Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Сопутствующей изоляции первичных астроцитов и микроглии для протозоа паразитарной инфекции

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы проинструктировать, поддерживать и отделять морина астроцитов и микроглии клеток из центральной нервной системы, а затем инфекции с паразитами простейшие.

Abstract

Астроциты и микроглии являются наиболее распространенными глиальными клетками. Они отвечают за физиологическую поддержку и гомеостазное обслуживание в центральной нервной системе (ЦНС). Растущие данные об их участии в борьбе с инфекционными заболеваниями оправдывают возникающую заинтересованность в совершенствовании методологий изоляции первичных астроцитов и микроглии для оценки их реакции на инфекции, влияющие на ЦНС. Учитывая влияние Трипаносома cruzi (T. cruzi) и Toxoplasma gondii (T. gondii) инфекции в ЦНС, здесь мы предоставляем метод для извлечения, поддержания, диссоциации и заражения морин астроцитов и микроглии клеток с паразитами простейши. Извлеченные клетки из новорожденных кортиков поддерживаются в пробирке в течение 14 дней с периодической дифференциальной заменой носителей. Астроциты и микроглии получаются из одного и того же протокола извлечения с помощью механической диссоциации. После фенотипирования цитометрией течения клетки заражаются паразитами простейшие паразиты. Скорость инфекции определяется флуоресценционной микроскопией в разных временных точках, что позволяет оценить дифференциальную способность глиальных клеток контролировать вторжение и репликацию простейшей. Эти методы представляют собой простые, дешевые и эффективные методы для изучения реакции астроцитов и микроглии на инфекции, открывая поле для дальнейшего нейроиммунологического анализа.

Introduction

ЦНС в основном состоит из нейронов и глиальных клеток1,,2,,3. Микроглия и астроциты являются наиболее распространенными клетками глии в ЦНС. Микроглия, резидент макрофаг, является иммунокомпетентным и фагоцитарной глии ячейки в ЦНС3,4, в то время как астроциты несут ответственность за поддержание гомеостаза и оказывают поддерживающие функции5.

Несмотря на глиальные клетки, классически известный, чтобы нести ответственность за поддержку и защиту нейронов6,7, новые функции этих клеток были описаны в недавней литературе, в том числе их ответы на инфекции8,9,10,11. Таким образом, есть толчок для разработки методов, чтобы изолировать эти глиальные клетки, чтобы понять их функции индивидуально.

Существуют некоторые альтернативные модели для изучения глиальных клеток, а не первичных культур, таких как увековеченные линии клеток и модели in vivo. Тем не менее, увековеченные клетки чаще подвергаются генетическим дрейфующим и морфологическим изменениям, в то время как исследования in vivo навязывают ограниченные условия манипуляции. И наоборот, первичные культуры просты в обращении, лучше напоминают в клетках vivo, а также позволяют нам контролировать экспериментальные факторы12,13. Здесь мы описываем руководящие принципы о том, как извлечь, поддерживать и разъединять морина астроцитов и микроглии первичных клеток в том же протоколе. Кроме того, мы также приведив примеры того, как работать с простейшой инфекцией в этих культурах.

Клетки ЦНС, извлеченные из неонатальных мышей (до 3 дней), культивировались в течение 14 дней на дифференциальных носителях, что позволяет преференциать росту астроцитов и клеток микроглии. Так как микроглия отдыхала над прикрепленными астроцитами, популяции клеток были механически разобщены в орбитальном инкубаторе. Затем мы собрали все супернатанты, содержащие микроглии и добавили трипсин, чтобы отделить астроциты. Изолированные глиальные клетки были фенотипически оценены цитометрией потока и покрывались в соответствии с желаемым экспериментом.

Мы также представили примеры того, как заразить эти изолированные микроглии и астроциты с простейшие паразиты. T. gondii является высоко нейротропных простейшие ответственность за токсоплазмоз14, в то время как T. cruzя несет ответственность за болезнь Шагаса, который может приводить к развитию неврологических расстройств в ЦНС15,16. Кроме того, было сообщено, что инфекция T. gondii17,18 или T. cruzi19,20,21были предполагаемой причиной смерти у пациентов с ослабленным иммунитетом.21 Поэтому большое значение имеет выяснение иммунологической роли глиальных клеток ЦНС в борьбе с простейшие инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры с участием мышей были проведены в соответствии с Бразильским национальным законом (11.794/2008) и одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и использованию (IACUC) Федерального университета Сан-Паулу (UNIFESP).

1. Извлечения, технического обслуживания и диссоциации глиальных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество мышей, используемых для извлечения глиальных клеток, зависит от количества клеток, необходимых для проведения желаемых экспериментов. В этом протоколе, в общей сложности 2,7 х 107 астроцитов и 4 х 106 микроглии были получены из шести неонатальных C57BL/6 мышей. Все процедуры проводились в стерильном состоянии в шкафу биобезопасности класса II.

  1. День 1
    1. Подготовьте чистый сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) и HBSS - 10% теплоинактивированной сыворотки плода (FBS) (см. Таблица материалов).
    2. Подготовка дополнена Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS 0,08 мМ пенициллин 0,09 мм стрептомицин 12,5 мМ HEPES 30 мм бикарбонат натрия, pH 7.2) и фильтрировать его с 0,22 мкм фильтр (см. Таблица).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все культурные носители должны храниться при 4 градусах Цельсия, но необходимо предварительно разогреть их при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут перед началом эксперимента.
    3. Стерилизовать все хирургические инструменты (ножницы, шпатель и пинцет) в автоклаве и использовать 70% этанола во время процедуры.
    4. Поместите новорожденных (до 3 дневных) мышей в герметичную камеру, содержащую хлопок, пропитанный изофлураном в течение 5 мин для глубокой анестезии.
    5. Спрей мыши щенка с 70% этанола и обезглавить животное с ножницами.
    6. Сделать sagittal вырезать (задний к передней) с ножницами вдоль черепа, чтобы открыть его и разоблачить мозг. Отделите череп от мозга с помощью пинцета. Удалить мозг с помощью микро-шпатель для поддержания целостности мозга.
    7. Поместите мозг в сухую чашку Петри (диаметром 6 см). Удалите обонятельную луковицу и мозжечок с помощью микро-шпателя. Переместите кору в другое блюдо Петри (диаметром 6 см), содержащее HBSS и 10% FBS (2 мл/Петри блюдо).
    8. Разрежьте ткани мозга на мелкие кусочки стерильными ножницами и с помощью микропипетта p1000 перенесите каждую ткань мозга с помощью HBSS и 10% FBS в различные конические трубки 15 мл. Убедитесь, что конечный объем составляет 2 мл/трубка. Если нет, то в комплекте с HBSS и 10% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Если это так, конические трубки с тканью ЦНС должны быть помещены на лед до 1 ч.
    9. Вымойте вырезанную ткань мозга с помощью 3 мл HBSS и 10% FBS (за трубку) и после декантации. Аккуратно удалите супернатант. Повторите этот шаг 3 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на удаление мусора и восстановление извлеченных тканей.
    10. Вымойте вырезанную ткань мозга с помощью 3 мл чистого HBSS (за трубку) и после декантации, тщательно удалите супернатант. Повторите этот шаг 3 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на удаление оставшейся сыворотки из предыдущих смыков, так как клетки будут пробифицированы на следующем этапе.
    11. Добавить 3 мл трипсина на трубку и поместить в водяную ванну при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, осторожно встряхивая трубки каждые 5 минут. Избегайте пузырьков путем инвертирования или резкого смешивания труб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на переваривание собранных тканей.
    12. Чтобы инактивировать трипсин, промыть ткань с 3 мл на трубку HBSS и 10% FBS и, после декантации ткани, тщательно удалить супернатант. Повторите этот шаг 3 раза.
    13. Вымойте ткань с 3 мл на трубку чистого HBSS и тщательно удалить супернатант. Повторите этот шаг 2 раза.
    14. Добавьте 7 мл на трубку чистого HBSS и гомогенизируют ткань через последовательные проходы в пипетках: сначала с серологической пипеткой 10 мл, затем 5 мл и, наконец, с микропипеткой p1000.
    15. После гомогенизации, центрифуги трубки на 450 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    16. Откажитесь от супернатанта и отрепретируйте гранулы с 4 мл HBSS и 10% FBS на трубку.
    17. Передача клеток в предварительно обработанную колбу Т-75 для оптимальной сливк клеточной культуры (см. Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка ткани от каждого животного на колбу.
    18. Поместите колбу в инкубатор при 37 градусах По цельсии и 5% CO2 в течение 30 минут для присоединения.
    19. Добавить 10 мл дополненного DMEM/F12 на колбу и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем 14 мл на колбу.
  2. День 3
    1. Удалите 7 мл культурной среды из колбы Т-75 и добавьте 7 мл свежего дополненного DMEM/F12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колбы будут содержать много клеточного мусора и облачный вид.
  3. День 5
    1. Удалите все средства из колбы Т-75 и добавьте 14 мл свежего дополненного DMEM/F12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средний заменяется с колб для удаления мусора и неприсоединения клеток.
    2. После каждого 48 ч, удалить 6 мл супернатанта и добавить 7 мл свежего дополненного DMEM/F12 среды до 14 дня культуры.
  4. День 14
    1. После удаления 6 мл супернатанта и добавления 7 мл свежего дополненного среднего DMEM/F12, плотно закройте фляги Т-75.
    2. Поместите их в пол орбитального шейкера на 200 об/мин и 37 градусов по Цельсию на ночь, чтобы механически отделить микроглии от астроцитов.
  5. День 15
    1. Возьмите колбы из шейкера и энергично мыть их с их собственной среде для того, чтобы оптимизировать диссоциации клеток и собрать максимальное количество микроглии. Затем соберите супернатант (содержащий микроглию) и перенесите на коническую трубку 50 мл.
    2. Затем добавьте 4 мл трипсина в каждую колбу и инкубировать в течение 5 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы отсоединить астроциты.
    3. Добавьте 5 мл на колбу дополненного DMEM/F12, чтобы инактивировать трипсин. Вымойте колбы с их собственной среде и передачи содержимого 50 мл конической трубки.
    4. Центрифуга все трубки, содержащие диссоциированные микроглии и астроцитов на 450 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    5. Отбросьте супернатант. Отрежь гранулы микроглии в 1 мл и астроциты в 10 мл дополненного DMEM/F12.
    6. Приступить к подсчету клеток в камере Нойбауэрили или автоматическом счетчике ячейки. Плита клетки с дополненной DMEM/F12 при желаемой плотности в соответствующей плоской нижней плите культуры клеток (предварительно обработанной для оптимального вложения клетки; см. Таблица Материалов). Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 24 ч, чтобы они прикреплялись.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зарезервируйте 1,5 x 106 каждой популяции клеток, чтобы подтвердить свою чистоту цитометрией потока.
    7. Выполните цитометрический анализ потока для проверки чистоты популяций клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рассматриваем микроглии+CD11b /CD45/GFAP- и астроцитов CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 и TMEM119 окрашивание может быть рассмотрен для того, чтобы полностью охарактеризовать микроглии22.
    8. Добавьте FMO (Fluorescence Minus One)23 и незапятнанный образец для каждой популяции клеток (астроциты и микроглии) в качестве контроля цитометрии потока.
    9. Для каждой популяции клеток, резерв 5 х 105 ячеек для каждого окрашенных и неокрашенных образцов. Для FMO, зарезервировать две другие трубки микроглии, содержащие 2,5 х 105 клеток каждый, а также зарезервировать другую трубку 5 х 10 5 астроцитов.5
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку номера микроглии могут быть ограничивающим фактором, можно использовать меньше клеток для неокрашенных и FMO-контроля.
    10. Центрифуга все микротрубки на 450 х г в течение 5 мин при 4 c. Откажитесь от супернатанта и отрептите гранулы с 500 qL/microtube буфера FACS (фосфат-буферный солен (PBS) - 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) 2 мМ EDTA, pH 7.2).
    11. Центрифуга все микротрубки на 450 х г при 4 кв с в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend гранулы с 100 л /микротрубка анти-CD16/CD32 (клон 93) (1:50) разбавленный в буфере FACS. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    12. Добавьте 500 л/микротрубку буфера FACS во все микротрубки и центрифугу при 450 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Отбросьте супернатант. Resuspend астроцитов и микроглии окрашивания труб, а также астроцит Овсит FMO трубки с 50 Л / микротрубка поверхностных маркеров смеси: анти-CD45 (PE, клон 30-F11) и анти-CD11b (eFluor 450, клон M1/70) (оба разбавлены в 1: 100 в буфере FACS).
    13. Для неокрашенных ячеек, resuspend с тем же объемом буфера FACS. Для микроглии FMO, инкубировать каждую трубку микроглии с анти-CD45 или анти-CD11b. Инкубировать все образцы при 4 КК в течение 20 минут в темноте.
    14. Добавьте 500 л буфера FACS на микротрубку. Центрифуга при температуре 450 х г при температуре 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и отбросите гранулы 100 л/микротрубкой фиксационного буфера (см. Таблицу Материалов)в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
    15. Добавьте 500 л/микротрубку буфера пермяки 1x (см. Таблица материалов)и инкубировать при 4 градусах По кв. м в течение 5 минут в темноте.
    16. Centrifuge все микротрубки на 450 х г при 4 кв КС в течение 5 мин. Отбросьте супернатант. Resuspend астроцитов и микроглии окрашивания труб, а также микроглии FMO труб с 50 Л / микротрубки внутриклеточного антитела анти-GFAP (APC, клон GA5) в 1:100 разбавления в 1x пермякции буфера. Для неокрашенных клеток и астроцитов FMO, resuspend клетки с тем же объемом буфера FACS. Инкубировать все образцы при 4 градусах по Цельсию в течение 30 минут в темноте.
    17. Вымойте все трубки, добавив 500 л/микротрубки 1x буфера пермяков. Центрифуга все микротрубки на 450 х г, в течение 5 мин при 4 c. Приостановите каждую микротрубку в 200 кЛ буфера FACS. Приобретите 1 x 105 событий/образец на цитометрпотока потока.
    18. Для анализа клетки должны быть закрыты сначала на CD11b x CD45, а затем гистограмму GFAP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неокрашенные и FMO управления полезны для определения ворот.

2. Инфекция и оценка показателей инфицирования

  1. Инфекция глиальных клеток с помощью T. gondii
    1. Плита 3 х 104 микроглии или астроцитов с дополненной DMEM/F12 при 37 Градусах по Цельсию и 5% CO2 на 24 ч в предварительно обработанной 96-хорошо плоской пластине (см. Таблица Материалов).
    2. Заразить каждую популяцию клеток тахизоитами т. gondii RH штамм, выражающий желтый флуоресцентный белок (YFP) при множественности инфекции (MOI) 1:1 (паразит:клетка) разбавленного в 200 qL/well дополненного RPMI (3% FBS 0,16 мМ пенициллин 0,18 мм Стрептомицин рН 7.2) (см. Таблица материалов). Инкубировать при 37 градусах По кв. м и 5% CO2 на 48 ч.
    3. Затем отбросьте супернатант и зафиксите клетки, добавив 100 л/колой 1% параформальдегида (PFA), разбавленного в PBS при 4 градусах По Цельсию в течение 24 ч.
    4. Замените PFA 100 Л/колодец PBS при рН 7.2.
    5. Тщательно удалите супернатант и ядра пятен, протяните 50 л/колодец DAPI (5 мг/мл), разбавленное PBS pH 7.2 (1:1,000) в течение 1 мин при комнатной температуре в темноте.
    6. Замените раствор окрашивания DAPI 100 Л/колодец PBS (pH 7.2) и проанализируйте его с помощью флуоресценции.
  2. Инфекция глиальных клеток с помощью T. cruzi
    1. Плита 3 х 104 микроглии или астроцитов с дополненной DMEM/F12 при 37 Градусах по Цельсию и 5% CO2 на 24 ч в предварительно обработанной 96-хорошо плоской пластине (см. Таблица Материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого момента точки инфекции, используйте различные пластины.
    2. Заразить глиальные клетки трипомастиготами из T. cruzi Y штамма при МВД 5:1 (тунеядцы: клетки) разбавленной в 200 л / хорошо дополненной RPMI и инкубировать при 37 C и 5% CO2 на 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет важное значение для клеточного вторжения паразита.
    3. Удалите все супернатанты и промойте колодцы, добавив 200 л/хорошо дополненного RPMI, чтобы удалить все внеклеточные паразиты. Удалить супернатант и добавить 200 Л/хорошо свежего дополненного RPMI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предназначен для удаления всех паразитов, которые не вторгаются в клетки адептов.
    4. Инкубировать инфицированные клетки на 2 ч, 48 ч и 96 ч для оценки репликации T. cruzi в глиальных клетках11.
    5. После каждого момента, удалить супернатант и исправить клетки с 100 Л / хорошо метанола в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем заменить метанол с 100 Л / хорошо PBS (pH 7.2).
    6. После фиксации, подготовить клетки для иммунофлуоресценции анализ следующим образом.
      1. Чтобы избежать аутофлюоресценции, лечить клетки с 100 л /хорошо 50 мМ NH4Cl разбавленной в PBS (pH 8.0) в течение 15 мин. Вымойте клетки, добавив 100 л /хорошо PBS и немедленно удалить его (повторите этот шаг 3 раза).
      2. Далее, permeabilize клеток, добавив 100 Л / хорошо 0,5% Тритон разбавленной в PBS в течение 15 мин. Вымойте клетки, добавив 100 л / хорошо PBS и немедленно удалить его (повторите этот шаг 3 раза).
      3. Затем инкубировать клеточную культуру с 100 л/хорошо блокирующего раствора (5% обезжиренного молока и 2% BSA, разбавленного в PBS (pH 7.2) в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте клетки, добавив 100 Л/хорошо PBS и немедленно удалить его (повторите этот шаг 3 раза).
      4. Для того, чтобы запятнать амастиготы, инкубировать 30 Л/ну некоммерческих моноклональных антител (mAb) 2C2 анти-Ssp-4 белка (1:200) разбавленного в блокирующем растворе на 1 ч при комнатной температуре.
      5. Вымойте клетки, добавив 100 Л/хорошо PBS и немедленно удалить его (повторите этот шаг 3 раза). Инкубировать пластину с 30 Л/также вторичных антимышечных антител (1:500) разбавленного в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Некоммерческий белок mAb 2C2 anti-Ssp-4 был добрым подарком от профессора доктора Ренато А. Мортары из кафедры микробиологии, иммунологии и паразитологии Федерального университета Сан-Паулу.
      6. Тщательно удалите супернатант и ядра пятна, добавив 50 л/колодец DAPI (5 мг/мл), разбавленного в PBS pH 7.2 (1:1,000) в течение 1 мин при комнатной температуре в темноте.
      7. Замените раствор окрашивания DAPI 100 Л/ну PBS pH 7.2 и проанализируйте его с помощью флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На14-й день культура глиальных клеток(рисунок 1А)подверглась механической диссоциации. Изолированные популяции клеток были проанализированы цитометрией потока в соответствии с маркерами CD11b, CD45 и GFAP. Мы могли бы наблюдать чистоту 89,5% для астроцитов населения и 96,6% для населения микроглии(рисунок 1B). После изоляции клетки были покрыты 96-хорошо плоской пластиной и после 24 ч они были готовы к заражению T. cruzi или T. gondii в соответствии с соответствующими протоколами инфекции. Здесь мы предоставили временной курс инфекции T. cruzi в качестве примера оценки скорости инфекции в этих глиальных клеток.

Астроциты и микроглии (3 х 104 клетки/ хорошо) были инфицированы T. cruzi в МВД No 5:1 (паразиты:клетки) для 2-96 ч (Рисунок 2). Уровень инфицирования оценивался иммунофлуоресценцией путем подсчета количества клеток и количества паразитов, окрашенных интеркальатором ДНК (DAPI). Короче говоря, мы могли бы наблюдать, что T. cruzi способен вторгаться в микроглии и астроцитов с аналогичными темпами. Кроме того, T. cruzi реплицируется в обоих типах клеток, достигая самого высокого уровня инфекции на уровне 96 ч после инфицирования (p.i.). Интересно, что на 96 ч p.i. уровень инфекции является более выраженным в астроцитов, чем в микроглии, предполагая, что клетки микроглии способны контролировать репликации паразитов более эффективно, чем астроциты, как мы ранее описали11.

Важно отметить, что использование генетически модифицированных паразитов, выражающих флуоресцентные репортеры или паразиты помечены специфическими флуоресцентными антителами может улучшить иммунофлуоресцентную микроскопию, так как они лучше отличаются от ядра клеток (Рисунок 3). Кроме того, уровень инфицирования флуоресцентных паразитов может быть определен с помощью других методов, таких как цитометрия потока. Здесь мы представили примеры штамма T. gondii RH, который в меняет YFP(рисунок 3A)и T. cruzi Y штамм, окрашенный некоммерческим mAb 2C2 анти-Ssp-4 белка(Рисунок 3B).

В целом, этот протокол описывает, как извлечь, поддерживать, разъединять и заражать микроглии и астроцитов первичных клеток, которые могут быть мощным инструментом для изучения, например, иммунные реакции глиальных клеток на простейшую инфекцию, как кратко выяснено Здесь.

Figure 1
Рисунок 1: Первичные астроциты и клетки микроглии. (A) Изображения C57BL/6 murine глиальных клеток на14-й день культуры были получены с помощью перевернутого микроскопа (400x). Красная стрелка указывает на слой астроцитов, а черная стрелка указывает на микроглию. (B) После механической диссоциации, астроциты и микроглии были окрашены (5 х 105 клеток) с флуоресцентными анти-CD11b, анти-CD45 и анти-GFAP и оценивается поток цитометрии (1 х 105 клеток приобретения). Астроциты считаются CD11b-/CD45- иклетками GFAP, в то время как микроглии являются CD11bи/CD45+ и GFAP- клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Время-курс инфекции T. cruzi в глиальных клетках. Астроциты и микроглии от мышей C57BL/6 были инфицированы T. cruzi Y (MOI No 5:1). После 2 ч, 48 ч и 96 ч камеры были закреплены метанолом и окрашены маркером ядра клетки DAPI (синий) и анти-GFAP (красный). Изображения были получены с помощью перевернутого флуоресценционного микроскопа (400x). Количество амастиготов внутри клеток и частота инфицированных клеток оценивались программным обеспечением флуоресценции (см. Таблица материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Астроциты и микроглии инфекции флуоресцентными паразитами простейшие. (A) 3 х 104 астроцитов и микроглии от C57BL/6 мышей были инфицированы (MOI No 1:1) с T. gondii RH YFP (зеленый) для 48 ч, камеры были зафиксированы с 1% PFA и окрашены DAPI (синий). (B) 3 х 104 астроцитов и микроглии из C57BL/6 мышей были инфицированы (MOI No 5:1) с T. cruzi Y для 96 ч, и камеры были зафиксированы с чистым метанолом и окрашенные DAPI (зеленый) и mAb 2C2 anti-Ssp-4 (оранжевый). Изображения были получены с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В последние два десятилетия растет значение изучения функций изолированных глиальных клеток в различных биологических контекстах. Понимание ЦНС за нейроны по-прежнему растущее поле в клеточной биологии, особенно при инфекциях или воспалительных заболеваний8,9,24. Глиальные клетки имеют решающее значение не только для нейронов физической поддержки (как это было ранее известно), но и во многих других физиологических ситуациях, таких как энергия нейронов, нейрометаболизм, иммунное наблюдение, синаптической обенки, формирования и модуляции ткани, среди других3,25,26,27,28,29.

Поскольку астроциты и микроглии могут быть дифференцированно модулированы во время инфекции или стерильного воспаления, очень важно понять индивидуальную и относительную роль этих глиальных клеток. Хотя микроглии, как известно, представляют моноядерную систему фагоцитов (MPS) в ЦНС, астроциты также были описаны как ключевой игрок в иммунных реакциях ЦНС8. Для того, чтобы сравнить роль каждого глиального подмноза в контексте инфекции и/или воспаления, необходимо получить их из той же экстракции и условий. Есть несколько сообщений о эффектор ответы микроглии и астроцитов для борьбы с инфекциями, особенно в отношении простейшие паразиты. В этом смысле, мы недавно продемонстрировали требование NLRP3 воспаления для контроля T. cruzi репликации в микроглии, но не в астроцитах механизмом с участием оксида азота (NO) секреции11.

Этот протокол описывает метод, который направлен на одновременное извлечение двух наиболее распространенных популяций глиальных клеток, астроцитов и микроглии, от послеродовых (до 3-дневных) мышей. Новорожденные мыши старше 3-дневного могут быть использованы, но мы испытали, что выход обеих клеток уменьшается несколько с течением времени (данные не показаны). Наш метод отличается от ранее описанных протоколов для астроцитов или изоляции микроглии, потому что мы сосредоточились на получении и изоляции обоих типов клеток в одной и той же извлечении, при тех же условиях, тем самым оптимизируя использование экспериментальных животных и улучшая изучение относительной роли этих клеток в иммунологических контекстах. Кроме того, наш протокол также оптимизировал выход обоих типов клеток. Выход, как правило, 3-5 х 106 астроцитов и 3-5 х 105 микроглии за колбу. Сравните это с другими протоколами, которые приводят к меньшеклеток, используя больше животных на Т-75 колбу (некоторые протоколы используют 2-3 животных на колбу)30,31.

Еще одним преимуществом этого протокола является время, необходимое для получения изолированных астроцитов и микроглии. В течение 14 дней можно получить зрелую микроглию. В самом деле, важно подчеркнуть, что, как Flode и Комбс продемонстрировали, микроглии старше 14 дней настоящее снижение способности выделять цитокинов; очень важно учитывать это в нейроиммунологическом контексте30. Несмотря на то, что зрелые производители астроцитов до конца не поняты, GFAP в значительной степени используется для характеристики отзывчивых и активных астроцитов. Некоторые протоколы достигают уровня 90% положительных клеток GFAP только после 21 или 28 дней культуры. По этой причине, мы предложили метод, который при условии, клетки, которые иммуноотвечают и в основном созревают в течение 7-14 дней. Хотя чистота может быть ниже, чем другие методы для астроцитов31 и микроглии30, основное внимание было получить микроглии и астроцитов в больших количествах в сопутствующей добычи. Мы понимаем, что популяции клеток могут быть дополнительно отсортированы или изолированы с разделением столбцов, чтобы улучшить их чистоту. Для этого могут быть включены дополнительные маркеры ячеек, такие как Iba1 или TMEM119 для микроглии; Аквапорин-4 или S100B для астроцитов, CC1 или O4 для олигодендроцитов и neuN для нейронов22,31,32,33. Тем не менее, важное поражение ячейки в конце протокола должно быть рассмотрено.

Таким образом, мы предоставили модифицированный метод одновременного получения микроглии и астроцитов в эффективном и дешевом протоколе. Кроме того, этот протокол обеспечивает преимущества большой урожайности, позволяющие сравнительные исследования глиальных подмножеств в нейроиммунологических контекстах, как показано здесь во время инфекции T. cruzi и T. gondii.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Ренато А. Мортару из Федерального университета Сан-Паулу (UNIFESP) за mAb 2C2 anti-Ssp-4. Эта работа была поддержана грантами от Фонда ампаро и Пескиса-ду-Эстадо-де-Сан-Паулу (FAPESP, грант 2017/25942-0 К.Р.Б.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient'fico e Tecnol'gico (CNPq, грант 402100/2016-6 К.Р.Б.), Национальный институт сиенсии-де-Текнология де Вацинас (INCTV/CNPq) и Coordena'o de Aperfei'oamento de Pessoal de N'vel Superior (CAPES, Финансовый кодекс 001). M.P.A. получает стипендию от CNPq, A.L.O.P. получает стипендию от CAPES, а I.S.F и L.M.F.B. получает стипендию от FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 157 Клетки Глиа астроциты микроглия простейшие инфекции T. cruzi T. gondii
Сопутствующей изоляции первичных астроцитов и микроглии для протозоа паразитарной инфекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter