В этом протоколе описан метод изоляции мурин-опустительных и трансплантации в подкожную белую жировую ткань. Изолированные сингенные островки мурин пересаживаются в реципиент мурин с помощью гидрогеля мембраны в подвале. Контролируется уровень глюкозы в крови реципиентов, проводится гистологический анализ пересадок на аклетис.
Трансплантация поджелудочной железы является устоявшимся терапевтическим лечением диабета типа 1. Капсула почки является наиболее часто используемым местом для пересадки на газиотвую инфекцию моделям грызунов. Тем не менее, плотная капсула почки ограничивает трансплантацию достаточноостровов у крупных животных и людей. Было установлено, что подкожная подкожная белая жировая ткань (ISWAT), новое подкожное пространство, является потенциально ценным местом для трансплантации на воздушном шаре. Этот сайт имеет лучшее кровоснабжение, чем другие подкожные пространства. Кроме того, ISWAT вмещает большую массу на ище, чем капсула почки, и трансплантация в нее проста. Данная рукопись описывает процедуру изоляции и трансплантации мышей на сайте ISWAT сингенных получателей диабетической мыши. Используя этот протокол, мурин поджелудочной железы островки были выделены стандартным перевариванием коллагеназа и подвал мембранной матрицы гидрогель был использован для фиксации очищенных островков в ISWAT сайте. Уровни глюкозы в крови мышей-реципиентов отслеживались более 100 дней. На васильевке трансплантаты были извлечены в день 100 после трансплантации для гистологического анализа. Протокол для пересадки на месте ISWAT, описанный в данной рукописи, прост и эффективен.
По данным Международной федерации диабета (IDF)1,заболеваемость и распространенность сахарного диабета 1 типа (T1DM) быстро растет. Трансплантация на ислете является одним из наиболее перспективных подходов для лечения T1DM4. Так как большой прорыв, достигнутый в клинической трансплантации на аклетов с использованием протокола Эдмонтон2 было сообщено, функционирование выживаемости трансплантата на пути в T1DM получателей после 5 лет в настоящее время достигает около 50%3.
В прошлом, несколько мест трансплантации, таких как печень, почечная капсула, селезенка, внутримышечная область, подкожное пространство, костный мозг, и оментальный мешок были исследованы для экспериментальной трансплантации островка5,6,7. Некоторые из вышеперечисленных сайтов были протестированы в клинических условиях8. Хотя трансплантация на айсе в печень остается наиболее широко используемым методом в клиническом применении в настоящее время9,Есть несколько важных проблем для решения при использовании этого сайта. Например, как уменьшить раннюю потерю пересаженных островков, вызванных мгновенной опосредованной воспалительной реакцией крови (IBMIR) и плохой подачей оксигенации10,11 и как получить островк и при необходимости, потому что они диффузно локализуются в печени. Почечная капсула может быть идеальным местом для реципиентов грызунов. Тем не менее, плотная капсула почки ограничивает трансплантацию достаточного аллогенных островков у человека, хотя это может быть лучше подходит для ксенотрансплантации островка из-за высокоочищенных препаратов островка свиньи, используемых клинически5,12. Поэтому ведется поиск более подходящего места для пересадки на территории на это.
Подкожное пространство может быть использовано в качестве клинически применимого места для трансплантации на воздушном котле из-за его доступности. Однако эффективность пересадки островка в подкожное пространство крайне низка, что требует относительно большого количества островков для обращения вспять гипергликемии13. Недавно японская исследовательская группа обнаружила ISWAT, новый подкожный сайт превосходит для трансплантации на аймин в модели мурина по сравнению с печенью14. ISWAT содержит эпигастральную артерию и вену, поэтому богатое кровоснабжение может обеспечить реваскуляризацию переускулярия газографа. В этой рукописи мы предлагаем простой метод имплантации с использованием гидрогеля матрицы мембраны в подвале для фиксации сингенных островков мурин в ISWAT. Этот протокол оказывается эффективным для трансплантации на илиаке.
Трансплантация поджелудочной железы является перспективной терапией для лечения T1DM. Эффект этой терапии зависит от многих факторов, и выбор оптимального места для имплантации на кисти является чрезвычайно важным. Идеальное анатомическое место для трансплантации газа должно иметь сл…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Национальной программы никульных НИОКР Китая (2017YFC1103704)Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019), Sanming проект медицины в Шэньчжэне (SSM201412020), Фонд высокого уровня Медицинская дисциплина Строительство Шэньчжэня (2016031638), Шэньчжэнь фонд науки и техники (JCJY20160229204849975, GJH’2017031417171733555), Шэньчжэнь Фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии (S’XJ20170210210211021X Научно-исследовательский фонд китайской провинции Гуандун (A2019218), Китайский фонд постдокторской науки (2018M633218).
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
BSA | Meilune, China | MB4219 | |
C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |