Summary
Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.
Abstract
O transplante de lélete pancreática é um tratamento terapêutico bem estabelecido para diabetes tipo 1. A cápsula renal é o local mais usado para transplante de ilhotas em modelos de roedores. No entanto, a cápsula renal apertada limita o transplante de ilhotas suficientes em animais de grande porte e humanos. O tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT), um novo espaço subcutâneo, foi encontrado como um local potencialmente valioso para o transplante de lélete. Este local tem melhor suprimento de sangue do que outros espaços subcutâneos. Além disso, a ISWAT acomoda uma massa de ilhota maior que a cápsula renal, e o transplante nela é simples. Este manuscrito descreve o procedimento de isolamento e transplante de lélete de camundongos no local da ISWAT de receptores de camundongos diabéticos sinódicos. Usando este protocolo, ilhotas pancreáticas de murina foram isoladas pela digestão colagenase padrão e um hidrogel de matriz de membrana do porão foi usado para fixar as ilhotas purificadas no local da ISWAT. Os níveis de glicose no sangue dos camundongos receptores foram monitorados por mais de 100 dias. Enxertos de lélete foram recuperados no dia 100 após transplante para análise histológica. O protocolo para transplante de lélete no site da ISWAT descrito neste manuscrito é simples e eficaz.
Introduction
A incidência mundial e a prevalência de diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) estão aumentando rapidamente, de acordo com os dados estatísticos da Federação Internacional de Diabetes (IDF)1. O transplante de lélete é uma das abordagens mais promissoras para o tratamento do T1DM4. Uma vez que o grande avanço feito no transplante de lélete clínica usando o protocolo Edmonton2 foi relatado, a sobrevivência do enxerto de islet em funcionamento em receptores T1DM depois de 5 anos agora atinge cerca de 50%3.
No passado, foram explorados vários locais de transplante, como fígado, cápsula renal, baço, região intramuscular, espaço subcutâneo,medula óssea e bolsa omental5,6,7. Alguns dos locais acima foram testados em configurações clínicas8. Embora o transplante de lita no fígado continue sendo o método mais utilizado na aplicação clínica atualmente9,há vários problemas importantes a serem enfrentados ao usar este local. Por exemplo, como reduzir a perda precoce das léletas transplantadas causadas pela reação inflamatória mediada pelo sangue instantâneo (IBMIR) e pelo suprimento de oxigenação ruim10,11 e como recuperar os enxertos de luma, se necessário, porque eles se localizam difusamente no fígado. A cápsula renal pode ser o local ideal para os receptores de roedores. No entanto, a cápsula renal apertada limita o transplante de ilhotas alogênicas suficientes em humanos, embora possa ser um ajuste melhor para o xenotransplante ilhota devido aos preparos altamente purificados da ilhota suína utilizadas clinicamente5,12. Portanto, a busca por um local mais adequado para transplante de lélete está em andamento.
O espaço subcutâneo pode ser usado como local clinicamente aplicável para transplante de ilhotas devido à sua acessibilidade. No entanto, a eficiência do transplante de islet no espaço subcutâneo é extremamente baixa, exigindo assim um número relativamente grande de lésitas para reverter a hiperglicemia13. Recentemente, uma equipe de pesquisa japonesa encontrou o ISWAT, um novo local subcutâneo superior ao transplante de islet em um modelo de murina quando comparado com o fígado14. A ISWAT contém a artéria etiátrica e veia, de modo que o rico suprimento de sangue pode garantir a revascularização do enxerto de ilhota. Neste manuscrito, propomos um método fácil de implantação usando um hidrogel de matriz de membrana do porão para corrigir ishotas singeneic murina na ISWAT. Este protocolo se mostra eficaz para transplante de lélete.
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Protocol
Todos os procedimentos neste protocolo seguiram os princípios do bem-estar animal do Comitê de Revisão ética do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Os receptores e doadores de enxerto de islet eram de 8 a 10 semanas de idade C57BL/6 camundongos machos comprados do Centro Médico animal da província de Guangdong. O procedimento da colheita, isolamento, cultura ou administração das células colhidas foi realizado em condições assépticas.
1. Preparação de islet
- Prepare uma solução de trabalho cologenês Tipo V. Pesar colagenase Tipo V e dissolver com o tampão de D-Hank para uma concentração final de 1 mg/mL, filtro usando uma unidade de filtro de 0,22 μm e uma seringa de 60 mL e pré-cool no gelo. É necessário um volume de 5 mL para cada receptor doador.
- Eutanize um mouse macho C57BL/6 de 10 semanas de idade (23 ± 2 g) por luxação cervical e pulverize a parte externa do camundongo com 75% de etanol por alguns segundos. Enquanto isso, encha uma seringa de 5 mL com solução colagenase e troque a agulha de seringa com uma agulha de perfusão de ponta sem corte (32 G).
- Coloque o rato doador na posição supina em um saco de gelo o escopo dissecando, corte uma abertura transversa usando tesoura sontalmica na pele da área púbica, e incifique completamente a pele em direção à cabeça. Em seguida, abra completamente o abdômen através de um V-incision da região púbica para o processo xiforóide.
- Exponha a vesícula biliar e todo o comprimento do ducto biliar comum reposicionando o fígado. Em seguida, aperte a abertura duodenal do ducto biliar comum com um grampo vascular e corte uma pequena abertura na vesícula biliar.
NOTA: A colocação ideal da agulha é importante para evitar o fluxo de costas no fígado e na vesícula biliar. - Cannular o ducto biliar comum da abertura da vesícula biliar usando a agulha de perfusão na etapa 1.2, em seguida, injetar ~2 mL de solução colagenase no pâncreas. Depois disso, separe o pâncreas perfundido dos intestinos, estômago e baço usando dois pares de microtweezers não invasivos, e coloque-o em um tubo cônico de 50 mL no gelo.
NOTA: Repita o processo para todos os ratos doadores. Três pancreases consecutivomente perfundidos (não mais de 40 min de distância) podem ser combinados em um tubo cônico de 50 mL pré-preenchido com 3 mL de solução colagenase para cada pâncreas. - Adicione 100 μL DNase I (10 mg/mL) por pâncreas nos tubos cônicos de 50 mL, e digerir os pancreases em um banho de água a 37 °C sacudindo os tubos cônicos por 3-5 min.
NOTA: Agite os tubos vigorosamente 40x em intervalos de 10 s para desassociar o tecido antes da digestão no banho de água e, em seguida, sacudir moderadamente os tubos durante a digestão. - Adicione solução de pare (solução BSA-HBSS de 2,5 mg/mL) até um volume final de 50 mL para bloquear a digestão, e o pulso centrífuga dos tubos a uma velocidade de 750 x g a 4 °C e parar rapidamente.
- Despeje o supernatante e lave as pelotas 2x, resuspendendo suavemente em 15-25 mL de BSA-HBSS. O pulso centrífuga do tubo com as mesmas condições de velocidade descritas na etapa 1.7 por 1 min.
- Despeje o supernatant e acumule as pelotas dos três tubos cônicos em um tubo cônico de 50 mL. Resuspender as pelotas em um volume total de 10 mL de histopaque-1119. Misture de forma homogênea, e adicione sequencialmente 5 mL de histopaque-1077 e 5 mL de HBSS, canalizando lentamente ao longo da lateral do tubo.
- Gire as amostras na centrífuga a 750 x g a 4 °C por 10 min sem freios.
- Aspirar as isletas da interface HBSS/histopaque-1077 em um tubo cônico de 50 mL usando uma pipeta pasteur descartável de 5 mL, adicionar BSA-HBSS a um volume final de 50 mL, e centrífuga de pulso a 750 x g a 4 °C.
- Despeje o supernatante e lave as ilhotas usando 30 mL de BSA-HBSS. Centrífuga por 1 min a 750 x g a 4 °C.
- Resuspenda as léletas usando 30 mL de cultura média (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) por tubo e despeje em um prato de cultura leve de 10 cm de diâmetro. um estereótipo, usando 200 μL dicas de tubulação de carregamento de gel, escolha a dedo as isletas da solução com base em sua morfologia (ou seja, esferoidal, branco). Coloque em um prato de cultura celular não tratado com 10 mL de meio cultural.
NOTA: Uma segunda escolha de mão pode ser realizada se a pureza das léletas purificadas não for ótima após a primeira escolha. - Verifique a pureza das léletas escolhidas a dedo pela coloração de dithizone um microscópio leve e detecte a viabilidade das léletas por dicetato de fluoresceína (FDA)-propidium iodide (PI) manchando um microscópio fluorescente.
- Cultura as lilhas isoladas no meio da cultura (como na etapa 1,13) em uma incubadora a 37 °C, 95% ar-5% CO2 antes do transplante.
2. Transplante de islet iswat
- Induzir diabetes nos camundongos C57BL/6 masculinos de 8 semanas (22 ± 2 g) por uma única injeção de estreptozotocina (STZ). No dia -4, acelere os ratos por ~4-6 h, e prepare uma solução STZ de 2% usando buffer de citrato de 0,1 M (pH 4.4). Pesar, resuspender no buffer e injetar os ratos intraperitoneticamente em uma dose de 180 mg/kg.
NOTA: A solução STZ precisa ser recém-preparada antes do uso e coberta com papel alumínio devido à sua sensibilidade à luz. Ele deve ser usado imediatamente, porque perderá atividade dentro de 15-20 min. - Puna as veias caudais dos camundongos injetados no STZ para coletar sangue por volta das 10:00 do dia -1 e dia 0 e medir o nível de glicose no sangue não-emjejum usando uma tira de teste e um instrumento básico de monitoramento de glicose no sangue. Os camundongos serão usados como receptores de transplante de lélete se os níveis de glicemia dos 2 dias de teste consecutivos forem ambos pelo menos 20 mmol/L.
- No dia 0, pese e marque todos os ratos receptores. Anestesiar cada receptor injetando 60 mg/kg de sódio pentobarbital intraperitoneal.
NOTA: Ame uma pitada de dedo do pé para verificar a profundidade da anestesia. Se o rato receptor não tiver reflexo de retirada, o nível de anestesia é suficiente para cirurgia. Se não, administre mais 10 mg/kg de sódio pentobarbital adicional. O sódio pentobarbital utilizado foi diluído em soro fisiológico estéril na concentração de 2% (m/v). - Retire o hidrogel de um freezer de -20 °C e mantenha-o no gelo para permitir o descongelamento. O hidrogel é líquido de 4 a 10 °C e se solidificará a uma temperatura mais alta.
- Escolha ~450-500 equivalentes de islet (IEQ) para cada receptor em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL o estereomicroscópio (como na etapa 1.13) com 200 μL de meio cultural e mantenha no gelo até estar pronto para transplante.
- Cotonete a área inguinal esquerda do destinatário utilizando 75% de etanol. Coloque-o na posição supina e fixe os quatro membros usando fita cirúrgica. Raspe o cabelo ao redor do local cirúrgico com cortadores elétricos e cotonete a área com Iodophor.
- Faça uma incisão vertical da pele nesta área usando a tesoura oftálmica e microtweezers não invasivos, identifique a artéria e veia epigátricas inferiores na ISWAT, e crie um pequeno bolso acima dos vasos.
- Gire o tubo das ilhotas por 30 s a 200 x g e remova o supernatant o máximo possível. Aspirar 20 μL de hidrogel completamente descongelado e carregá-lo no tubo com as líletas. Resuspenda as léletas suavemente, evitando bolhas.
- Entregue toda a mistura de islet-hidrogel no tubo no bolso (passo 2.7) do receptor com uma ponta de tubulata de 200 μL.
NOTA: Este processo requer dois técnicos, um para pegar as bordas do bolso usando microtweezers não invasivos, e o outro para entregar a mistura de islet no bolso. - Adicione 20 μL de cefalosporina (~5-10 mg) no local do transplante depois que a mistura islets-hidrogel é completamente solidificada, em seguida, use uma sutura cirúrgica 5-0 para fechar o músculo e a pele com o método de sutura contínua.
NOTA: O hidrogel precisa de cerca de 3 min para solidificar devido à temperatura corporal. - Coloque o destinatário em uma gaiola limpa e mantenha-se aquecido usando uma almofada térmica. Mantenha o monitoramento até que o destinatário se recupere totalmente e comece a se mover de forma autônoma. Em seguida, ame em 0,03 mg/ml Buprenorfina com soro fisiológico estéril intraperitoneticamente, de acordo com 0,1 mg/Kg.
- Repita as etapas 2.3-2.11 para cada mouse receptor.
- Meça os níveis de glicemia não em jejum dos camundongos receptores (como na etapa 2.2) 3-4x por semana no primeiro mês, e 1x por semana depois.
- Ao final do seguimento (100 dias após o transplante), anestesia (realizada como na etapa 2.3) excifique a ISWAT com o enxerto dos receptores após as etapas estéreis descritas na etapa 2.6. Fixar o tecido em formalina e paraformaldeído de acordo com os protocolos histológicos para a coloração hematoxilina e eosina (H&E) e imunofluorescência de insulina e glucagon.
- Adicione a cefalosporina e feche a incisão dos destinatários como na etapa 2.10, depois prepare-se para a recuperação como na etapa 2.11.
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Representative Results
Dois procedimentos são introduzidos neste protocolo: preparação de islet de murina e transplante de lélete no local da ISWAT. No primeiro procedimento, após perfundir e digerir com solução colagenase tipo V, purificando com Histopaque-1119 e Histopaque-1077 e uma etapa adicional de colheita de mão, as ilhotas murina isoladas serão suficientemente puras para transplante (como mostrado na Figura 1) e as ilhotas isoladas que possuem alta viabilidade serão usadas para transplante (como mostrado na Figura 2). No segundo procedimento, a indução do diabetes com a substância química STZ é fundamental. A dose ideal de STZ depende da tensão e idade do camundongo, e a indução bem sucedida do diabetes é definida por níveis não rápidos de glicemia de mais de 16,7 mmol/L ao mesmo tempo em dois dias consecutivos. Os camundongos diabéticos podem sobreviver sem transplante de lélete por algumas semanas. Os enxertos de islet devem ser totalmente misturados com hidrogel antes de serem transplantados no local da ISWAT, e alguns minutos precisam passar para que os enxertos sejam fixados no IWSAT(Figura 3). Quando transplantados na ISWAT, os enxertos de ilhota reverteram a hiperglicemia por cerca de um mês, e o peso corporal dos camundongos receptores aumentou gradualmente(Figura 4). Aos 100 dias após o transplante, os enxertos de islet foram recuperados para análise histológica (Figura 5). Como mostrado na Figura 4,o sangue não-jejum a ~10 AM nos dias de teste rapidamente subiu depois que os enxertos foram removidos. A coloração de H&E demonstrou que os enxertos de lélete permaneceram intactos. A coloração de imunofluorescência de insulina e glucagon mostrou que as líletas transplantadas funcionavam bem(Figura 5).
Figura 1: Perfusão de pâncreas e digestão e purificação de islet. (A) O processo de perfusão do pâncreas (A1–A6). (B)O ponto final da digestão do pâncreas, com partículas suspensas. (C)Lusletas purificadas observadas o microscópio de luz. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Pureza e viabilidade de léletes purificadas. (A)Pureza de islet determinado pela coloração dithizone. Viabilidade de islet avaliada pela dupla coloração FDA-PI. (B)Imagem de microscopia leve de léletes. (C)A coloração da FDA mostra células viáveis em verde. (D) PI fluorescência vermelha indica células mortas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Transplante de lélete. (A)Após anestesia, raspe o cabelo no local do transplante com uma lâmina de barbear e fixe os membros receptores na posição ascendente abdominal com fita cirúrgica. (B) Após a laparotomia, o local de transplante da ISWAT é exposto. (C)As léletas misturadas em hidrogel são lentamente transplantadas no local da ISWAT. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Níveis de glicemia e póstransplante de peso corporal. Níveis de glicemia não-emjejum (linha vermelha) e pesos corporais (linha azul) dos camundongos receptores transplantados com ilhotas sinóficas (n = 7). A seta preta indica que os enxertos foram removidos 100 dias após o transplante. Algumas variações nos níveis de glicemia comparando os vários receptores foram observadas, refletindo diferenças na qualidade e função da louça. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Histologia e imunofluorescência. Seções de enxerto foram manchadas com H&E, DAPI (núcleos), anticorpo anti-rato de insulina e anticorpo de glucagon anti-rato. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
O transplante de lélete de pâncreas é uma terapia promissora para tratar o T1DM. O efeito dessa terapia é afetado por muitos fatores e escolher um local ideal para implantação de léletes é extremamente importante. O local anatômico ideal para transplante de lélete deve ter as seguintes características: acessibilidade para simples transplante, biópsia e procedimentos de recuperação de enxerto; complicações reduzidas; alta taxa de sucesso do controle de glicose no sangue; e sobrevivência a longo prazo dos enxertos deluma15,16.
Nossa equipe descreveu anteriormente um protocolo para transplante de lélete no omentum em um modelo de murina17. No omentum, a glicemia normal foi alcançada posteriormente em comparação com o transplante de ilhota a cápsula renal. Como resultado, outros locais para implantação de léletes foram explorados.
A ISWAT foi relatada como um local alternativo ao fígado, pois precisa de menos léletes para reverter a hiperglicemia dos receptores em comparação com o transplante no fígado14. Além disso, transplantar as ilhotas é fácil, assim como visualizar e recuperar os enxertos14. Em nosso estudo, camundongos receptores reduziram a hiperglicemia dentro de um mês após o transplante de ilhota, sugerindo que o ISWAT requer mais tempo do que a cápsula renal para produzir insulina suficiente. Esses resultados indicam, portanto, que o local da ISWAT pode não oferecer melhores condições para difusão de oxigênio, nutrientes e revascularização do enxerto.
Alta pureza e atividade de lilhas isoladas são de vital importância para reverter a hiperglicemia de receptores diabéticos no cenário de transplante de alolete, e os protocolos de isolamento de islet não são os mesmos entre diferentes pesquisadores18,19,20. O tempo de digestão é muito crucial para a obtenção de léletes de alta qualidade. Em nossa experiência, não deve exceder 5 min. As lilhas isoladas podem ser cultivadas em uma incubadora de 37 °C durante a noite para permitir a recuperação do estresse mecânico do procedimento de digestão21.
O hidrogel usado aqui é uma matriz de membrana do porão que contém laminin, colágeno IV e fatores de crescimento17. Ele se solidifica quando atinge a temperatura corporal e ajuda a manter os enxertos de luma no local da ISWAT. Embora não seja tóxico para as léletas, se a presença do hidrogel afeta o enenxerto e a função de islet permanece a ser determinada.
Tomada coletivamente, a ISWAT é um novo espaço subcutâneo para transplante de lélete em modelos de roedores e potencialmente para uso clínico. Para avaliação completa, são necessários estudos adicionais utilizando modelos pré-clínicos de mamíferos maiores.
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Disclosures
Os autores não relatam conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de P&D da China (2017YFC11103704)Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível na província de Guangdong (2019), Projeto de Medicina de Sanming em Shenzhen (SZSM201412020), Fundo para Alto Nível Disciplina Médica Construção de Shenzhen (2016031638), Fundação Shenzhen de Ciência e Tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation da Província de Guangdong da China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
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