviolet laser bruges til at ødelægge de uønskede celler, mens hætten forbliver i QC-stationen.
- Tag et billede af vævssektionen, hvorfra cellen blev indsamlet for at dokumentere dens anatomiske specificitet. Optag afstanden af skiven fra bregma, hvis det er relevant ved hjælp af en rotte hjerne atlas som en reference10.
- LCM-hætten fjernes fra QC-stationen, prøveudsugningsanordningen fastgøres, og der ses 5,5 μL lysisbuffer på prøveemnet.
BEMÆRK: Lysisbufferopløsningen består af 0,5 μL lysisforstærker og 5 μL resuspensionsbuffer. - EkstracSure-anordningen anbringes på et 0,5 ml mikrocentrifugerør og anbringes på en kogeplade ved 75 °C i 15 min.
- Prøven og lysisbufferen nedsættes i 30 s ved lav hastighed (0,01-0,02 x g) og den opsamlede prøve anbringes i en fryser på -80 °C.
7. Encellet mikrofluidisk RT-qPCR
- Forampificering af enkeltcellemRNA til 96,96 Dynamisk arraychip
- Kombiner de forreste og omvendte mRNA qPCR-genprimere for alle de gener, der assayed i en primer pulje til forampalificering (500 nM koncentration hver primer). F.eks. 1 μL 100 μM primere i 80 μL plus 120 μL DNA-suspensionsbuffer.
BEMÆRK: De primersekvenser, der anvendes til det repræsentative eksperiment, findes i O'Sullivan et al.4. - I en ny 96 x 96 PCR plade tilsættes 1 μL 5x VILO til hver brønd.
- LCM enkeltcelleprøver fjernes fra de prøver, der er lagret ved -80 °C, tø kortvarigt op, centrifuger kortvarigt ved lav hastighed (0,01-0,02 x g) og der tilsættes 5,5 μL af den lysede encellede prøve til PCR-pladen. Hver prøve tilsættes til sin egen brønd.
- PCR-pladen anbringes sammen med prøverne og VILO i termocycleren og opvarmes ved 65 °C i 1,5 min. Pladen drejes i 1 min ved 1.300 x g ved 4 °C, og pladen anbringes på is.
- Der tilsættes 0,15 μL 10x cDNA-syntesemastermix, 0,12 μL T4 Gene 32-protein og 0,73 μL DNA-suspensionsbuffer til hver brønd.
- PCR-pladen anbringes i termocycleren, og følgende protokol køres: 25 °C i 5 min. 50 °C i 30 min. 55 °C i 25 min. 60 °C i 5 min. 70 °C i 10 min. 4 °C for enden.
- Der tilsættes 7,5 μL Taq polymerasemastermix til hver brønd.
- Der tilsættes 1,5 μL af primerpuljen (se ovenfor) til hver brønd.
- PCR-pladen anbringes i termocycleren, og følgende fordannelsesprotokol skal køres: 95 °C i 10 min. efterfulgt af 22 cyklusser på 96 °C i 5 sek.
- Der tilsættes 0,6 μL exonuclease I-reaktionsbuffer 10x, 1,2 μL exonuclease I og 4,2 μL DNA-affjedringsbuffer til hver brønd.
- Pcr-pladen anbringes i termocycleren, og følgende protokol køres: 37 °C i 30 min. 80 °C i 15 min.
- Føj 54 μL TE-buffer til hver brønd. Drej PCR-pladen ved 1.300 x g ved 5 min. Opbevares ved 4 °C, hvis den straks fortsætter til næste trin. Opbevares ved -20 °C, hvis der venter mere end 12 timer til næste trin.
- Kombiner de forreste og omvendte mRNA qPCR-genprimere for alle de gener, der assayed i en primer pulje til forampalificering (500 nM koncentration hver primer). F.eks. 1 μL 100 μM primere i 80 μL plus 120 μL DNA-suspensionsbuffer.
- Klargør prøvepladen til 96.96 Dynamic Array Chip.
- I en ny 96 brønd PCR plade, tilsættes 0,45 μL af 20x DNA bindende farvestof og 4,55 μL lav ROX mastermix til hver brønd.
- Der tilsættes 3 μL forforstærket prøve til hver brønd, drej PCR-pladen ved 1.300 x g,og sæt derefter pladen på is.
- Klargør analysepladen til 96.96 Dynamic Array Chip.
- I en ny 96 brønd PCR plade, tilsættes 3,75 μL 2x GE assay loading reagens og 1,25 μL af DNA suspension buffer til hver brønd.
- Der tilsættes 2,5 μL 10 μM qPCR primer til hver tilsvarende brønd. Drej PCR-pladen ved 1.300 x g i 5 min.
- Indlæs og kør 96,96 Dynamic Array Chip.
- Prime chippen med kontrol linje væske.
- Placer chippen i en IFC Controller HX, og kør Prime-scriptet (136X).
- 6 μL af prøven fra PCR-prøvepladen tilsættes i de tilsvarende prøvebrønde i 96,96 Dynamic Array Chip.
- 6 μL af prøven fra PCR-analysepladen tilsættes i de tilsvarende analysebrønde i 96,96 Dynamic Array Chip.
- Brug nåle til pop eventuelle luftbobler i brøndene af 96,96 Dynamic Array Chip.
- Placer 96.96 Dynamic Array Chip i IFC Controller HX, og kør scriptet Load Mix (136x).
- Fjern chippen fra IFC Controller HX, skræl beskyttelsesmærkaten af, og placer 96,96 Dynamic Array Chip i en mikrofluidisk RT-qPCR-platform. Kør GE Fast 96 x 96 PCR-protokollen (30 cyklusser).
BEMÆRK: RNA-kvaliteten og gyldigheden af resultaterne vurderes ved hjælp af flere metoder, herunder analysevalidering via gelelektroforese, smeltetemperaturkurver, prøve- og analysereplikater og standardfortyndingsserieparceller. Derudover kan transskriptionelle fund valideres ved uafhængige metoder på hjernehemisektion, herunder vestlige blot og immunofluorescensanalyser.
8. Måling af bakterietætheden med mikrofluidic RT-qPCR
- Ekstrakt bakterie-DNA'et efter anvisningerne i afførings-DNA-ekstraktionssættet.
- Anslå den bakterielle DNA-koncentration ved hjælp af qPCR.
- Tilsæt det ekstraherede bakterie-DNA til en ny PCR-plade. Der tilsættes 1 μL ekstraheret bakterie-DNA og 9 μL DNA-suspensionsbuffer.
- Klargør analysepladen til 48,48 Dynamic Array Chip (se trin 7.2.1-7.2.2)
- Prøvepladen klargør til 48,48 Dynamic Array Chip (se trin 7.3.1-7.3.2)
- I en ny 96 brønd PCR plade, tilsættes 0,45 μL af 20x DNA bindende farvestof og 4,55 μL lav ROX mastermix til 48 brønde.
- 3 μL af prøven fra PCR-pladen, der indeholder bakterie-DNA'et, til de 48 brønde, og PCR-pladen nedsættes ved 1.300 x g i 5 min. Opbevares ved 4 °C.
- Indlæs og kør 48,48 Dynamic Array Chip (se trin 7.4.1-7.4.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvælgelsen af enkeltcellerne blev valideret både visuelt og molekylært. Visuelt blev cellulær morfologi set før cellesamling. Indsamlede celler blev derefter set på QC-stationen, og cellekernerpletten (DAPI) overlappede med den enkelte cellemarkeringsmarkør fluorescens. Figur 2A viser repræsentative billeder af et dias med hemisected rotte forhjernen indeholder CeA. Efterfølgende billeder (figur 2B-D) viser udvælgelsen af enkelte celler og deres fjernelse fra vævet til transskriptionsanalyse. Molekylært viste celletypespecifikke markører øget udtryk i den pågældende celletype (figur 1C). Vi kiggede på neuroner, mikroglia, og astrocytter og målte udtryk for NeuN, Maf, og Gfap, henholdsvis. Tallene blev oprindeligt offentliggjort i O'Sullivan et al.4.
Endvidere kan der også anvendes kontroller i den mikrofluidiske platform for at validere ekspressionsresultaterne (f.eks. analyse af andre områder af samme væv for at påvise kernens specificitet). Et separat væv kan også sammenlignes med den ønskede prøve for at påvise primer specificitet i det væv af interesse. Positive og negative kontrolgener kan også medtages (f.eks. gener, der vides enten at være fraværende fra det valgte væv eller udtrykt højt). Tre eller fire rengøringsgener bør også medtages ikke kun med henblik på datanormalisering, men også som et mål for eksperimentel kvalitet. Disse gener bør påvise den laveste varians i udtryk på tværs af alle prøver og behandlinger. I dette repræsentative eksperiment blev ingen alternativ hjerneregion assayed, men husholdning gener Ldha og Actb blev brugt til normalisering. Gapdh blev brugt som en intern kontrol.
Figur 3 viser nogle af de multivariate metoder vores gruppe bruges til at analysere vores data. Vi fandt ud af, at astrocytter i udbetalingsgruppen var den mest berørte celletype. Baseret på disse data i forbindelse med andre undersøgelser spekulerer vi, at astrocytter spiller en central rolle i inflammation i CeA under opioid tilbagetrækning, og at dette bidrager til de fysiske og følelsesmæssige symptomer, der driver narkotika-søger via negativ forstærkning. Vi viser også data om tarmmikrofloraen (figur 4).
Figur 1: RT-qPCR-arbejdsgang med en enkelt celle og transskriptionsheterogenitet. (A) Eksperimentel protokol (n = 4 for hver betingelse) (B) Måling af ticellede grupperet prøvetranskriptom. (C) Søjleplot viser median -ΔΔCt-udtryksværdier. Neuroner = lilla; microglia = gul; astrocytter = grøn. Fejllinjer viser standardfejl. *p < 0,05, ***p < 0,0003; Tukey's ærlige betydning test. (D) Varmekortet viser ekspressionen af alle prøver på tværs af 40 analysegener. Rækker er 10-cellede poolede prøver (930 neuronale prøver, 950 mikrogliale prøver, 840 astrocytprøver som angivet); tallene angiver prøveklyngerne, og kolonnerne er generne. Tallet er ændret fra O'Sullivan et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Laseroptagelse af mikrodissektionsbilleder. (A) Fire skiver dehydreret hemisected rotte forhjernen indeholder CeA på et dias. Skiver blev placeret på diaset præcis 10 μm fra den foregående skive. Venstre er anterior og højre er posteriort. Afstanden fra bregma kan estimeres ved hjælp af en rotte hjerne atlas og vartegn, herunder den optiske tarmkanalen og stria terminalis. (B-D) Sekvens af billeder, der viser udvælgelsen af enkelte celler i CeA (C) og deres fjernelse fra vævet (D). Der blev brugt flere LCM-hætter til at markere disse celler. En hætte bruges til at plukke 10 celler af en celletype. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater 1. (A) En tegneserie skematisk af en celle, der viser de gener, der er assayed og deres placering. De gensymboler, der er mærket her, er en reference for panel B. (B) De farvede firkanter repræsenterer relativ genekspression (median -ΔΔCt-værdi) for de gener, der er repræsenteret i panel A. Placeringen af kvadraterne repræsenterer cellulær lokalisering eller funktion af det tilsvarende protein. Panelerne viser det relative genudtryk, der repræsenteres af farve på tværs af behandlinger og celletyper. Gul = højt udtryk; blå = lavt udtryk; hvid = neutralt udtryk. Tallet er ændret fra O'Sullivan et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater 2. (A) Netværk for genkorrelations. Pearson korrelation blev udført på -ΔΔCt værdier inden for en behandling og celletype. Noderne angiver generne, og deres farve angiver de relative udtryksniveauer (median -ΔΔCt-værdien for hvert gen). Kanterne angiver udtrykskorrelationer, og tykkelsen angiver styrken af udtrykskorrelationen (ρ). Korrelationer med en q-værdi <0.001 vises. Sorte kanter = positive korrelationer; grønne kanter = negative korrelationer. (B) Bar parceller af udvalgte gener, der viser signifikant differentiale genekspression. Statistikken blev beregnet ved hjælp af indlejrede ANOVA #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001 (n = 4 dyr til alle behandlinger). Tallet er ændret fra O'Sullivan et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Relativ overflod af tarmmikroflora. Barparcellerne viser den relative tæthed af bakteriearter (-ΔΔCt-værdier). #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,008, ***p = 0,0009; tovejs ANOVA; n = 4 dyr til hver behandling. Tallet er ændret fra O'Sullivan et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encellebiologi har vist heterogeniteten af cellulære fænotyper og robustheden af vævsfunktionen. Disse resultater har givet indsigt i organiseringen af biologiske systemer på både makro- og mikroskala. Her beskriver vi kombinationen af to metoder, LCM og mikrofluidic qPCR, for at opnå encellede transkriptionom foranstaltninger, der giver anatomisk specificitet og transskriptionelle nøjagtighed til en relativt lav pris (Figur 1). Vores gruppe tager en systembiologi tilgang og ofte måler flere væv i samme dyr. Vi finder disse metoder at være både fleksible og frugtbare med hensyn til at bestemme, hvordan biologiske systemer reagerer på forskellige udfordringer på transskriptionsniveau. Derudover bruger vi disse metoder i den anatomiske kortlægning af cellulære fænotyper i baseline betingelser.
Vi leverer data og modificerede tal fra en nylig publikation, der undersøger, hvordan CeA reagerer på opioidafhængighed og tilbagetrækning4. I dette eksempel brugte vi den samme mikrofluidiske qPCR-platform til at måle tarmmikrofloraens relative tæthed. Metoderne og arbejdsgangen er sammenfattet i figur 1 og blev oprindeligt udgivet i O'Sullivan et al.4. Større fund fra mikrofluidic RT-qPCR med høj gennemløb kan efterfølgende valideres ved hjælp af proteinforanstaltninger såsom western blot eller immunofluorescens4.
En stor udfordring ved denne systembiologi tilgang er at bestemme specifikke kausal biologiske mekanismer. Fuzzy logik er en valideret løsning, som vi har ansat med succes at udlede agenter i genregulerende netværk adfærd2. Dyremodelmanipulation kan også anvendes til at give indsigt i systemiske mekanismer. For eksempel, den samme protokol heri med tilføjelse af en rotte kohorte med en gastrisk vagotomy vil give data, der giver indsigt i strømmen af oplysninger via vagus nerve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har modstridende finansielle interesser.
Acknowledgments
Det arbejde, der præsenteres her, blev finansieret gennem NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, og T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO'S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
