Summary
Bu protokolün genel amacı, merkezi sinir sisteminden murine astrositi ve mikroglia hücrelerinin nasıl çıkarılabildiğini, bakımını ve ayrıştırığunu ve ardından protozoa parazitleri ile enfeksiyonun nasıl sağlanmadığını öğretmektir.
Abstract
Astrositler ve mikroglia en bol glial hücrelerdir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) fizyolojik destek ve homeostaz bakımından sorumludurlar. Bulaşıcı hastalıkların kontrolünde ki rollerinin giderek artan kanıtları, CNS'yi etkileyen enfeksiyonlara verdikleri yanıtları değerlendirmek için birincil astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için metodolojilerin geliştirilmesine olan ilgiyi haklı çıkarmaktadır. Trypanosoma cruzi (T. cruzi)ve Toxoplasma gondii (T. gondii)enfeksiyonunun CNS enfeksiyonunun etkisi göz önüne alındığında, burada ürinen astrositleri ve mikroglia hücrelerini protozoa parazitleri ile ayıklamak, korumak, ayrıştırmak ve enfekte etmek için bir yöntem salıyoruz. Yenidoğan kortekslerinden çıkarılan hücreler periyodik diferansiyel ortam replasmanı ile 14 gün boyunca in vitro olarak muhafaza edilir. Astrositler ve mikroglia mekanik ayrışma ile aynı ekstraksiyon protokolü elde edilir. Akış sitometrisi ile fenotiotipleme den sonra hücreler protozoa parazitleri ile enfekte olur. Enfeksiyon oranı farklı zaman noktalarında floresan mikroskopisi ile belirlenir, böylece glial hücrelerin diferansiyel yeteneğinin protozoan invazyonu ve replikasyonunu kontrol etme yeteneğinin değerlendirilmesi sağlar. Bu teknikler, astrositlerin ve mikroglianın enfeksiyonlara verdiği tepkileri incelemek için basit, ucuz ve verimli yöntemleri temsil eder ve daha fazla nöroimmünoloji analizi için alanı açar.
Introduction
CNS esas olarak nöronlar ve glialhücrelerdenoluşur 1,2,3. Mikroglia ve astrositler CNS en bol glia hücreleridir. Mikroglia, yerleşik makrofaj, immünyonlu ve Fagositik glia hücre CNS3,4, astrosithomeostaz korumak ve destekleyici işlevleri uygulamak için sorumlu iken5.
Glial hücreler klasik destek ve nöronların korunması sorumlu olduğu bilinen olmasına rağmen6,7, Bu hücrelerin ortaya çıkan fonksiyonları son literatürde tarif edilmiştir, enfeksiyonlara yanıtları da dahil olmak üzere8,9,10,11. Böylece, bireysel olarak işlevlerini anlamak için bu glial hücreleri izole etmek için yöntemler geliştirmek için bir itme vardır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre soyları ve in vivo modeller gibi birincil kültürler yerine glial hücreleri incelemek için bazı alternatif modeller vardır. Ancak, ölümsüzleştirilmiş hücreler genetik sürüklenme ve morfolojik değişikliklere uğrama olasılığı daha yüksektir, in vivo çalışmalar sınırlı manipülasyon koşulları empoze ederken. Tersine, birincil kültürleri işlemek kolaydır, daha iyi vivo hücrelerde benzer ve aynı zamanda bize deneysel faktörleri kontrol etmek için izin12,13. Burada, aynı protokoldeki murine astrositlerinin ve mikroglia birincil hücrelerinin nasıl ayıklandığı, bakımı ve ayrıştırılaması ile ilgili yönergeleri açıklıyoruz. Ayrıca, bu kültürlerde protozoa enfeksiyonu ile nasıl çalışılabilenlere ilişkin örnekler de salıyoruz.
Yenidoğan farelerden elde edilen CNS hücreleri (3 güne kadar) astrosit ve mikroglia hücrelerinin tercihli büyümesini sağlayan diferansiyel ortamda 14 gün boyunca kültüre alınmıştır. Mikroglia ekli astrositlerin üzerinde olduğundan, hücre popülasyonları mekanik olarak orbital inkübatörde ayrıştırıldı. Sonra, mikroglia içeren tüm supernatant toplandı ve astrositleri ayırmak için tripsin ekledi. İzole glial hücreler akış sitometrisi ile fenotipik olarak değerlendirildi ve istenilen deneye göre kaplandı.
Ayrıca bu izole mikroglia ve astrositlere protozoa parazitleri ile nasıl bulaşabileceğimize ilişkin örnekler verdik. T. gondii toksoplazmoz sorumlu bir son derece nörotropik protozoon14, T. cruzi CNS nörolojik bozuklukların gelişmesine yol açabilir Chagas hastalığından sorumlu iken15,16. Ayrıca, t. gondii17ile enfeksiyon bildirilmiştir,18 veya T. cruzi19,20,21 bağışıklık hastalarında ölüm tahmini nedeni. Bu nedenle, protozoa enfeksiyonlarının kontrolünde CNS glial hücrelerin immünolojik rolünün açıklanması büyük önem taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerle ilgili tüm deneysel prosedürler Brezilya Ulusal Kanunu'na (11.794/2008) uygun olarak gerçekleştirilmiştir ve São Paulo Federal Üniversitesi (UNIFESP) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Glial Hücre Çıkarma, Bakım ve Dissociation
NOT: Glial hücre ekstraksiyonu için kullanılan fare sayısı istenilen deneyleri gerçekleştirmek için gereken hücre miktarına bağlıdır. Bu protokolde altı neonatal C57BL/6 fareden toplam 2.7 x 107 astrosit ve 4 x 106 mikroglia elde edildi. Tüm işlemler sınıf II biyogüvenlik kabininde steril koşullar altında gerçekleştirildi.
- 1. Gün
- Saf Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) ve HBSS + ısıya inaktive edilmiş fetal büyükbaş serumun (FBS) %10'u hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Tamamlanmış Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) (DMEM)/F12 (%10 FBS + 0,08 mM Penisilin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM sodyum bikarbonat, pH 7,2) ve 0,22 μm filtre ile filtreleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Tüm kültür ortamları 4 °C'de saklanmalıdır, ancak deneye başlamadan önce 37 °C'de 20 dakika önceden ısıtılmalıdır. - Tüm cerrahi aletleri (makas, spatula ve cımbız) bir otoklavda sterilize edin ve işlem sırasında %70 etanol kullanın.
- Derin anestezi için 5 dakika boyunca isofluran ile ıslatılmış pamuk içeren kapalı bir odaya yeni doğanlar (en fazla 3 günlük) fareler koyun.
- Sprey fare yavrusu% 70 etanol ile ve makas ile hayvan decapitate.
- Sagittal kesim olun (anterior posterior) kafatası boyunca makas ile açmak ve beyin ortaya çıkarmak için. Kafatasını cımbızla beyinden ayırın. Beyin bütünlüğünü korumak için bir mikro spatula kullanarak beyin çıkarın.
- Kuru bir Petri kabı (6 cm çapında) beyin yerleştirin. Bir mikro spatula kullanarak koku ampul ve beyincik çıkarın. Korteksi HBSS + %10 FBS (2 mL/Petri kabı) içeren başka bir Petri kabına (6 cm çapında) taşıyın.
- Steril makas ile küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin ve farklı 15 mL konik tüpler için HBSS + 10% FBS ile her beyin dokusu transferi bir p1000 mikropipet kullanarak. Son hacmin 2 mL/tüp olduğundan emin olun. Değilse, HBSS + 10% FBS ile tamamlayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Bu nedenle, CNS dokusuna sahip konik tüpler 1 saate kadar buz üzerine yerleştirilmelidir. - Kesilen beyin dokusunu 3 mL HBSS + %10 FBS (tüp başına) ve dekantasyon sonrası yıkayın. Dikkatle supernatant çıkarın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
NOT: Bu adım, enkaz kaldırmak ve çıkarılan doku kurtarmak için amaçlamaktadır. - Kesilen beyin dokusunu 3 mL saf HBSS (tüp başına) ile yıkayın ve dekantasyondan sonra supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
NOT: Bu adım, bir sonraki adımda hücreler deneneceği için kalan serumu önceki yıkarlardan çıkarmayı amaçlar. - Tüp başına 3 mL tripsin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin, her 5 dakikada bir tüpleri hafifçe sallayın.
NOT: Bu adım toplanan dokusi sindirmeyi amaçlamaktadır. - Tripsinin inaktive etmek için, HBSS tüp başına 3 mL ile doku yıkayın + 10% FBS ve, doku dekantasyon sonra, dikkatle supernatant çıkarın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Saf HBSS tüpü başına 3 mL ile doku yıkayın ve dikkatle supernatant çıkarın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
- Saf HBSS tüpü başına 7 mL ekleyin ve pipetler ardışık geçitler yoluyla doku homojenize: ilk 10 mL serolojik pipet ile, 5 mL ve son olarak p1000 micropipette ile takip.
- Homojenizasyondan sonra 4 °C'de 450 x g'de 5 dk santrifüj tüpleri.
- Supernatant atın ve tüp başına HBSS 4 mL +% 10 FBS ile pelet resuspend.
- Hücreleri en uygun hücre kültürü yapışması için önceden işlenmiş bir T-75 şişesine aktarın (bkz. Malzemeler Tablosu).
NOT: Şişe başına her hayvandan doku işleme. - Şişeyi 37 °C'de kuvöze yerleştirin ve yapışma için 30 dakika boyunca %5 CO2'ye yerleştirin.
- Şişe başına 10 mL ilave DMEM/F12 ekleyin ve 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
NOT: Son hacim şişe başına 14 mL'dir.
- 3. Gün
- T-75 şişesinden 7 mL kültür ortamını çıkarın ve 7 mL taze takviyeli DMEM/F12 ekleyin.
NOT: Şişeler hücresel enkaz ve bulutlu bir görünüm bir sürü içerecektir.
- T-75 şişesinden 7 mL kültür ortamını çıkarın ve 7 mL taze takviyeli DMEM/F12 ekleyin.
- 5. Gün
- T-75 şişesinden tüm ortamı çıkarın ve 14 mL taze takviyeli DMEM/F12 ekleyin.
NOT: Orta enkaz ve non-yapışık hücreleri kaldırmak için şişelerden değiştirilir. - Her 48 saat sonra, supernatant 6 mL çıkarın ve kültür 14 güne kadar taze takviye Lim/F12 orta 7 mL ekleyin.
- T-75 şişesinden tüm ortamı çıkarın ve 14 mL taze takviyeli DMEM/F12 ekleyin.
- 14. Gün
- Supernatant 6 mL çıkardıktan ve taze takviye DMEM / F12 orta 7 mL ekledikten sonra, sıkıca T-75 şişeleri kapatın.
- Astrositlerden mekanik olarak mikroglia çıkarmak için 200 rpm ve 37 °C gecede yer orbital shaker yerleştirin.
- 15. Gün
- Shaker gelen şişeleri alın ve şiddetle hücre ayrışması optimize etmek ve mikroglia maksimum sayıda hasat için kendi orta ile yıkayın. Daha sonra, supernatant toplamak (microglia içeren) ve 50 mL konik tüp aktarın.
- Daha sonra, astrositleri ayırmak için her şişeye 4 mL tripsin ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tripsini inaktive etmek için eklenmiş DMEM/F12 şişesi başına 5 mL ekleyin. Şişeleri kendi ortamları ile yıkayın ve içindekileri 50 mL konik bir tüpe aktarın.
- 4 5 dakika 4 °C'de 450 x g'de ayrıştırılmış mikroglia ve astrosit içeren tüm tüpleri santrifüj edin.
- Supernatant atın. 1 mL'deki mikroglia peletini ve 10 mL'lik astrositleri takviye edilmiş DMEM/F12'de yeniden askıya alın.
- Neubauer odasında veya otomatik hücre sayacında hücre saymaya devam edin. Uygun bir düz alt hücre kültür plakası (optimal hücre eki için önceden tedavi edilir; malzemeler tablosunabakınız) istenilen yoğunlukta tamamlayıcı DMEM/F12 ile hücreleri plakalayın. Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat boyunca inkülerler.
NOT: Her hücre popülasyonunun 1,5 x 106'sını akış sitometrisi ile saflıklarını doğrulamak için ayırın. - Hücre popülasyonlarının saflığını doğrulamak için akış sitometrik analizi yapın.
NOT: Biz microglia CD11bdüşünün +/ CD45+/ GFAP- ve astrositler CD11b-/ CD45-/ GFAP+. Iba1 ve TMEM119 boyama mikroglia22'yitam olarak karakterize etmek için düşünülebilir. - Akış sitometri testinin kontrolü olarak bir FMO (Floresan Eksi Bir)23 ve her hücre popülasyonu için lekesiz bir örnek (astrositler ve mikroglia) ekleyin.
- Her hücre popülasyonu için, her lekeli ve lekesiz numune için 5 x 105 hücre ayırın. FMO için, her biri 2,5 x 105 hücre içeren diğer iki mikroglia tüpünü rezerve edin ve ayrıca 5 x 105 astrositten oluşan başka bir tüp rezerve edin.
NOT: Mikroglia sayıları sınırlayıcı bir faktör olabileceğinden, lekesiz ve FMO kontrolleri için daha az hücre kullanmak mümkündür. - 4 °C'de 5 dk için 450 x g'daki tüm mikrotüpleri santrifüj edin. Supernatant atın ve FACS tampon (fosfat tamponlu salin (PBS) + 0.5% sığır serum albumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2) 500 μL/ mikrotüp ile pelet resuspend.
- 4 °C'de 450 x g'daki tüm mikrotüpleri 5 dk. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
- Tüm mikrotüplere 500 μL/microtube FACS tampon ekleyin ve 4 °C'de 450 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın. Resuspend astrositler ve mikroglia boyama tüpleri ve ayrıca yüzey belirteçleri 50 μL / mikrotüp ile astrosit FMO tüp karışımı: anti-CD45 (PE, klon 30-F11) ve anti-CD11b (eFluor 450, klon M1/70) (her ikisi de 1: 100 FACS tampon seyreltilmiş).
- Lekelenmemiş hücreler için, aynı FAKS arabelleği hacmiyle yeniden askıya alın. Microglia FMO için, her mikroglia tüpünü anti-CD45 veya anti-CD11b ile kuluçkaya yatırın.
- Mikrotüp başına 500 μL FACS tampon ekleyin. 4 °C'de 450 x g'de 5 dakika. Süpernatant'ı atın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 100 μL/mikrotüp fiksasyon tamponu (Bkz. Malzeme Tablosunabakınız) ile peleti yeniden askıya alın.
- 500 μL/mikrotüp permeabilizasyon tamponu 1x ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 4 °C'de karanlıkta 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 4 °C'de 450 x g'daki tüm mikrotüpleri 5 dk. Resuspend astrositler ve mikroglia boyama tüpleri ve ayrıca mikroglia FMO tüpleri ile 50 μL/ mikrotüp hücre içi antikor anti-GFAP (APC, klon GA5) bir 1:100 seyreltme 1x permeabilizasyon tampon. Lekesiz hücreler ve astrosit FMO için, FACS arabelleği aynı hacimde hücreleri yeniden askıya. Tüm numuneleri karanlıkta 30 dk boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 500 μL/microtube 1x permeabilizasyon tamponu ekleyerek tüm tüpleri yıkayın. 450 x gtüm mikrotüpler santrifüj , 4 ° C'de 5 dakika için. 200 μL FACS tamponunda her mikrotüpü yeniden askıya alın. Akış sitometresi üzerinde 1 x 105 olay/örnek edinin.
- Analiz için, hücreler cd11b x CD45 ve daha sonra GFAP histogram ilk geçitli olmalıdır.
NOT: Lekesiz ve FMO denetimleri kapıları belirlemek için yararlıdır.
2. Enfeksiyon Ve Enfeksiyon Oranlarının Değerlendirilmesi
- T. gondii ile glial hücrelerin enfeksiyonu
- Plaka 3 x 104 mikroglia veya astrositler ile takviye DMEM/F12 37 °C ve 5% CO2 için 24 h önceden işlem görmüş 96-iyi düz plaka (Malzeme Tablosubakınız).
- Her hücre popülasyonuna T'den gelen takozitlerle bulaştırın. gondii RH suşu 1:1 (parazit:hücre) enfeksiyon çokluğu (MOI) ifade gondii RH suşu 200 μL / iyi takviye RPMI seyreltilmiş (%3 FBS + 0.16 mM Penisilin + 0.18 mM Streptomisin + 12.5 mM HEPES + 30 m sodyum bikarbonat, pH 7.2) (bkz. Malzemeler Tablosu). 37 °C'de ve %5 CO2'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
- Daha sonra, supernatant atın ve 100 μL / iyi% 1 paraformaldehit (PFA) PBS seyreltilmiş 4 ° C 24 saat ekleyerek hücreleri düzeltmek.
- PH 7.2'de PFA'yı 100 μL/well pBS ile değiştirin.
- PBS pH 7.2 (1:1.000) ile seyreltilmiş 50 μL/iyi DAPI (5 mg/mL) borusu ile süpernatant ve leke hücrelerinin çekirdeklerini dikkatlice çıkarın.
- DAPI boyama çözeltisini 100 μL/well pbs (pH 7.2) ile değiştirin ve floresan mikroskobu ile analiz edin.
- T. cruzi ile glial hücrelerin enfeksiyonu
- Plaka 3 x 104 mikroglia veya astrositler ile takviye DMEM/F12 37 °C ve 5% CO2 için 24 h önceden işlem görmüş 96-iyi düz plaka (Malzeme Tablosubakınız).
NOT: Enfeksiyonun her zaman noktası için farklı bir plaka kullanın. - Glial hücrelere T. cruzi Y suşundan gelen trypomastigotes ile 5:1 (parazit:hücre) 200 μL/iyi seyreltilmiş tamamlanır ve 37 °C'de inkübasyon ve 2 saat için %5 CO2.
NOT: Bu adım parazit tarafından hücre istilası için önemlidir. - Tüm supernatant çıkarın ve tüm ekstrasellüler parazitleri kaldırmak için takviye RPMI 200 μL / kuyu ekleyerek kuyuları yıkayın. Supernatant çıkarın ve taze takviye RPMI 200 μL / kuyu ekleyin.
NOT: Bu adım, yapışık hücreleri işgal etmedi tüm parazitleri kaldırmak niyetinde. - Glial hücrelerde T. cruzi replikasyon değerlendirmek için 2 saat, 48 h ve 96 h için enfekte hücreleri incubate11.
- Her zaman noktasından sonra, supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca metanol 100 μL / kuyu ile hücreleri düzeltmek ve sonra 100 μL / iyi PBS (pH 7.2) ile metanol değiştirin.
- Fiksasyondan sonra hücreleri immünoresans tadına aşağıdaki şekilde hazırlayın.
- Otofloresansı önlemek için hücreleri 100 μL/well 50 mM NH4Cl pbs (pH 8.0) ile 15 dk. 100 μL/well pbs ekleyerek hücreleri yıkayın ve hemen çıkarın (bu adımı 3 kez tekrarlayın).
- Daha sonra, 15 dk pbs seyreltilmiş% 0.5 Triton 100 μL / iyi ekleyerek hücreleri permeabilize. 100 μL / iyi PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve hemen kaldırın (bu adımı 3 kez tekrarlayın).
- Daha sonra hücre kültürünü 100 μL/well bloklama çözeltisi (%5 yağsız süt + %2 BSA PBS[pH 7.2]) ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri 100 μL/iyi PBS ekleyerek yıkayın ve hemen çıkarın (bu adımı 3 kez tekrarlayın).
- Amastigotları lekelemek için, 30 μL/well ticari olmayan monoklonal antikor (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 proteini (1:200) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklama çözeltisi seyreltilir.
- Hücreleri 100 μL/iyi PBS ekleyerek yıkayın ve hemen çıkarın (bu adımı 3 kez tekrarlayın). Plakayı 30 μL/well'de pbs'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca seyreltilmiş ikincil anti-fare antikor (1:500) ile inkübe edin.
NOT: Ticari olmayan mAb 2C2 anti-Ssp-4 proteini, São Paulo Federal Üniversitesi Mikrobiyoloji, İmmünoloji ve Parazitoloji Bölümü'nden Prof. Dr. Renato A. Mortara'nın bir hediyesidir. - PBS pH 7.2 (1:1.000) ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 dk için seyreltilmiş 50 μL/iyi DAPI (5 mg/mL) ekleyerek süpernatant ve leke çekirdeklerini dikkatlice çıkarın.
- DAPI boyama çözeltisini 100 μL/well pBS pH 7.2 ile değiştirin ve floresan mikroskopi ile analiz edin.
- Plaka 3 x 104 mikroglia veya astrositler ile takviye DMEM/F12 37 °C ve 5% CO2 için 24 h önceden işlem görmüş 96-iyi düz plaka (Malzeme Tablosubakınız).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
14. günde glial hücre kültürü(Şekil 1A)mekanik dissociasyona uğramıştır. İzole hücre popülasyonları CD11b, CD45 ve GFAP belirteçlerine göre akış sitometrisi ile analiz edildi. Astrosit popülasyonu için %89,5, mikroglia popülasyonu için %96,6 saflık tanınabiliriz(Şekil 1B). İzolasyondan sonra hücreler 96 kuyulu düz bir plakaya kaplandı ve 24 saat sonra ilgili enfeksiyon protokollerine göre T. cruzi veya T. gondii tarafından enfekte olmaya hazırdı. Burada bu glial hücrelerde enfeksiyon oranı değerlendirme bir örnek olarak T. cruzi bir zaman-ders enfeksiyon sağladı.
Astrositler ve mikroglialar (3 x 104 hücre/kuyu) MOI = 5:1 (parazit:hücre) ile 2-96 saat T. cruzi (Şekil 2)enfekte oldu. Enfeksiyon oranı immünoresans ile değerlendirildi hücre sayısı ve DNA interkalatörü (DAPI) ile boyanmış parazit sayısı sayılarak. Kısaca, T. cruzi'nin mikroglia ve astrositleri benzer oranlarda istila edebileceğini gözlemleyebiliriz. Ayrıca, T. cruzi her iki hücre tipinde çoğalır, 96 saat sonrası enfeksiyon (p.i.) en yüksek enfeksiyon oranına ulaşır. İlginçtir, at 96 h p.i. enfeksiyon oranı daha mikroglia daha astrositler daha belirgindir, mikroglia hücreleri daha verimli astrositler daha parazit çoğaltma kontrol edebiliyoruz düşündüren, daha önce açıklandığı gibi11.
Floresan muhabirleri ifade eden genetiği değiştirilmiş parazitlerin veya spesifik floresan antikorlarla etiketlenmiş parazitlerin kullanılmasının, hücre çekirdeğinden daha iyi ayırt edildiklerinden, immünfloresans mikroskobunu iyileştirebileceğini belirtmek önemlidir (Şekil 3). Ayrıca floresan parazitlerin enfeksiyon oranı akış sitometrisi gibi diğer teknikler ile belirlenebilir. Burada, ticari olmayan mAb 2C2 anti-Ssp-4 proteini(Şekil 3B)ile lekelenmiş YFP (Şekil 3A) ve T. cruzi Y suşunu oluşturan T. gondii RH suşu örnekleri sunulmuştur.
Bu protokol, sirar mikroglia ve astrositlerin birincil hücrelerinin nasıl çıkarılabileceğini, bakımını, ayrıştırılmasını ve bulaşmasını açıklar, bu da örneğin glial hücrelerin protozoa enfeksiyonuna olan bağışıklık tepkilerini kısaca açıklığa kavuştururken incelemek için güçlü bir araç olabilir. Burada.
Şekil 1: Primer astrositler ve mikroglia hücreleri. (A) Kültürün14. gününde C57BL/6 murine glial hücrelerinin görüntüleri ters mikroskop (400x) ile elde edilmiştir. Kırmızı ok astrosit tabakasını, siyah ok ise mikrogliayı gösterir. (B) Mekanik ayrışma sonrası astrositler ve mikrogliafloresan5 anti-CD11b, anti-CD45 ve anti-GFAP ile boyandı ve akış sitometrisi (1 x 105 hücre edinimi) ile değerlendirildi. Astrositler CD11b-/CD45- ve GFAP+ hücreleri olarak kabul edilirken, mikroglia CD11b + /CD45+ve GFAP- hücrelerdir.+ Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Glial hücrelerde T. cruzi enfeksiyonunun zaman-seyri. C57BL/6 farelerinden gelen astrositler ve mikroglialar T. cruzi Y (MOI = 5:1) ile enfekte edildi. 2 saat, 48 h ve 96 h sonra, odaları metanol ile sabit ve hücre çekirdeği marker DAPI (mavi) ve anti-GFAP (kırmızı) ile lekeli edildi. Görüntüler ters floresan mikroskobu (400x) ile elde edilmiştir. Hücrelerin içindeki amastigotların sayısı ve enfekte hücrelerin sıklığı floresan mikroskop yazılımı tarafından değerlendirildi (bkz. Malzeme Tablosu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Floresan protozoon parazitleri ile astrosit ve mikroglia enfeksiyonu. (A) 3 x 104 astrosit ve mikroglia C57BL/6 fareler (MOI = 1:1) T. gondii RH YFP (yeşil) ile 48 saat, odacıkları% 1 PFA ile sabit ve DAPI (mavi) ile lekeli enfekte edildi. (B) C57BL/6 farelerinden 3 x 104 astrosit ve mikroglia 96 saat boyunca T. cruzi Y ile enfekte edildi (MOI = 5:1) ve odaları saf metanol ile sabitlendi ve DAPI (yeşil) ve mAb 2C2 anti-Ssp-4 (turuncu) ile boyandı. Görüntüler ters floresan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzole glial hücre fonksiyonlarını farklı biyolojik bağlamlarda incelemenin önemi son yirmi yılda artmaktadır. Nöronlar ötesinde CNS anlamak hala hücre biyolojisinde büyüyen bir alandır, özellikle enfeksiyonlar veya inflamatuar koşullar altında8,9,,24. Glial hücreler sadece nöronlar fiziksel destek için çok önemlidir (daha önce bilindiği gibi), ama aynı zamanda nöron enerji kaynağı gibi birçok fizyolojik durumlarda, nörometabolizma, bağışıklık gözetimi, sinaptik budama, şekillendirme ve doku modülasyonu, diğerleri arasında3,25,26,27,28,29.
Astrositler ve mikroglia enfeksiyon veya steril inflamasyon sırasında farklı modüle edilebildiği için, bu glial hücrelerin bireysel ve göreceli rolünü anlamak büyük önem taşımaktadır. Mikroglia cns mononükleer fagosit sistemi temsil ettiği bilinmektedir rağmen (MPS), astrositler de CNS bağışıklık yanıtları önemli bir oyuncu olarak tarif edilmiştir8. Enfeksiyon ve / veya inflamasyon bağlamında her glial alt kümesinin rolünü karşılaştırmak için, aynı çıkarma ve koşullar bunları elde etmek zorunludur. Özellikle protozoon parazitleri açısından, enfeksiyonları kontrol etmek için mikroglia ve astrositlerin etkiveya yanıtları hakkında birkaç rapor vardır. Bu anlamda, son zamanlarda nitrik oksit içeren bir mekanizma ile astrositlerde değil, mikroglia T. cruzi replikasyon kontrolü için NLRP3 inflammasome gerekliliğini gösterdi (NO) salgı11 .11
Bu protokol, doğum sonrası (3 günlük) farelerden aynı anda en bol iki glial hücre popülasyonu, astrosit ve mikroglia ayıklama odaklanmış bir yöntemi açıklar. 3 günlükten büyük yenidoğan fareler kullanılabilir, ancak her iki hücrenin verimi zaman içinde biraz azalır deneyimli (veriler gösterilmez). Yöntemimiz astrosit ler veya mikroglia izolasyonu için daha önce tanımlanmış protokollerden farklıdır, çünkü her iki hücre tipini de aynı çıkarma da, aynı koşullar altında elde etme ve izole etme, böylece deneysel hayvanların kullanımını optimize etme ve immünolojik bağlamlarda bu hücreler için göreceli rolün incelenmesini iyileştirmeye odaklanmıştır. Ayrıca, protokolümüz aynı zamanda her iki hücre tipinin de verimini optimize etti. Verim genellikle şişe başına 3-5 x 106 astrosit ve 3-5 x 105 mikroglia'dır. T-75 şişesi başına daha fazla hayvan kullanarak daha az hücre neden diğer protokolleri ile karşılaştırın (bazı protokoller şişe başına 2-3 hayvan kullanın)30,,31.
Bu protokolün bir diğer avantajı izole astrosit ve mikroglia elde etmek için gerekli zaman. 14 gün içinde olgun mikroglia elde etmek mümkündür. Aslında, flode ve combs gösterdiği gibi, 14 günden daha eski microglia sitokins salgılama yeteneği azalmış mevcut vurgulamak önemlidir; bunu nöroimmünolojik bağlamlarda dikkate almak çok önemlidir30. Astrosit için olgun üreticileri tamamen anlaşılamamıştır olmasına rağmen, GFAP büyük ölçüde duyarlı ve aktif astrositler karakterize etmek için kullanılır. Bazı protokoller sadece 21 veya 28 günlük kültürden sonra %90 GFAP pozitif hücre düzeylerine ulaşır. Bu nedenle, 7-14 gün içinde bağışıklık sistemi duyarlı ve çoğunlukla olgun olan hücrelere sağlanan bir yöntem önerdik. Her ne kadar saflık hem astrosit31 hem de microglia30için diğer yöntemlerden daha düşük olabilir, ana odak eşlik eden bir çıkarma büyük miktarlarda mikroglia ve astrosit elde etmek oldu. Hücre popülasyonlarının saflıklarını artırmak için sütun ayrımıyla daha da sıralanabileceğini veya izole edilebildiğini anlıyoruz. Bunun için mikroglia için Iba1 veya TMEM119 gibi ek hücre belirteçleri eklenebilir; Aquaporin-4 veya S100B astrositler için, CC1 veya Oligodendrositler için O4 ve Nöronlar için NeuN22,31,32,33. Ancak protokol sonunda önemli bir hücre kaybı göz önünde bulundurulmalıdır.
Böylece, mikroglia ve astrositleri verimli ve ucuz bir protokolle elde etmek için modifiye edilmiş bir yöntem sağladık. Ayrıca, bu protokol, burada T. cruzi ve T. gondii enfeksiyonu sırasında gösterildiği gibi, nöroimmünolojik bağlamlarda glial alt kümelerin karşılaştırmalı çalışmalar alabildiği büyük bir verim avantajları sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
São Paulo Federal Üniversitesi'nden (UNIFESP) MAb 2C2 anti-Ssp-4 için Profesör Dr. Renato A. Mortara'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 2017/25942-0 k.r.b.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, hibe 402100/2016-6 K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/ CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finans Kodu 001). M.P.A. CNPq'tan burs, A.L.O.P. CAPES'ten burs, I.S.F ve L.Z.M.F.B. FAPESP'ten burs alır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M.
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
