Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi
Summary
Bu protokolün genel amacı, merkezi sinir sisteminden murine astrositi ve mikroglia hücrelerinin nasıl çıkarılabildiğini, bakımını ve ayrıştırığunu ve ardından protozoa parazitleri ile enfeksiyonun nasıl sağlanmadığını öğretmektir.
Abstract
Astrositler ve mikroglia en bol glial hücrelerdir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) fizyolojik destek ve homeostaz bakımından sorumludurlar. Bulaşıcı hastalıkların kontrolünde ki rollerinin giderek artan kanıtları, CNS’yi etkileyen enfeksiyonlara verdikleri yanıtları değerlendirmek için birincil astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için metodolojilerin geliştirilmesine olan ilgiyi haklı çıkarmaktadır. Trypanosoma cruzi (T. cruzi)ve Toxoplasma gondii (T. gondii)enfeksiyonunun CNS enfeksiyonunun etkisi göz önüne alındığında, burada ürinen astrositleri ve mikroglia hücrelerini protozoa parazitleri ile ayıklamak, korumak, ayrıştırmak ve enfekte etmek için bir yöntem salıyoruz. Yenidoğan kortekslerinden çıkarılan hücreler periyodik diferansiyel ortam replasmanı ile 14 gün boyunca in vitro olarak muhafaza edilir. Astrositler ve mikroglia mekanik ayrışma ile aynı ekstraksiyon protokolü elde edilir. Akış sitometrisi ile fenotiotipleme den sonra hücreler protozoa parazitleri ile enfekte olur. Enfeksiyon oranı farklı zaman noktalarında floresan mikroskopisi ile belirlenir, böylece glial hücrelerin diferansiyel yeteneğinin protozoan invazyonu ve replikasyonunu kontrol etme yeteneğinin değerlendirilmesi sağlar. Bu teknikler, astrositlerin ve mikroglianın enfeksiyonlara verdiği tepkileri incelemek için basit, ucuz ve verimli yöntemleri temsil eder ve daha fazla nöroimmünoloji analizi için alanı açar.
Introduction
CNS esas olarak nöronlar ve glialhücrelerdenoluşur 1,2,3. Mikroglia ve astrositler CNS en bol glia hücreleridir. Mikroglia, yerleşik makrofaj, immünyonlu ve Fagositik glia hücre CNS3,4, astrosithomeostaz korumak ve destekleyici işlevleri uygulamak için sorumlu iken5.
Glial hücreler klasik destek ve nöronların korunması sorumlu olduğu bilinen olmasına rağmen6,7, Bu hücrelerin ortaya çıkan fonksiyonları son literatürde tarif edilmiştir, enfeksiyonlara yanıtları da dahil olmak üzere8,9,10,11. Böylece, bireysel olarak işlevlerini anlamak için bu glial hücreleri izole etmek için yöntemler geliştirmek için bir itme vardır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre soyları ve in vivo modeller gibi birincil kültürler yerine glial hücreleri incelemek için bazı alternatif modeller vardır. Ancak, ölümsüzleştirilmiş hücreler genetik sürüklenme ve morfolojik değişikliklere uğrama olasılığı daha yüksektir, in vivo çalışmalar sınırlı manipülasyon koşulları empoze ederken. Tersine, birincil kültürleri işlemek kolaydır, daha iyi vivo hücrelerde benzer ve aynı zamanda bize deneysel faktörleri kontrol etmek için izin12,13. Burada, aynı protokoldeki murine astrositlerinin ve mikroglia birincil hücrelerinin nasıl ayıklandığı, bakımı ve ayrıştırılaması ile ilgili yönergeleri açıklıyoruz. Ayrıca, bu kültürlerde protozoa enfeksiyonu ile nasıl çalışılabilenlere ilişkin örnekler de salıyoruz.
Yenidoğan farelerden elde edilen CNS hücreleri (3 güne kadar) astrosit ve mikroglia hücrelerinin tercihli büyümesini sağlayan diferansiyel ortamda 14 gün boyunca kültüre alınmıştır. Mikroglia ekli astrositlerin üzerinde olduğundan, hücre popülasyonları mekanik olarak orbital inkübatörde ayrıştırıldı. Sonra, mikroglia içeren tüm supernatant toplandı ve astrositleri ayırmak için tripsin ekledi. İzole glial hücreler akış sitometrisi ile fenotipik olarak değerlendirildi ve istenilen deneye göre kaplandı.
Ayrıca bu izole mikroglia ve astrositlere protozoa parazitleri ile nasıl bulaşabileceğimize ilişkin örnekler verdik. T. gondii toksoplazmoz sorumlu bir son derece nörotropik protozoon14, T. cruzi CNS nörolojik bozuklukların gelişmesine yol açabilir Chagas hastalığından sorumlu iken15,16. Ayrıca, t. gondii17ile enfeksiyon bildirilmiştir,18 veya T. cruzi19,20,21 bağışıklık hastalarında ölüm tahmini nedeni. Bu nedenle, protozoa enfeksiyonlarının kontrolünde CNS glial hücrelerin immünolojik rolünün açıklanması büyük önem taşımaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İzole glial hücre fonksiyonlarını farklı biyolojik bağlamlarda incelemenin önemi son yirmi yılda artmaktadır. Nöronlar ötesinde CNS anlamak hala hücre biyolojisinde büyüyen bir alandır, özellikle enfeksiyonlar veya inflamatuar koşullar altında8,9,,24. Glial hücreler sadece nöronlar fiziksel destek için çok önemlidir (daha önce bilindiği gibi), ama aynı zamanda nöron enerji kaynağı gibi birçok fizyol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
São Paulo Federal Üniversitesi’nden (UNIFESP) MAb 2C2 anti-Ssp-4 için Profesör Dr. Renato A. Mortara’ya teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 2017/25942-0 k.r.b.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, hibe 402100/2016-6 K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/ CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finans Kodu 001). M.P.A. CNPq’tan burs, A.L.O.P. CAPES’ten burs, I.S.F ve L.Z.M.F.B. FAPESP’ten burs alır.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
