Summary
In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.
Abstract
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.
Introduction
Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.
In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nierenkapsel, Milz, intramuskuläre Region, subkutaner Raum, Knochenmark und Omentalbeutel für experimentelle IsletTransplantation5,6,7untersucht. Einige der oben genannten Seiten wurden in klinischen Einstellungen getestet8. Obwohl die Letentransplantation in die Leber die am weitesten verbreitete Methode in der klinischen Anwendung derzeit9bleibt, gibt es mehrere wichtige Probleme bei der Verwendung dieser Website zu beheben. Zum Beispiel, wie man den frühen Verlust der transplantierten Inselchen durch die sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) und schlechte Sauerstoffversorgung10,11 und wie man die Insel transplantiert, wenn nötig, zu reduzieren, weil sie diffus in der Leber lokalisieren. Die Nierenkapsel kann ein idealer Ort für Nagetier-Empfänger sein. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender allogener Inselchen beim Menschen, obwohl sie aufgrund der hochgereinigten Poreninselpräparate, die klinisch verwendet werden, besser für die Inselxenotransplantation geeignet seinkann. Daher ist die Suche nach einem geeigneteren Standort für die Letentransplantation im Gange.
Der subkutane Raum kann aufgrund seiner Zugänglichkeit als klinisch anwendbarer Standort für die Letentransplantation genutzt werden. Allerdings ist die Effizienz der Inseltransplantation in den subkutanen Raum extrem gering, so dass eine relativ große Anzahl von Inselchen erforderlich ist, um Hyperglykämie umzukehren13. Kürzlich fand ein japanisches Forscherteam die ISWAT, eine neuartige subkutane Stelle, die für die Letentransplantation in einem murinen Modell im Vergleich zur Leber14überlegen ist. Die ISWAT enthält die epigastrische Arterie und Vene, so dass die reiche Blutversorgung kann Islet Transplantat Revaskularisation gewährleisten. In diesem Manuskript schlagen wir eine einfache Implantationsmethode mit einem Kellermembran-Matrix-Hydrogel vor, um syngene murinische Inselchen im ISWAT zu fixieren. Dieses Protokoll erweist sich als wirksam für die Letentransplantation.
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Protocol
Alle Verfahren in diesem Protokoll folgten den Grundsätzen des Tierschutzes der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital. Islet-Transplantat-Empfänger und Spender waren 8- bis 10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse, die vom Medical Animal Center der Provinz Guangdong gekauft wurden. Das Verfahren der Ernte, Isolierung, Kultur oder Verabreichung der geernteten Zellen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
1. Inselvorbereitung
- Bereiten Sie eine Kollagenase Typ V Arbeitslösung vor. Kollagennase Typ V wiegen und mit d-Hank-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen, mit einer spritzengetriebenen Filtereinheit von 0,22 m und einer 60 ml Spritze filtern und in Eis vorkühlen. Für jeden Spender ist ein Volumen von 5 ml erforderlich.
- Eine 10 Wochen alte C57BL/6-Maus (23 x 2 g) durch Zervixdislokation einschläfern und den äußeren Teil der Maus mit 75% Ethanol für einige Sekunden besprühen. In der Zwischenzeit eine 5 ml Spritze mit Kollagenaselösung füllen und die Spritzennadel mit einer biegsamen stumpfspitzen Perfusionsnadel (32 G) wechseln.
- Setzen Sie die Spendermaus in die Rückenlage auf einen Eisbeutel unter dem Sezieren, schneiden Sie eine Queröffnung mit geraden, gerichteten Augenscheren in die Haut des Schambereichs und schneiden Sie die Haut vollständig in Richtung des Kopfes. Dann den Bauch über einen V-Schnitt aus der Schamregion zum xiphoiden Prozess komplett öffnen.
- Setzen Sie die Gallenblase und die gesamte Länge des gemeinsamen Gallengangs durch Neupositionierung der Leber aus. Dann die Zwölffingerdarmöffnung des gemeinsamen Gallengangs mit einer Gefäßklemme einklemmen und eine kleine Öffnung in der Gallenblase schneiden.
HINWEIS: Optimale Nadelplatzierung ist wichtig, um Rückfluss in die Leber und Gallenblase zu verhindern. - Den gemeinsamen Gallengang aus der Gallenblasenöffnung mit der Perfusionsnadel in Schritt 1.2 zu keimen, dann 2 ml Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse injizieren. Danach trennen Sie die durchnässte Bauchspeicheldrüse mit zwei Paaren nichtinvasiver Mikropinezer von Darm, Magen und Milz und legen Sie sie in eine 50 ml kegelförmige Röhre auf Eis.
HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang für alle Spendermäuse. Drei aufeinander folgende durchlässige Bauchspeicheldrüsen (nicht mehr als 40 min voneinander entfernt) können zu einem 50 ml konischen Rohr kombiniert werden, das mit 3 ml Kollagennaselösung für jede Bauchspeicheldrüse vorgefüllt wird. - Fügen Sie 100 l DNase I (10 mg/ml) pro Bauchspeicheldrüse in die 50 ml konischen Röhren und verdauen Sie die Bauchspeicheldrüse in einem Wasserbad bei 37 °C, indem Sie die konischen Röhren 3–5 min schütteln.
HINWEIS: Schütteln Sie die Schläuche in 10 s Intervallen kräftig 40x, um das Gewebe vor der Verdauung im Wasserbad zu trennen, und schütteln Sie die Schläuche dann während der Verdauung mäßig. - Stop-Lösung (2,5 mg/ml BSA-HBSS-Lösung) bis zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen, um die Verdauung zu blockieren, und Pulszentrifugieren Sie die Rohre auf eine Geschwindigkeit von 750 x g bei 4 °C und stoppen Sie schnell.
- Den Überstand abgießen und die Pellets 2x waschen, indem man in 15–25 ml BSA-HBSS sanft wieder aufhält. Pulszentrifugieren Sie das Rohr mit den gleichen Geschwindigkeitsbedingungen wie in Schritt 1.7 für 1 min beschrieben.
- Gießen Sie den Überstand ab und bündeln Sie die Pellets der drei konischen Rohre in ein 50 ml konisches Rohr. Setzen Sie die Pellets in einem Gesamtvolumen von 10 ml Histopaque-1119 wieder aus. Homogen mischen und sequenziell 5 ml Histopaque-1077 und 5 ml HBSS durch langsames Pipetieren entlang der Seite des Rohres hinzufügen.
- Drehen Sie die Proben in der Zentrifuge bei 750 x g bei 4 °C 10 min ohne Bremsen.
- Die Inselchen von der HBSS/histopaque-1077-Schnittstelle in ein 50 ml konisches Rohr mit einer Einweg-5-ml-Pasteur-Pipette aspirieren, BSA-HBSS zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen und Pulszentrifuge bei 750 x g bei 4 °C.
- Den Überstand abgießen und die Inselchen mit 30 ml BSA-HBSS waschen. Zentrifuge für 1 min bei 750 x g bei 4 °C.
- Die Inselchen mit 30 ml Kulturmedium (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) pro Rohr aussetzen und in eine lichtdichte Kulturschale mit 10 cm Durchmesser gießen. Unter einem Stereomikroskop, mit 200 L Gel-Laden Pipetspitzen, handpicken Sie die Inselchen aus der Lösung auf der Grundlage ihrer Morphologie (d. h. sphäroidal, weiß). In ein unbehandeltes Zellkulturgericht mit 10 ml Kulturmedium.
HINWEIS: Eine Sekundenhandpicking kann durchgeführt werden, wenn die Reinheit der erstgereinigten Inselchen nach der ersten Kommissionierung nicht optimal ist. - Überprüfen Sie die Reinheit der handverlesenen Inseln durch Dithionfärbung unter einem Lichtmikroskop und erkennen Sie die Lebensfähigkeit von Inseln durch Fluorescein-Diacetat (FDA)-Propidiumiodid (PI) Färbung unter einem Fluoreszenzmikroskop.
- Kultur die isolierten Inselchen im Kulturmedium (wie in Schritt 1.13) in einem Inkubator bei 37 °C, 95% Luft-5%CO2 vor der Transplantation.
2. ISWAT-Islet-Transplantation
- Induzieren Sie Diabetes bei den 8 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen (22 x 2 g) durch eine einmalige Injektion von Streptozotocin (STZ). Am Tag -4 die Mäuse für 4–6 h schnell und bereiten Sie dann eine 2% STZ-Lösung mit 0,1 M Citratpuffer (pH 4,4) vor. Wiegen, im Puffer wieder aussetzen und die Mäuse intraperitoneal in einer Dosis von 180 mg/kg injizieren.
HINWEIS: Die STZ-Lösung muss vor dem Gebrauch frisch zubereitet und aufgrund ihrer Lichtempfindlichkeit mit Aluminiumfolie überzogen werden. Es sollte sofort verwendet werden, da es aktivität innerhalb von 15-20 min verliert. - Punktieren Sie die kaudalen Venen der STZ-injizierten Mäuse, um etwas Blut um etwa 10 Uhr tag-1 und Tag 0 zu sammeln und den nicht fastenden Blutzuckerspiegel mit einem Teststreifen und einem grundlegenden Blutzuckermessgerät zu messen. Die Mäuse werden als Empfänger der Letzentransplantation verwendet, wenn der Blutzuckerspiegel der beiden aufeinanderfolgenden Testtage beides mindestens 20 mmol/L beträgt.
- Wiegen und markieren Sie am 0. Tag alle Empfängermäuse. Anästhetisieren Sie jeden Empfänger durch Injektion von 60 mg/kg Pentobarbital-Natrium intraperitoneal.
HINWEIS: Verabreichen Sie eine Zehenprise, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen. Wenn die Empfängermaus keinen Entzugsreflex hat, reicht das Niveau der Anästhesie für eine Operation aus. Ist dies nicht der Fall, verabreichen Sie zusätzlich 10 mg/kg Pentobarbital-Natrium. Das verwendete Pentobarbital-Natrium wurde in steriler physiologischer Saline in der Konzentration von 2% (m/v) verdünnt. - Nehmen Sie das Hydrogel aus einem -20 °C Gefrierschrank und halten Sie es auf Eis, um das Auftauen zu ermöglichen. Das Hydrogel ist bei 4–10 °C flüssig und erstarrt bei einer höheren Temperatur.
- Wählen Sie für jeden Empfänger 450–500 Islet-Äquivalente (IEQ) in ein steriles 1,5 ml Zentrifugenrohr unter dem Stereomikroskop (wie in Schritt 1.13) mit 200 L Kulturmedium und halten Sie auf Eis, bis es für die Transplantation bereit ist.
- Wischen Sie den linken Leistenbereich des Empfängers mit 75% Ethanol ab. Legen Sie es in die Supine-Position und fixieren Sie die vier Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband. Rasieren Sie die Haare um die chirurgische Stelle mit elektrischen Clippern ab und wischen Sie den Bereich mit Iodophor ab.
- Machen Sie einen vertikalen Hautschnitt in diesem Bereich mit der Ophthalmschere und nichtinvasiven Mikropinezer, identifizieren Sie die minderwertige epigastrische Arterie und Vene im ISWAT und erstellen Sie eine kleine Tasche über den Gefäßen.
- Drehen Sie das Inselrohr für 30 s bei 200 x g und entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich. 20 L vollständig aufgetautes Hydrogel ansaugen und mit den Inselchen in das Rohr laden. Setzen Sie die Inselchen vorsichtig aus, um Blasen zu vermeiden.
- Liefern Sie das gesamte Islet-Hydrogel-Gemisch im Rohr mit einer 200-L-Pipettenspitze in die Tasche (Schritt 2.7) des Empfängers.
HINWEIS: Bei diesem Prozess sind zwei Techniker erforderlich, einer zum Aufheben der Ränder der Tasche mit nichtinvasiven Mikrowirbelzern und der andere für die Lieferung der Isletmischung in die Tasche. - Fügen Sie 20 l Cephalosporin (ca. 5–10 mg) in die Transplantationsstelle ein, nachdem das Insel-Hydrogel-Gemisch vollständig erstarrt ist, und verwenden Sie dann eine 5-0 chirurgische Naht, um den Muskel und die Haut mit der kontinuierlichen Nahtmethode zu schließen.
HINWEIS: Das Hydrogel benötigt ca. 3 min, um sich aufgrund der Körpertemperatur zu erstarren. - Legen Sie den Empfänger in einen sauberen Käfig und halten Sie sich mit einem Thermopad warm. Halten Sie die Überwachung aufrecht, bis sich der Empfänger vollständig erholt und beginnt, sich autonom zu bewegen. Dann verabreichen 0,03 mg/ml Buprenorphin mit steriler physiologischer Salzmittel intraperitoneal, nach 0,1 mg/kg Dosis.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.11 für jede Empfängermaus.
- Messen Sie den nicht fastenden Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse (wie in Schritt 2.2) 3–4x pro Woche für den ersten Monat und 1x pro Woche danach.
- Am Ende der Nachbeobachtung (100 Tage nach der Transplantation) wird unter Anästhesie (durchgeführt wie in Schritt 2.3) die ISWAT, die das Transplantat von den Empfängern trägt, nach den in Schritt 2.6 beschriebenen sterilen Schritten verbrauchen. Fixieren Sie das Gewebe in Formalin und Paraformaldehyd gemäß den histologischen Protokollen für Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung und Immunfluoreszenz von Insulin und Glucagon.
- Cephalosporin hinzufügen und den Schnitt der Empfänger wie in Schritt 2.10 schließen, dann wie in Schritt 2.11 auf die Genesung vorbereiten.
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Representative Results
In diesem Protokoll werden zwei Verfahren eingeführt: die Präparation von murinen Inselen und die Inseltransplantation in den ISWAT-Standort. Im ersten Verfahren, nach durchdringenden und verdauenmit Mit Typ V Kollagenase-Lösung, Reinigung mit Histopaque-1119 und Histopaque-1077 und einem zusätzlichen Hand-Picking-Schritt, werden die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation sein (wie in Abbildung 1gezeigt ) und die isolierten Inselchen, die eine hohe Lebensfähigkeit haben, werden für die Transplantation verwendet (siehe Abbildung 2). Im zweiten Verfahren ist die Diabetesinduktion mit STZ-Chemikalie entscheidend. Die optimale Dosis von STZ hängt von der Belastung der Maus und dem Alter ab, und die erfolgreiche Induktion von Diabetes wird durch nicht schnelle Blutzuckerwerte von mehr als 16,7 mmol/L gleichzeitig an zwei aufeinanderfolgenden Tagen definiert. Die diabetischen Mäuse können ohne Letentransplantation für einige Wochen überleben. Die Islettransplantate sollten vor der Transplantation in die ISWAT-Site vollständig mit Hydrogel gemischt werden, und es müssen einige Minuten vergehen, damit die Transplantate in die IWSAT(Abbildung 3)fixiert werden können. Bei der Transplantation in die ISWAT kehrten die Islettransplantate die Hyperglykämie für etwa einen Monat um, und das Körpergewicht der Empfängermäuse nahm allmählich zu (Abbildung 4). 100 Tage nach der Transplantation wurden die Islettransplantate zur histologischen Analyse entnommen (Abbildung 5). Wie in Abbildung 4dargestellt, stieg das nicht fastende Blut um 10 Uhr an den Testtagen schnell an, nachdem die Transplantate entfernt wurden. Die H&E-Färbung zeigte, dass die Islettransplantate intakt blieben. Insulin- und Glucagon-Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die transplantierten Inselchen gut funktionierten (Abbildung 5).
Abbildung 1: Pankreasperfusion und Verdauung und Isletreinigung. (A) Der Prozess der Pankreasperfusion (A1–A6). (B) Der Endpunkt der Pankreasverdauung, wobei die Partikel suspendiert sind. (C) Gereinigte Inselchen, die unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Reinheit und Lebensfähigkeit gereinigter Inselchen. (A) Isletreinheit durch Dithionfärbung bestimmt. Islet-Lebensfähigkeit durch FDA-PI Doppelfärbung bewertet. (B) Lichtmikroskopie Bild von Inselchen. (C) FDA Färbung zeigt lebensfähige Zellen in grün. (D) PI Fluoreszenzrot zeigt abgestorbene Zellen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Islet-Transplantation. (A) Nach Narkose rasieren Sie die Haare an der Transplantationsstelle mit einer Rasierklinge und fixieren Sie die Gliedmaßen des Empfängers in der abdominalen Aufwärtsposition mit chirurgischem Klebeband. (B) Nach der Laparotomie ist die ISWAT-Transplantationsstelle exponiert. (C) Mit Hydrogel gemischte Inseln werden langsam in den ISWAT-Standort transplantiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Blutzuckerspiegel und Körpergewicht nach der Transplantation. Nicht fastende Blutzuckerwerte (rote Linie) und Körpergewichte (blaue Linie) der mit syngenischen Inseln transplantierten Mäuse (n = 7). Der schwarze Pfeil zeigt an, dass die Transplantate 100 Tage nach der Transplantation entfernt wurden. Einige Schwankungen des Blutzuckerspiegels im Vergleich der verschiedenen Empfänger wurden beobachtet, was Unterschiede in der Qualität und Funktion der Ischen widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Histologie und Immunfluoreszenz. Graft-Abschnitte wurden mit H&E, DAPI (Kernen), Anti-Maus-Insulin-Antikörpern und Anti-Maus-Glucagon-Antikörpern gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfristiges Überleben der Islettransplantate15,16.
Unser Team hat zuvor ein Protokoll zur Letentransplantation im Omentum in einem murinen Modell17beschrieben. Im Omentum wurde zu einem späteren Zeitpunkt ein normaler Blutzuckerimz im Vergleich zur Islettransplantation unter der Nierenkapsel erreicht. Daraufhin wurden weitere Standorte für die Implantation von Inseln erkundet.
Die ISWAT wurde als alternative Stelle zur Leber berichtet, da sie weniger Inselchen benötigt, um die Hyperglykämie der Empfänger im Vergleich zur Transplantation an der Leberumzukehren 14. Darüber hinaus ist die Transplantation der Inseln einfach, ebenso wie das Visualisieren und Abrufen der Transplantate14. In unserer Studie haben Empfängermäuse die Hyperglykämie innerhalb eines Monats nach der Islet-Transplantation reduziert, was darauf hindeutet, dass die ISWAT länger als die Nierenkapsel benötigt, um ausreichend Insulin zu produzieren. Diese Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass die ISWAT-Site möglicherweise keine besseren Bedingungen für die Diffusion von Sauerstoff, Nährstoffen und für die Revaskularisation des Transplantats bietet.
Hohe Reinheit und Aktivität von isolierten Inseln sind von entscheidender Bedeutung, um Hyperglykämie von diabetischen Empfängern in der Allo-Islet-Transplantation Einstellung umzukehren, und Insel isolierung Protokolle sind nicht die gleichen unter verschiedenenForschern 18,19,20. Die Verdauungszeit ist sehr wichtig für die Erlangung hochwertiger Inselchen. Nach unserer Erfahrung sollte es 5 min nicht überschreiten. Isolierte Inselchen können in einem 37 °C Inkubator über Nacht kultiviert werden, um eine Erholung von der mechanischen Belastung des Verdauungsverfahrens zu ermöglichen21.
Das hier verwendete Hydrogel ist eine Kellermembranmatrix, die Laminin, Kollagen IV und Wachstumsfaktoren17enthält. Es verfestigt sich, wenn es Körpertemperatur erreicht und hilft, die Islet-Transplantate in der ISWAT-Site zu halten. Obwohl es für die Inseln nicht toxisch ist, bleibt zu bestimmen, ob das Vorhandensein des Hydrogels die Inselverordnung und Funktion beeinflusst.
Zusammengenommen ist die ISWAT ein neuartiger subkutaner Raum für die Letentransplantation in Nagetiermodellen und möglicherweise für den klinischen Einsatz. Für die vollständige Auswertung sind zusätzliche Studien mit größeren präklinischen Säugetiermodellen erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
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