Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig isolering af primære astrocytter og mikroglia for protozoparasitinfektion

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

Det overordnede mål med denne protokol er at instruere, hvordan man udvinder, vedligeholder og dissociere murine astrocyt og mikrogliaceller fra centralnervesystemet, efterfulgt af infektion med protozoparasitter.

Abstract

Astrocytter og mikroglia er de mest rigelige gliaceller. De er ansvarlige for fysiologisk støtte og homøostase vedligeholdelse i centralnervesystemet (CNS). De stigende beviser for deres deltagelse i bekæmpelse af smitsomme sygdomme berettiger den nye interesse i at forbedre metoderne til isolering af primære astrocytter og mikroglia med henblik på at evaluere deres reaktioner på infektioner, der påvirker CNS. I betragtning af virkningen af Trypanosoma cruzi (T. cruzi) og Toxoplasma gondii (T. gondii)infektion i CNS, her giver vi en metode til at udtrække, vedligeholde, dissociere og inficere murine astrocytter og mikroglia celler med protozoa parasitter. Ekstraherede celler fra nyfødte cortices opretholdes in vitro i 14 dage med periodisk differentiale medier udskiftning. Astrocytter og mikroglia fremstilles af samme ekstraktionsprotokol ved mekanisk dissociation. Efter fænomærke ved flow cytometri, celler er inficeret med protozoer parasitter. Infektionsraten bestemmes ved fluorescensmikroskopi på forskellige tidspunkter, hvilket gør det muligt at vurdere gliacellers differentierede evne til at kontrollere protozoinvasion og replikation. Disse teknikker repræsenterer enkle, billige og effektive metoder til at studere svarene fra astrocytter og mikroglia til infektioner, hvilket åbner området for yderligere neuroimmunologi analyse.

Introduction

CNS består hovedsageligt af neuroner og gliaceller1,2,3. Mikroglia og astrocytter er de mest rigelige glia celler i CNS. Microglia, den hjemmehørende makrofag, er immunkompetente og fagocytiske glia celle i CNS3,4,mens astrocytter er ansvarlige for at opretholde homøostase og udøve understøttende funktioner5.

På trods af at gliaceller klassisk er kendt for at være ansvarlige for støtte og beskyttelse af neuroner6,7, er nye funktioner i disse celler blevet beskrevet i den seneste litteratur, herunder deres reaktioner på infektioner8,9,10,11. Således er der et skub til at udvikle metoder til at isolere disse gliaceller til at forstå deres funktioner individuelt.

Der er nogle alternative modeller til at studere gliaceller snarere end primære kulturer, som udødeliggjortcelleslægter og in vivo modeller. Men, udødeliggjorte celler er mere tilbøjelige til at gennemgå genetiske drivende og morfologiske ændringer, mens in vivo undersøgelser pålægge begrænset manipulation betingelser. Omvendt primære kulturer er nemme at håndtere, bedre ligne in vivo celler og også give os mulighed for at kontrollere eksperimentelle faktorer12,13. Her beskriver vi retningslinjer for, hvordan man udvinder, vedligeholder og dissocierer murineastrocytter og primære mikrogliaceller i samme protokol. Desuden giver vi også eksempler på, hvordan man arbejder med protozoinfektion i disse kulturer.

CNS celler udvundet fra neonatal mus (op til 3 dag gamle) blev dyrket i 14 dage på differentiale medier, der tillader præferencevækst af astrocytter og mikroglia celler. Da mikroglia hvile over de vedlagte astrocytter, cellepopulationer blev mekanisk adskilt i en orbital inkubator. Dernæst indsamlede vi alle supernatanten, der indeholder mikroglia og tilføjede trypsin for at frigøre astrocytter. Isolerede gliaceller blev fænotypisk evalueret ved flowcytometri og belagt i henhold til det ønskede eksperiment.

Vi gav også eksempler på, hvordan man inficerer disse isolerede mikroglia og astrocytter med protozoparasitter. T. gondii er en meget neurotropisk protozoer ansvarlig for toxoplasmose14, mens T. cruzjeg er ansvarlig for Chagas sygdom, som kan føre til udvikling af neurologiske lidelser i CNS15,16. Desuden er det også blevet rapporteret, at infektion med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den formentlig dødsårsag hos immunkompromitterede patienter. Derfor, belysning af immunologiske rolle gliaceller fra CNS i at kontrollere protozoer infektioner er af stor betydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer, der involverer mus, blev udført i overensstemmelse med den brasilianske nationale lov (11.794/2008) og godkendt af De Institutionelle Udvalg for Dyrepleje og -Anvendelse (IACUC) fra Federal University of São Paulo (UNIFESP).

1. Glial celler Udvinding, vedligeholdelse og dissociation

BEMÆRK: Antallet af mus, der anvendes til glialceller ekstraktion afhænger af mængden af celler, der kræves for at udføre de ønskede eksperimenter. I denne protokol blev der fremstillet i alt 2,7 x 107 astrocytter og 4 x 106 mikroglia fra seks neonatale C57BL/6 mus. Alle procedurer blev udført under steril tilstand i et biosikkerhedsskab i klasse II.

  1. Dag 1
    1. Forbered ren Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) og HBSS + 10% af varmeinaktiveret fosterkvægserum (FBS) (se Materialetabel).
    2. Forbered suppleret Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicillin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbikarbonat, pH 7,2) og filtrere det med et 0,22 μm filter (se Materialetabel).
      BEMÆRK: Alle dyrkningsmedier skal opbevares ved 4 °C, men det er nødvendigt at forvarme dem ved 37 °C i 20 minutter, før forsøget påbegyndes.
    3. Steriliser alle kirurgiske instrumenter (saks, spatel og pincet) i en autoklave og bruge 70% ethanol under proceduren.
    4. Sæt nyfødte (op til 3 daggamle) mus i et forseglet kammer indeholdende bomuld dyppet med isofluran i 5 min for dyb anæstesi.
    5. Spray musehvalpen med 70% ethanol og halshugge dyret med en saks.
    6. Gør sagittal cut (posteriort til anterior) med en saks langs kraniet for at åbne den og udsætte hjernen. Adskil kraniet fra hjernen ved hjælp af en pincet. Fjern hjernen ved hjælp af en mikro spatel til at opretholde hjernens integritet.
    7. Placer hjernen i en tør petriskål (6 cm i diameter). Fjern olfaktoriske pære og cerebellum ved hjælp af en mikro spatel. Flyt cortex til en anden petriskål (6 cm diameter) indeholdende HBSS + 10% FBS (2 ml/ petriskål).
    8. Skær hjernevævet i små stykker med steril saks og ved hjælp af en p1000 mikropipette overførsel hver hjernevæv med HBSS + 10% FBS til forskellige 15 ml koniske rør. Sørg for, at det endelige volumen er 2 ml/rør. Hvis ikke, komplet med HBSS + 10% FBS.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Hvis det er tilfældet, skal koniske rør med CNS-væv anbringes på is op til 1 time.
    9. Det afskårne hjernevæv vaskes med 3 ml HBSS + 10% FBS (pr. rør) og efter dekantering. Fjern forsigtigt supernatanten. Gentag dette trin 3 gange.
      BEMÆRK: Dette trin har til formål at fjerne snavs og at inddrive det udtrukne væv.
    10. Vask det afskårne hjernevæv med 3 ml ren HBSS (pr. rør) og efter dekantering fjernes forsigtigt supernatanten. Gentag dette trin 3 gange.
      BEMÆRK: Dette trin har til formål at fjerne det resterende serum fra de tidligere vasker, da cellerne vil blive trypsiniseret i næste trin.
    11. Der tilsættes 3 ml trypsin pr. rør og anbringes i et vandbad ved 37 °C i 30 min. og rørene rystes forsigtigt hvert 5.
      BEMÆRK: Dette trin har til formål at fordøje det indsamlede væv.
    12. For at inaktivere trypsinen skal vævet vaskes med 3 ml pr. rør HBSS + 10% FBS og efter dekantering af vævet forsigtigt fjernes supernatanten. Gentag dette trin 3 gange.
    13. Vask vævet med 3 ml pr. rør ren HBSS og fjern forsigtigt supernatanten. Gentag dette trin 2 gange.
    14. Der tilsættes 7 ml pr. rør ren HBSS, og vævet homogeniseres gennem successive passager i pipetter: først med den 10 ml serologiske pipette, efterfulgt af 5 ml og til sidst med p1000 mikropipetter.
    15. Efter homogenisering centrifugeres rørene ved 450 x g i 5 min ved 4 °C.
    16. Supernatanten kasseres, og pelletsen suspenderes igen med 4 ml HBSS + 10% FBS pr. rør.
    17. Overfør celler til en forbehandlet T-75 kolbe for optimal cellekulturvedhæfte (se Materialetabel).
      BEMÆRK: Procesvæv fra hvert dyr pr. kolbe.
    18. Kolben anbringes i rugemaskinen ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 min.
    19. Der tilsættes 10 ml suppleret DMEM/F12 pr. kolbe og inkuberved 37 °C og 5 % CO2.
      BEMÆRK: Det endelige volumen er 14 ml pr. kolbe.
  2. Dag 3
    1. 7 ml dyrkningsmedium fjernes fra T-75-kolben, og der tilsættes 7 ml frisk suppleret DMEM/F12.
      BEMÆRK: Kolberne vil indeholde en masse cellulære snavs og en overskyet udseende.
  3. Dag 5
    1. Alt mediet fjernes fra T-75-kolben, og der tilsættes 14 ml frisk suppleret DMEM/F12.
      BEMÆRK: Medium udskiftes fra kolberne for at fjerne snavs og celler, der ikke er klæbet.
    2. Efter hver 48 timer fjernes 6 ml supernatanten og tilsættes 7 ml frisk suppleret DMEM/F12 medium indtil kulturdagen 14.
  4. Dag 14
    1. Efter fjernelse af 6 ml supernatant og tilsætning af 7 ml frisk suppleret DMEM/F12 medium lukkes T-75-kolberne tæt.
    2. Placer dem i gulvet orbital shaker ved 200 rpm og 37 °C natten til mekanisk adskille mikroglia fra astrocytter.
  5. Dag 15
    1. Tag kolberne fra shakeren og vask dem kraftigt med deres eget medium for at optimere celledissociationen og høste det maksimale antal mikroglia. Derefter indsamles supernatanten (indeholdende mikroglia) og overføres til et 50 ml konisk rør.
    2. Dernæst tilsættes 4 ml trypsin i hver kolbe og inkuberi i 5 min ved 37 °C for at frigøre astrocytter.
    3. Der tilsættes 5 ml pr. kolbe suppleret DMEM/F12 for at inaktivere trypsinen. Kolberne vaskes med eget medium og overfører indholdet til et konisk 50 ml rør.
    4. Alle rør, der indeholder dissocieret mikroglia og astrocytter, centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Kassér supernatanten. Resuspender mikrogliapelleten i 1 ml og astrocytterne i 10 ml suppleret DMEM/F12.
    6. Fortsæt til celletælling i et Neubauer-kammer eller en automatisk celletæller. Plader cellerne med suppleret DMEM/F12 ved den ønskede massefylde i en passende fladbundcellekulturplade (forbehandlet for optimal celletilbehør; se Materialetabel). Inkuberceller ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer for at give dem mulighed for at fastgøre.
      BEMÆRK: Reserve 1,5 x 106 af hver cellepopulation for at bekræfte deres renhed ved flowcytometri.
    7. Udfør en flow cytometrisk analyse for at kontrollere renheden af cellepopulationer.
      BEMÆRK: Vi betragter microglia CD11b+/CD45+/GFAP- og astrocytter CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 og TMEM119 farvning kan overvejes for fuldt ud at karakterisere mikroglia22.
    8. Der tilsættes en FMO (Fluorescens minus 1)23 og en ubeholdt prøve for hver cellepopulation (astrocytter og mikroglia) som kontrol af flowcytometrianalyse.
    9. For hver cellepopulation reserveres 5 x 105 celler for hver farvede og ufarvede prøver. For FMO skal to andre rør af mikroglia indeholdende 2,5 x 105 celler hver og også reservere et andet rør på 5 x 105 astrocytter.
      BEMÆRK: Da mikroglianumre kan være en begrænsende faktor, er det muligt at bruge færre celler til ubesværede og FMO-kontroller.
    10. Alle mikrorør centrifugeres ved 450 x g i 5 min ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelletsen suspenderes igen med 500 μL/mikrorør af FACS-buffer (fosfat-buffered saltvand (PBS) + 0,5% kvægserumalbumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).
    11. Alle mikrorør centrifugeres ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes igen med 100 μL/mikrorør anti-CD16/CD32 (klon 93) (1:50), der fortyndes i FACS-bufferen. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    12. 500 μL/mikrorør af FACS-buffer ender i alle mikrorør, og der centrifugeres ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Supernatanten kasseres. Resuspender astrocytter og mikroglia farvningsrør og også astrocyte FMO-rør med 50 μL/mikrorør af overflademarkører mix: anti-CD45 (PE, klon 30-F11) og anti-CD11b (eFluor 450, klon M1/70) (begge fortyndet ved 1: 100 i FACS buffer).
    13. For ubejdsede celler skal du suspendere med samme volumen FACS-buffer. For mikroglia FMO inkuberes hvert mikrogliarør med anti-CD45 eller anti-CD11b. Inkuberalle prøver ved 4 °C i 20 minutter i mørke.
    14. Der tilsættes 500 μL FACS-buffer pr. mikrorør. Der centrifugeres ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes igen med 100 μL/mikrorør fikseringsbuffer(se Materialetabel) i 20 min. Supernatanten kasseres, og pelleten suspenderes igen med 100 μL/mikrorør fikseringsbuffer (se Materialetabel ) i 20 min. Ved stuetemperatur i mørke.
    15. Der tilsættes 500 μL/mikrorør permeabiliseringsbuffer 1x (se Materialetabel)og inkuberes ved 4 °C i 5 minutter i mørke.
    16. Mikrorørene centrifugeres ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Supernatanten kasseres. Resuspender astrocytter og mikroglia farvningsrør og også mikroglia FMO-rør med 50 μL/mikrorør af intracellulært antistof anti-GFAP (APC, klon GA5) i en 1:100 fortynding i 1x permeabiliseringsbuffer. For ufarvede celler og astrocyt FMO suspenderes cellerne med samme volumen FACS-buffer. Inkuber alle prøver ved 4 °C i 30 min. i mørke.
    17. Alle rør vaskes ved tilsætning af 500 μL/microtube med 1x permeabiliseringsbuffer. Mikrorørene centrifugeres ved 450 x gi 5 min ved 4 °C. Resuspender hvert mikrorør i 200 μL FACS buffer. Der anbringes 1 x 105 hændelser/prøve på flowcytometeret.
    18. Til analyse skal celler først være gated på CD11b x CD45 og derefter GFAP histogram.
      BEMÆRK: Ubejdende og FMO-kontroller er nyttige til at bestemme porte.

2. Infektion og evaluering af infektionsrater

  1. Infektion af gliaceller med T. gondii
    1. Plade 3 x 104 mikroglia eller astrocytter med suppleret DMEM/F12 ved 37 °C og 5% CO2 for 24 timer i en forbehandlet 96-brønd flad plade (se Materialetabel).
    2. Hver cellepopulation med tachyzoiter fra T. gondii RH stamme udtrykker gulfluorescerende protein (YFP) ved en mangfoldighed af infektion (MOI) af 1:1 (parasit:celle) fortyndet i 200 μL/brønd af suppleret RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicillin + 0,18 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbicarbonat pH 7.2) (se Materialetabel). Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 i 48 timer.
    3. Derefter kasseres supernatanten og cellerne fastgøres ved tilsætning af 100 μL/brønd af 1% paraformaldehyd (PFA), der fortyndes i PBS ved 4 °C i 24 timer.
    4. Udskift PFA med 100 μL/brønd af PBS ved pH 7.2.
    5. Supernatanten og pletterincellernes kerner fjernes forsigtigt ved at pipettere 50 μL/brønd en DAPI (5 mg/ml), der fortyndes i PBS pH 7.2 (1:1.000) i 1 min ved stuetemperatur i mørke.
    6. Udskift DAPI-farvningsopløsningen med 100 μL/brønd af PBS (pH 7.2) og analysér den ved fluorescensmikroskopi.
  2. Infektion af gliaceller med T. cruzi
    1. Plade 3 x 104 mikroglia eller astrocytter med suppleret DMEM/F12 ved 37 °C og 5% CO2 for 24 timer i en forbehandlet 96-brønd flad plade (se Materialetabel).
      BEMÆRK: For hvert tidspunkt af infektion, skal du bruge en anden plade.
    2. Glialcellerne inficeres med trypomastigotes fra T. cruzi Y stamme ved en MOI på 5:1 (parasitter:celle) fortyndet i 200 μL/brønd af suppleret RPMI og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 for 2 timer.
      BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for parasittens celleinvasion.
    3. Alle supernatanten fjernes, og brøndene vaskes ved at tilsætte 200 μL/brønd af suppleret RPMI for at fjerne alle de ekstracellulære parasitter. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 200 μL/brønd af frisk suppleret RPMI.
      BEMÆRK: Dette trin har til hensigt at fjerne alle parasitter, der ikke invaderede de tiltroede celler.
    4. Inkuber inficerede celler i 2 timer, 48 timer og 96 timer for at evaluere T. cruzi replikation i gliaceller11.
    5. Efter hvert tidspunkt fjernes supernatanten, og cellerne fastgøres med 100 μL/brønd methanol i 15 minutter ved stuetemperatur, og derefter udskiftes methanol med 100 μL/brønd af PBS (pH 7.2).
    6. Efter fiksering forberedes cellerne til immunofluorescensanalysen på følgende måde.
      1. For at undgå autofluorescens skal cellerne med 100 μL/brønd på 50 mM NH4Cl fortyndet i PBS (pH 8.0) behandles i 15 min. Cellerne tilføres 100 μL/brønd af PBS og straks fjernes (gentag dette trin 3 gange).
      2. Dernæst permeabiliseres cellerne ved at tilsætte 100 μL/brønd på 0,5% Triton fortyndet i PBS i 15 min. Vask celler ved tilsætning af 100 μL/brønd af PBS og fjern det straks (gentag dette trin 3 gange).
      3. Derefter inkuberes cellekulturen med 100 μL/brønd af blokerende opløsning (5% fedtfri mælk + 2% BSA fortyndet i PBS [pH 7.2]) i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne vaskes ved tilsætning af 100 μL/brønd af PBS, og fjern det straks (gentag dette trin 3 gange).
      4. For at plette amastigoter inkuberes med 30 μL/brønd af ikke-kommercielmonoklonalt antistof (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 protein (1:200) fortyndet i blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
      5. Cellerne vaskes ved tilsætning af 100 μL/brønd af PBS, og fjern det straks (gentag dette trin 3 gange). Inkuberpladen med 30 μL/brønd af sekundært antimuseantistof (1:500) fortyndet i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
        BEMÆRK: Den ikke-kommercielle mAb 2C2 anti-Ssp-4 protein var en slags gave fra Prof. Dr. Renato A. Mortara fra Institut for Mikrobiologi, Immunologi og Parasitologi af Federal University of São Paulo.
      6. Supernatanten og pletkernerne fjernes forsigtigt ved tilsætning af 50 μL/brønd af DAPI (5 mg/ml), der fortyndes i PBS pH 7.2 (1:1.000) i 1 min ved stuetemperatur i mørke.
      7. Udskift DAPI-farvningsopløsningen med 100 μL/brønd af PBS pH 7.2, og analysér den ved fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

dag gennemgikth glialcellekultur (Figur 1A) mekanisk dissociation. Isolerede cellepopulationer blev analyseret af flow cytometri i henhold til CD11b, CD45 og GFAP markører. Vi kunne observere en renhed på 89,5% for astrocytpopulationen og 96,6% for mikrogliapopulationen (figur 1B). Efter isolering, celler blev belagt i en 96-godt flad plade og efter 24 timer de var klar til at blive smittet med T. cruzi eller T. gondii i henhold til de respektive infektion protokoller. Her gav vi en time-kursus infektion af T. cruzi som et eksempel på infektion sats evaluering i disse gliaceller.

Astrocytter og mikroglia (3 x 104 celler/brønd) blev inficeret med T. cruzi ved MOI = 5:1 (parasitter:celle) i 2-96 timer (Figur 2). Infektionsraten blev evalueret ved immunfluorescens ved at tælle antallet af celler og antallet af parasitter, der var plettet med en DNA-intercalator (DAPI). Kort, vi kunne observere, at T. cruzi er i stand til at invadere mikroglia og astrocytter på lignende satser. Desuden, T. cruzi replikerer i begge celletyper, nå den højeste infektion sats på 96 h post infektion (p.i.). Interessant, på 96 h p.i. infektionen sats er mere udtalt i astrocytter end i mikroglia, hvilket tyder på, at mikroglia celler er i stand til at kontrollere parasitten replikation mere effektivt end astrocytter, som vi tidligere har beskrevet11.

Det er vigtigt at bemærke, at anvendelsen af genetisk modificerede parasitter, der udtrykker fluorescerende journalister eller parasitter mærket med specifikke fluorescerende antistoffer, kan forbedre mikroskopiet ved immunfluorescens, da de adskiller sig bedre fra cellekernen (figur 3). Desuden kan infektionsraten for fluorescerende parasitter bestemmes af andre teknikker såsom flowcytometri. Her gav vi eksempler på T. gondii RH stamme konstituerende udtrykke YFP (Figur 3A) og T. cruzi Y stamme plettet med ikke-kommercielle mAb 2C2 anti-Ssp-4 protein (Figur 3B).

Alt i alt beskriver denne protokol, hvordan man udvinder, vedligeholder, dissociere og inficerer murine mikroglia- og astrocytter primære celler, hvilket kunne være et effektivt redskab til at studere f.eks. Her.

Figure 1
Figur 1: Primære astrocytter og mikrogliaceller. (A) Billeder af C57BL/6 murine glialceller på kulturdagen blev fremstillet ved omvendt mikroskop (400x).th Den røde pil angiver laget af astrocytter, og den sorte pil angiver mikrogliaen. (B) Efter mekanisk dissociation blev astrocytter og mikroglia farves (5 x 105 celler) med fluorescerende anti-CD11b, anti-CD45 og anti-GFAP og evalueret ved flowcytometri (1 x 105 celler erhvervelse). Astrocytter betragtes som CD11b-/CD45- og GFAP+ celler, mens mikroglia er CD11b+/CD45+ og GFAP- celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Tidsforløb for T. cruzi infektion i gliaceller. Astrocytter og mikroglia fra C57BL/6 mus blev inficeret med T. cruzi Y (MOI = 5:1). Efter 2 timer, 48 timer og 96 timer blev kamrene fastgjort med methanol og plettet med cellekernemarkør DAPI (blå) og anti-GFAP (rød). Billeder blev opnået ved inverteret fluorescensmikroskop (400x). Antallet af amastigoter inde i cellerne og hyppigheden af inficerede celler blev evalueret af fluorescensmikroskopsoftwaren (se Materialetabel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Astrocytter og mikrogliainfektion med fluorescerende protozoparasitter. (A) 3 x 104 astrocytter og mikroglia fra C57BL/6 mus blev inficeret (MOI = 1:1) med T. gondii RH YFP (grøn) i 48 timer, kamre blev fastgjort med 1% PFA og plettet med DAPI (blå). (B) 3 x 104 astrocytter og mikroglia fra C57BL/6 mus blev inficeret (MOI = 5:1) med T. cruzi Y i 96 timer, og kamre blev fastgjort med ren methanol og farves med DAPI (grøn) og mAb 2C2 anti-Ssp-4 (orange). Billeder blev erhvervet ved hjælp af en omvendt fluorescens mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydningen af at studere isolerede gliaceller funktioner i forskellige biologiske sammenhænge har været stigende i de sidste to årtier. Forståelse af CNS ud neuroner er stadig et voksende område i cellebiologi, især under infektioner eller inflammatoriske tilstande8,9,24. Gliaceller er afgørende ikke kun for neuroner fysisk støtte (som det tidligere var kendt), men også i mange andre fysiologiske situationer såsom neuron energiforsyning, neurometabolisme, immunovervågning, synaptisk beskæring, forme og modulering af vævet, blandt andre3,25,26,27,28,29.

Da astrocytter og mikroglia kan moduleres differentieret under infektion eller steril inflammation, er det af stor betydning at forstå den individuelle og relative rolle af disse gliaceller. Selv om mikroglia er kendt for at repræsentere det mononukleare fagocytsystem (MPS) i CNS, er astrocytter også blevet beskrevet som en central aktør i CNS immunresponser8. For at sammenligne den rolle, som hver glial delmængde i forbindelse med infektion og / eller betændelse, er det obligatorisk at få dem fra samme ekstraktion og betingelser. Der er få rapporter om effektor reaktioner af mikroglia og astrocytter til at kontrollere infektioner, især med hensyn til protozoiske parasitter. I denne forstand har vi for nylig vist kravet om NLRP3 inflammasome til kontrol af T. cruzi replikation i mikroglia, men ikke i astrocytter ved en mekanisme, der involverer nitrogenoxid (NO) sekretion11.

Denne protokol beskriver en metode, der er fokuseret på samtidig at udvinde de to mest rigelige gliaceller populationer, astrocytter og mikroglia, fra postnatal (op til 3-dages gamle) mus. Nyfødte mus ældre end 3-dages gamle kan bruges, men vi oplevede, at udbyttet af begge celler falder lidt over tid (data ikke vist). Vores metode adskiller sig fra tidligere beskrevne protokoller for astrocytter eller mikrogliaisolation, fordi vi fokuserede på at opnå og isolere begge celletyper i samme ekstraktion under de samme betingelser, hvilket optimerer brugen af forsøgsdyr og forbedrer studiet af den relative rolle for disse celler i immunologiske sammenhænge. Desuden optimerede vores protokol også udbyttet af begge celletyper. Udbyttet er normalt 3-5 x 106 astrocytter og 3-5 x 105 mikroglia pr. kolbe. Sammenlign dette med andre protokoller, der resulterer i færre celler ved hjælp af flere dyr pr. T-75 kolbe (nogle protokoller bruger 2-3 dyr pr. kolbe)30,31.

En anden fordel ved denne protokol er den tid, der kræves for at opnå isolerede astrocytter og mikroglia. Inden for 14 dage er det muligt at opnå moden mikroglia. Faktisk er det vigtigt at understrege, at, som Flode og Combs vist, mikroglia ældre end 14 dage nuværende formindsket evne til at udskille cytokiner; det er meget vigtigt at overveje dette i neuroimmunologiske sammenhænge30. Trods det faktum, at de modne beslutningstagere for astrocyt ikke er helt forstået, GFAP er i vid udstrækning bruges til at karakterisere lydhør og aktiv astrocytter. Nogle protokoller opnå niveauer af 90% GFAP positive celler først efter 21 eller 28 dage af kultur. Af denne grund foreslog vi en metode, der leveres, celler, der er immunresponsive og for det meste modne inden for 7-14 dage. Selv om renheden kan være lavere end andre metoder for både astrocyt31 og microglia30, var hovedfokus at opnå mikroglia og astrocytter i større mængder i en samtidig ekstraktion. Vi forstår, at cellepopulationer kunne sorteres yderligere eller isoleres med kolonneadskillelse for at forbedre deres renselighed. Til dette formål kan yderligere cellemarkører medtages, såsom Iba1 eller TMEM119 for mikroglia; Aquaporin-4 eller S100B for astrocytter, CC1 eller O4 for oligodendrocytes og NeuN for neuroner22,31,32,33. Der bør dog tages hensyn til et vigtigt celletab ved protokollens afslutning.

Således gav vi en modificeret metode til samtidig at opnå mikroglia og astrocytter i en effektiv og billig protokol. Desuden giver denne protokol fordelene ved et stort udbytte, der gør det muligt at foretage sammenlignende undersøgelser af gliale delmængder i neuroimmunologiske sammenhænge, som illustreret her under T. cruzi- og T. gondii-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke professor Dr. Renato A. Mortara fra Federal University of São Paulo (UNIFESP) for mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, tilskud 2017/25942-0 til K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, tilskud 402100/2016-6 til K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finanskode 001). M.P.A. modtager stipendium fra CNPq, A.L.O.P. modtager stipendium fra CAPES, og I.S.F og L.Z.M.F.B. modtager stipendium fra FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Tags

Immunologi og infektion Problem 157 Glia celler astrocytter mikroglia protozoinfektion T. cruzi T. gondii
Samtidig isolering af primære astrocytter og mikroglia for protozoparasitinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter