Summary

Gleichzeitige Isolierung von Primärastrozyten und Mikroglia bei Protozoenparasiten-Infektion

Published: March 18, 2020
doi:

Summary

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu unterweisen, wie man murine Astrozyten- und Mikrogliazellen aus dem zentralen Nervensystem extrahiert, aufrechterhält und dissoziiert, gefolgt von einer Infektion mit Protozoenparasiten.

Abstract

Astrozyten und Mikroglia sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen. Sie sind verantwortlich für physiologische Unterstützung und Homöostase-Wartung im Zentralnervensystem (ZNS). Die zunehmenden Beweise für ihre Beteiligung an der Bekämpfung von Infektionskrankheiten rechtfertigen das sich abzeichnende Interesse an der Verbesserung der Methoden zur Isolierung primärer Astrozyten und Mikroglia, um ihre Reaktionen auf Infektionen, die das ZNS betreffen, zu bewerten. Unter Berücksichtigung der Auswirkungen der Trypanosoma cruzi (T. cruzi) und Toxoplasma gondii (T. gondii) Infektion im ZNS, hier bieten wir eine Methode, um zu extrahieren, zu pflegen, zu dissoziieren und murine Astrozyten und Mikrogliazellen mit ProtozoenParasiten zu infizieren. Extrahierte Zellen aus neugeborenen Kortiken werden 14 Tage lang in vitro mit periodischem Differentialmedienersatz gehalten. Astrozyten und Mikroglia werden aus dem gleichen Extraktionsprotokoll durch mechanische Dissoziation gewonnen. Nach der Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie werden Zellen mit Protozoenparasiten infiziert. Die Infektionsrate wird durch Fluoreszenzmikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt, wodurch die Differenzfähigkeit von Gliazellen zur Kontrolle der protozoischen Invasion und Replikation bewertet wird. Diese Techniken stellen einfache, kostengünstige und effiziente Methoden dar, um die Reaktionen von Astrozyten und Mikroglia auf Infektionen zu untersuchen und das Feld für weitere neuroimmunologische Analysen zu öffnen.

Introduction

Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen und Gliazellen1,2,3. Mikroglia und Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im ZNS. Microglia, das ansässige Makrophagen, ist die immunkompetente und phagozytische Gliazelle im ZNS3,4, während Astrozyten für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich sind und unterstützende Funktionen ausüben5.

Obwohl Gliazellen klassisch bekannt sind, verantwortlich für die Unterstützung und den Schutz der Neuronen6,7, neu entstehende Funktionen dieser Zellen wurden in der jüngsten Literatur beschrieben, einschließlich ihrer Reaktionen auf Infektionen8,9,10,11. Daher gibt es einen Vorstoß, Methoden zu entwickeln, um diese Gliazellen zu isolieren, um ihre Funktionen individuell zu verstehen.

Es gibt einige alternative Modelle, um Gliazellen zu untersuchen, anstatt Primärkulturen, wie verewigte Zelllinien und In-vivo-Modelle. Verewigte Zellen unterliegen jedoch eher genetischen Driften und morphologischen Veränderungen, während In-vivo-Studien begrenzte Manipulationsbedingungen auferlegen. Umgekehrt sind Primärkulturen einfach zu handhaben, ähneln besser in vivo Zellen und ermöglichen es uns auch, experimentelle Faktoren zu kontrollieren12,13. Hier beschreiben wir Richtlinien, wie man murine Astrozyten und Mikroglia-Primärzellen im selben Protokoll extrahiert, pflegt und dissoziiert. Darüber hinaus bieten wir auch Beispiele, wie mit Protozoeninfektionen in diesen Kulturen zu arbeiten.

ZNS-Zellen, die aus neonatalen Mäusen (bis zu 3 Tage alt) extrahiert wurden, wurden 14 Tage lang auf differentialen Medien kultiviert, die das bevorzugte Wachstum von Astrozyten und Mikrogliazellen ermöglichen. Da Mikroglia über den angeschlossenen Astrozyten ruht, wurden Zellpopulationen in einem Orbital-Inkubator mechanisch dissoziiert. Als nächstes sammelten wir alle Überstande, die Mikroglia enthielten, und fügten Trypsin hinzu, um Astrozyten zu lösen. Isolierte Gliazellen wurden phänotypisch durch Durchflusszytometrie ausgewertet und nach dem gewünschten Experiment plattiert.

Wir lieferten auch Beispiele, wie man diese isolierten Mikroglia und Astrozyten mit Protozoenparasiten infiziert. T. gondii ist ein hochneurotroper Protozoen, der für Toxoplasmose14verantwortlich ist, während T. cruzi für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist, die zur Entwicklung neurologischer Störungen im ZNS15,16führen kann. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass eine Infektion mit T. gondii17,18 oder T. cruzi19,20,21 die mutmaßliche Todesursache bei immungeschwächten Patienten waren. Daher ist die Aufklärung der immunologischen Rolle von Gliazellen aus dem ZNS bei der Kontrolle von Protozoeninfektionen von großer Bedeutung.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem brasilianischen Nationalgesetz (11.794/2008) durchgeführt und von den Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschüssen (IACUC) der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) genehmigt. 1. Glial Cells Extraktion, Wartung und Dissoziation HINWEIS: Die Anzahl der Mäuse, die für die Extraktion von Gliazellen verwendet werden, hängt von der Menge der Zellen ab, die für die Durch…

Representative Results

Am14. Tag wurde die Glialzellenkultur (Abbildung 1A) einer mechanischen Dissoziation unterzogen. Isolierte Zellpopulationen wurden durch Durchflusszytometrie nach CD11b-, CD45- und GFAP-Markern analysiert. Wir konnten eine Reinheit von 89,5% für die Astrozytenpopulation und 96,6% für die Mikrogliapopulation beobachten (Abbildung 1B). Nach der Isolierung wurden die Zellen in eine 96-Well-Flachplatte plattiert und nac…

Discussion

Die Bedeutung der Untersuchung isolierter Gliazellen in unterschiedlichen biologischen Kontexten hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten ausgeweitet. Das Verständnis des ZNS über Neuronen hinaus ist immer noch ein wachsendes Feld in der Zellbiologie, vor allem bei Infektionen oder entzündlichen Erkrankungen8,9,24. Gliazellen sind nicht nur für die körperliche Unterstützung der Neuronen (wie es früher bekannt war), sonder…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Professor Dr. Renato A. Mortara von der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) für mAb 2C2 anti-Ssp-4. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Fundao de Amparo , Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, Stipendium 2017/25942-0 an K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnolégico (CNPq, 402100/2016-6 an K.R.B.), das Instituto Nacional de Ciéncia e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) und Coordenaéo de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior (CAPES, Finanzkodex 001). M.P.A. erhält ein Stipendium von CNPq, A.L.O.P. erhält ein Stipendium von CAPES und I.S.F und L.Z.M.F.B. ein Stipendium von FAPESP.

Materials

70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 mm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat – anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS – Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10X) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 ºC with trypsin

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

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Cite This Article
Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

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