Summary
Het algemene doel van dit protocol is om te instrueren hoe te extraheren, te onderhouden, en scheiden murine astrocyt en microglia cellen uit het centrale zenuwstelsel, gevolgd door infectie met protozoa parasieten.
Abstract
Astrocyten en microglia zijn de meest voorkomende gliacellen. Zij zijn verantwoordelijk voor fysiologische ondersteuning en homeostase onderhoud in het centrale zenuwstelsel (CNS). De toenemende bewijzen van hun betrokkenheid bij de bestrijding van infectieziekten rechtvaardigen de opkomende interesse in de verbetering van methodologieën om primaire astrocyten en microglia te isoleren om hun reacties op infecties die het CNS beïnvloeden te evalueren. Gezien de impact van Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en Toxoplasma gondii (T. gondii) infectie in het CNS, hier bieden we een methode om murine astrocyten en microglia-parasieten te extraheren, te onderhouden, te scheiden en te infecteren. Geëxtraheerde cellen uit pasgeboren cortices worden gedurende 14 dagen in vitro onderhouden met periodieke differentiële mediavervanging. Astrocyten en microglia worden verkregen uit hetzelfde extractieprotocol door mechanische dissociatie. Na fenotypering door stromingscytometrie zijn cellen besmet met protozoaparasieten. Het infectiepercentage wordt bepaald door fluorescentiemicroscopie op verschillende tijdspunten, waardoor de evaluatie van het differentieelvermogen van gliacellen om protozoan invasie en replicatie te controleren. Deze technieken vertegenwoordigen eenvoudige, goedkope en efficiënte methoden om de reacties van astrocyten en microglia op infecties te bestuderen, waardoor het veld wordt geopend voor verdere neuroimmunologie-analyse.
Introduction
Het CNS bestaat voornamelijk uit neuronen en gliacellen1,2,3. Microglia en astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in het CNS. Microglia, de resident macrofaag, is de immunocompetente en de fagocytische glia cel in de CNS3,4, terwijl astrocyten zijn verantwoordelijk voor het behoud van homeostase en oefenen ondersteunende functies5.
Ondanks de klassieke gliacellen die verantwoordelijk zijn voor de ondersteuning en bescherming van neuronen6,7, zijn in de recente literatuur opkomende functies van deze cellen beschreven, inclusief hun reacties op infecties8,9,10,11. Zo is er een push om methoden te ontwikkelen om deze gliacellen te isoleren om hun functies individueel te begrijpen.
Er zijn een aantal alternatieve modellen om gliacellen te bestuderen in plaats van primaire culturen, zoals vereeuwigde cellijnen en in vivo modellen. Vereeuwigde cellen hebben echter meer kans op genetische drifting en morfologische veranderingen, terwijl in vivo studies beperkte manipulatievoorwaarden opleggen. Omgekeerd zijn primaire culturen gemakkelijk te hanteren, lijken we beter op in vivo cellen en stellen ons ook in staat om experimentele factoren12,13te beheersen. Hier beschrijven we richtlijnen voor het extraheren, onderhouden en scheiden van murine-astrocyten en microglia primaire cellen in hetzelfde protocol. Verder geven we ook voorbeelden over hoe te werken met protozoa-infectie in deze culturen.
CNS-cellen geëxtraheerd uit neonatale muizen (tot 3 dagen oud) werden gekweekt voor 14 dagen op differentiële media die de preferentiële groei van astrocyten en microglia cellen mogelijk maakt. Sinds microglia rust boven de bijgevoegde astrocyten, werden de celpopulaties mechanisch gescheiden in een orbitale incubator. Vervolgens verzamelden we alle supernatant met microglia en voegdetrypsine toe om astrocyten los te maken. Geïsoleerde gliacellen werden fenotypisch geëvalueerd door stromingscytometrie en verguld volgens het gewenste experiment.
We hebben ook voorbeelden gegeven over hoe deze geïsoleerde microglia en astrocyten te infecteren met protozoa parasieten. T. gondii is een zeer neurotrope protozoan die verantwoordelijk is voor toxoplasmose14, terwijl T. cruzi verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas die kan leiden tot de ontwikkeling van neurologische aandoeningen in de CNS15,16. Verder is ook gemeld dat infectie met T. gondii17,18 of T. cruzi19,20,,21 de vermoedelijke doodsoorzaak waren bij immuungecompromitteerde patiënten. Daarom is de opheldering van immunologische rol van gliacellen van het CNS bij het beheersen van protozoa-infecties van groot belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures waarbij muizen betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Braziliaanse nationale wet (11.794/2008) en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) van de Federale Universiteit van São Paulo (UNIFESP).
1. Glial Cells Extractie, Onderhoud en Dissociatie
OPMERKING: Het aantal muizen dat wordt gebruikt voor de extractie van gliacellen is afhankelijk van de hoeveelheid cellen die nodig zijn om de gewenste experimenten uit te voeren. In dit protocol werden in totaal 2,7 x 107 astrocyten en 4 x 106 microglia verkregen uit zes neonatale C57BL/6 muizen. Alle procedures werden uitgevoerd onder steriele toestand in een klasse II biosafety kabinet.
- Dag 1
- Bereid de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en HBSS van pure Hank + 10% van warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) (zie Materiaaltafel).
- Bereid aangevuld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicilline + 0,09 mM Streptomycine + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbicarbonaat, pH 7.2) en filtreer het met een 0,22 μm filter (zie Materiaaltafel).
OPMERKING: Alle kweekmedia moeten bij 4 °C worden opgeslagen, maar het is noodzakelijk om ze gedurende 20 minuten bij 37 °C voor te verwarmen voordat met het experiment wordt begonnen. - Steriliseer alle chirurgische instrumenten (schaar, spatel en pincet) in een autoclave en gebruik 70% ethanol tijdens de procedure.
- Leg pasgeborenen (tot 3 dagen oud) muizen in een verzegelde kamer met katoen gedrenkt met isofluraan gedurende 5 minuten voor diepe anesthesie.
- Spray de muispup met 70% ethanol en onthoofd het dier met een schaar.
- Maak sagittale snede (achterste naar voorste) met een schaar langs de schedel om het te openen en bloot de hersenen. Scheid de schedel van de hersenen met behulp van een pincet. Verwijder de hersenen met behulp van een micro spatel om de integriteit van de hersenen te behouden.
- Plaats de hersenen in een droge petrischaal (6 cm diameter). Verwijder de olfactorische bol en cerebellum met behulp van een microspatel. Verplaats de cortex naar een andere petrischaal (6 cm diameter) met HBSS + 10% FBS (2 mL/petrischaal).
- Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes met steriele schaar en met behulp van een p1000 micropipet overdracht van elk hersenweefsel met HBSS + 10% FBS naar verschillende 15 mL conische buizen. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume 2 mL/buis is. Zo niet, compleet met HBSS + 10% FBS.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. In dat dan moeten conische buizen met CNS-weefsel tot 1 uur op ijs worden geplaatst. - Was het gesneden hersenweefsel met 3 mL HBSS + 10% FBS (per buis) en na decantatie. Verwijder voorzichtig de supernatant. Herhaal deze stap 3 keer.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het puin te verwijderen en het geëxtraheerde weefsel te herstellen. - Was het gesneden hersenweefsel met 3 mL pure HBSS (per buis) en verwijder na decantatie voorzichtig het supernatant. Herhaal deze stap 3 keer.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het resterende serum uit de vorige wasbeurten te verwijderen, omdat cellen in de volgende stap worden geprobeerd. - Voeg 3 mL trypsine per buis toe en plaats in een waterbad op 37 °C gedurende 30 min, zachtjes schudden van de buizen om de 5 min. Vermijd bubbels door het omkeren of abrupt mengen van de buizen.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het verzamelde weefsel te verteren. - Om de trypsine te inactiveren, was het weefsel met 3 mL per buis HBSS + 10% FBS en verwijder na decantatie van het weefsel het supernatant voorzichtig. Herhaal deze stap 3 keer.
- Was het weefsel met 3 mL per tube pure HBSS en verwijder de supernatant voorzichtig. Herhaal deze stap 2 keer.
- Voeg 7 mL per buis pure HBSS toe en homogeniseer het weefsel via opeenvolgende passages in pipetten: eerst met de 10 mL serologische pipet, gevolgd door de 5 mL en tenslotte met de p1000 micropipet.
- Centrifugeerbuizen na homogenisatie op 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg en stouw de pellet opnieuw met 4 mL HBSS + 10% FBS per buis.
- Cellen overbrengen naar een voorbehandelde T-75-kolf voor optimale hechting van de celkweek (zie Tabel van materialen).
OPMERKING: Verwerk weefsel van elk dier per kolf. - Plaats de kolf in de couveuse op 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min voor hechting.
- Voeg 10 mL aangevulde DMEM/F12 per kolf toe en incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
LET OP: Het uiteindelijke volume is 14 mL per kolf.
- Dag 3
- Verwijder 7 mL kweekmedium uit de T-75 kolf en voeg 7 mL vers aangevulde DMEM/F12 toe.
LET OP: De kolven bevatten veel cellulair puin en een troebel uiterlijk.
- Verwijder 7 mL kweekmedium uit de T-75 kolf en voeg 7 mL vers aangevulde DMEM/F12 toe.
- Dag 5
- Haal al het medium uit de T-75 kolf en voeg 14 mL verse aangevulde DMEM/F12 toe.
OPMERKING: Medium wordt uit de kolven vervangen om vuil en niet-aanhangende cellen te verwijderen. - Verwijder na elke 48 uur 6 mL van de supernatant en voeg 7 mL vers aangevuld DMEM/F12 medium toe tot dag 14 van cultuur.
- Haal al het medium uit de T-75 kolf en voeg 14 mL verse aangevulde DMEM/F12 toe.
- Dag 14
- Na het verwijderen van 6 mL van de supernatant en het toevoegen van 7 mL vers aangevuld DMEM/F12 medium, sluit de T-75 kolven stevig.
- Plaats ze in de vloer orbitale shaker bij 200 rpm en 37 °C 's nachts mechanisch scheiden microglia van astrocyten.
- Dag 15
- Neem de kolven van de shaker en was ze krachtig met hun eigen medium om de celdissociatie te optimaliseren en het maximale aantal microglia te oogsten. Verzamel vervolgens de supernatant (met microglia) en breng over op een conische buis van 50 mL.
- Voeg vervolgens 4 mL trypsine toe aan elke kolf en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C om de astrocyten los te maken.
- Voeg 5 mL per kolf van aangevulde DMEM/F12 toe om de trypsine te activeren. Was de kolven met hun eigen medium en breng de inhoud over op een conische buis van 50 mL.
- Centrifugeer alle buizen die gescheiden microglia en astrocyten bevatten bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg. Resuspend de microglia pellet in 1 mL en de astrocyten in 10 mL van aangevuld DMEM/F12.
- Ga naar celtelling in een Neubauer-kamer of een automatisch celteller. Plaat de cellen met aangevulde DMEM/F12 bij de gewenste dichtheid in een aangewezen vlakke bodemcelcultuurplaat (voorbehandeld voor optimale celgehechtheid; zie Lijst van Materialen). Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur om ze te kunnen hechten.
OPMERKING: Reserveer 1,5 x 106 van elke celpopulatie om hun zuiverheid te bevestigen door stromingscytometrie. - Voer een stroomcytometrische analyse uit om de zuiverheid van celpopulaties te verifiëren.
OPMERKING: We beschouwen microglia CD11b+/CD45+/GFAP- en astrocyten CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 en TMEM119 kleuring kunnen worden overwogen om volledig te karakteriseren microglia22. - Voeg een FMO (Fluorescentie Minus One)23 en een niet-bevlekt monster voor elke celpopulatie (astrocyten en microglia) als controles van flow cytometrie test.
- Reserveer voor elke celpopulatie 5 x 105 cellen voor elke bevlekte en niet-bevlekte monsters. Reserveer voor FMO twee andere buisjes microglia met elk 2,5 x 105 cellen en reserveer ook een andere buis van 5 x 105 astrocyten.
OPMERKING: Aangezien microglia-getallen een beperkende factor kunnen zijn, is het mogelijk om minder cellen te gebruiken voor onbevlekte en FMO-besturingselementen. - Centrifugeer alle microbuisjes op 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en stozweef de pellet opnieuw met 500 μL/microtube FACS-buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% runderserumalbumine (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).
- Centrifugeer alle microtubes op 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en stoof de pellet opnieuw op met 100 μL/microtube anti-CD16/CD32 (kloon 93) (1:50) verdund in FACS buffer. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 500 μL/microtube FACS buffer toe aan alle microtubes en centrifugeer bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg. Gooi de supernatant weg. Resuspend astrocyten en microglia kleurbuizen en ook astrocyte FMO buis met 50 μL/microtube van oppervlakte markers mix: anti-CD45 (PE, kloon 30-F11) en anti-CD11b (eFluor 450, kloon M1/70) (beide verdund op 1: 100 in FACS buffer).
- Voor niet-gekleurde cellen, opnieuw onderbreken met hetzelfde volume van FACS buffer. Voor microglia FMO, incubeer elke microglia buis met anti-CD45 of anti-CD11b. Incubeer alle monsters op 4 °C gedurende 20 min in het donker.
- Voeg 500 μL FACS buffer per microtube toe. Centrifugeer bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en stoof de pellet opnieuw op met 100 μL/microtube fixatiebuffer (zie Materiaaltafel)gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 500 μL/microtube permeabilisatiebuffer 1x toe (zie Materiaaltafel)en incubeer bij 4 °C gedurende 5 min in het donker.
- Centrifugeer alle microtubes op 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg. Resuspend astrocyten en microglia kleurbuizen en ook microglia FMO buizen met 50 μL/microtube van intracellulaire antilichaam anti-GFAP (APC, kloon GA5) in een 1:100 verdunning in 1x permeabilisatie buffer. Voor niet-bevlekte cellen en astrocyte FMO, resuspend de cellen met hetzelfde volume van FACS buffer. Incubeer alle monsters bij 4 °C gedurende 30 min in het donker.
- Was alle buizen door 500 μL/microtube van 1x permeabilisatiebuffer toe te voegen. Centrifugeer alle microtubes op 450 x g,gedurende 5 min bij 4 °C. Hang elke microbuis opnieuw op in 200 μL FACS-buffer. Verwerf 1 x 105 gebeurtenissen/sample op de flow cytometer.
- Voor analyse moeten cellen eerst worden afgesloten op CD11b x CD45 en vervolgens GFAP histogram.
OPMERKING: Unstained en FMO-besturingselementen zijn handig om poorten te bepalen.
2. Infectie en evaluatie van infectiepercentages
- Infectie van gliacellen met T. gondii
- Plaat 3 x 104 microglia of astrocyten met aangevulde DMEM/F12 bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur in een voorbehandelde 96-put platte plaat (zie Tabel van materialen).
- Infecteer elke celpopulatie met tachyzonieten van T. gondii RH-stam die geel fluorescerend eiwit (YFP) uitdrukt bij een veelheid aan infectie (MOI) van 1:1 (parasiet:cel) verdund in 200 μL/put van aangevulde RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicilline + 0,18 mM Streptomycine + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbicarbonaat, pH 7,2) (zie Tabel van materialen). Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
- Gooi vervolgens de supernatant weg en bevestig de cellen door 100 μL/well van 1% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen die in PBS wordt verdund bij 4 °C gedurende 24 uur.
- Vervang PFA door 100 μL/well van PBS bij pH 7.2.
- Verwijder voorzichtig de supernatant en vlekcellen kernen door 50 μL/well van DAPI (5 mg/mL) verdund in PBS pH 7.2 (1:1.000) gedurende 1 min bij kamertemperatuur in het donker te pipetteren.
- Vervang DAPI-kleuringsoplossing door 100 μL/well van PBS (pH 7.2) en analyseer deze door fluorescentiemicroscopie.
- Infectie van gliacellen met T. cruzi
- Plaat 3 x 104 microglia of astrocyten met aangevulde DMEM/F12 bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur in een voorbehandelde 96-put platte plaat (zie Tabel van materialen).
OPMERKING: Gebruik voor elk moment van infectie een andere plaat. - Infecteer de gliacellen met trypomastigoten van T. cruzi Y-stam bij een MOI van 5:1 (parasieten:cel) verdund in 200 μL/bron van aangevulde RPMI en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur.
OPMERKING: Deze stap is belangrijk voor de celinvasie door de parasiet. - Verwijder alle supernatant en was de putten door het toevoegen van 200 μL / goed van aangevuld RPMI om alle extracellulaire parasieten te verwijderen. Verwijder supernatant en voeg 200 μL/put van verse aangevuld RPMI toe.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om alle parasieten te verwijderen die de aanhangende cellen niet hebben binnengevallen. - Incubeer geïnfecteerde cellen gedurende 2 uur, 48 uur en 96 uur om T. cruzi-replicatie in gliacellen11te evalueren.
- Verwijder na elk tijdspunt de supernatant en bevestig de cellen met 100 μL/well methanol gedurende 15 min bij kamertemperatuur en vervang methanol vervolgens door 100 μL/well van PBS (pH 7.2).
- Bereid de cellen na fixatie als volgt voor op de immunofluorescentietest.
- Om autofluorescentie te voorkomen, behandel de cellen met 100 μL/well van 50 mM NH4Cl verdund in PBS (pH 8.0) gedurende 15 min. Was de cellen door 100 μL/well van PBS toe te voegen en verwijder deze onmiddellijk (herhaal deze stap 3 keer).
- Vervolgens permeabilize de cellen door toevoeging van 100 μL/goed van 0,5% Triton verdund in PBS voor 15 min. Was cellen door het toevoegen van 100 μL/ goed van PBS en onmiddellijk verwijderen (herhaal deze stap 3 keer).
- Incubeer vervolgens de celcultuur met 100 μL/goed van de blokkerende oplossing (5% vetvrije melk + 2% BSA verdund in PBS [pH 7,2]) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was cellen door 100 μL/well van PBS toe te voegen en verwijder deze onmiddellijk (herhaal deze stap 3 keer).
- Om amastigoten te bevlekken, wordt incubeer met 30 μL/bron van niet-commercieel monoklonale antilichaam (mAb) 2C2 anti-Ssp-4-eiwit (1:200) verdund in blokkeringsoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was cellen door 100 μL/well van PBS toe te voegen en verwijder deze onmiddellijk (herhaal deze stap 3 keer). Incubeer de plaat met 30 μL/well van secundair anti-muisantilichaam (1:500) verdund in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De niet-commerciële mAb 2C2 anti-Ssp-4 eiwit was een vriendelijk geschenk van Prof. Dr. Renato A. Mortara van de afdeling Microbiologie, Immunologie en Parasitologie van de Federale Universiteit van São Paulo. - Verwijder voorzichtig de supernatant en vlekkernen door 50 μL/well van DAPI (5 mg/mL) verdund in PBS pH 7.2 (1:1.000) toe te voegen gedurende 1 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Vervang DAPI-kleuringsoplossing door 100 μL/put van PBS pH 7.2 en analyseer deze door fluorescentiemicroscopie.
- Plaat 3 x 104 microglia of astrocyten met aangevulde DMEM/F12 bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur in een voorbehandelde 96-put platte plaat (zie Tabel van materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op de14e dag onderging de glialcellscultuur (figuur 1A)mechanische dissociatie. Geïsoleerde celpopulaties werden geanalyseerd door stromingscytometrie volgens CD11b-, CD45- en GFAP-markers. We konden een zuiverheid van 89,5% waarnemen voor de astrocytenpopulatie en 96,6% voor de microgliapopulatie (Figuur 1B). Na isolatie, cellen werden verguld in een 96-goed platte plaat en na 24 uur waren ze klaar om te worden besmet door T. cruzi of T. gondii volgens de respectieve infectie protocollen. Hier hebben we een tijd-cursus infectie van T. cruzi als een voorbeeld van infectie tarief evaluatie in deze gliacellen.
Astrocyten en microglia (3 x 104 cellen/put) waren besmet met T. cruzi bij MOI = 5:1 (parasieten:cell) gedurende 2-96 uur (Figuur 2). Infectiegraad werd geëvalueerd door immunofluorescentie door het aantal cellen en het aantal parasieten met een DNA-intercalator (DAPI) te tellen. Kortom, we konden vaststellen dat T. cruzi in staat is om microglia en astrocyten binnen te vallen tegen vergelijkbare tarieven. Bovendien, T. cruzi repliceert in beide celtypes, het bereiken van de hoogste infectie tarief op 96 uur na infectie (p.i.). Interessant is dat bij 96 uur p.i. de infectiesnelheid meer uitgesproken is bij astrocyten dan in microglia, wat suggereert dat microgliacellen in staat zijn om de parasietreplicatie efficiënter te controleren dan astrocyten, zoals we eerder beschreven11.
Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van genetisch gemodificeerde parasieten die fluorescerende verslaggevers of parasieten uitdrukken die zijn gelabeld met specifieke fluorescerende antilichamen de immunofluorescentiemicroscopie kunnen verbeteren, omdat ze beter kunnen worden onderscheiden van celkern (figuur 3). Bovendien kan het infectiepercentage van fluorescerende parasieten worden bepaald door andere technieken zoals stroomcytometrie. Hier hebben we voorbeelden gegeven van T. gondii RH stam constitutief uitdrukken YFP (Figuur 3A) en T. cruzi Y stam gekleurd met niet-commerciële mAb 2C2 anti-Ssp-4 eiwit (Figuur 3B).
In totaal beschrijft dit protocol hoe murine microglia kan worden geëxtraheerd, onderhouden, gescheiden en infecteren, wat een krachtig hulpmiddel kan zijn om bijvoorbeeld immuunreacties van gliacellen te bestuderen tot protozoa-infectie, zoals kort opgehelderd Hier.
Figuur 1: Primaire astrocyten en microgliacellen. (A) Beelden van C57BL/6 murine gliacellen op de14e dag van de cultuur werden verkregen door omgekeerde microscoop (400x). De rode pijl geeft de laag astrocyten aan en de zwarte pijl geeft de microglia aan. (B) Na mechanische dissociatie werden astrocyten en microglia gekleurd (5 x 105 cellen) met fluorescerende anti-CD11b, anti-CD45 en anti-GFAP en geëvalueerd door flow cytometrie (1 x 105 cellen acquisitie). Astrocyten worden beschouwd als CD11b-/CD45- en GFAP+ cellen, terwijl microglia CD11b+/CD45+ en GFAP- cellen zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Tijdsverloop van T. cruzi-infectie in gliacellen. Astrocyten en microglia van C57BL/6 muizen waren besmet met T. cruzi Y (MOI = 5:1). Na 2 uur, 48 uur en 96 uur werden kamers gefixeerd met methanol en gekleurd met celkernmarker DAPI (blauw) en anti-GFAP (rood). Beelden werden verkregen door omgekeerde fluorescentiemicroscoop (400x). Het aantal amastigoten in de cellen en de frequentie van geïnfecteerde cellen werden geëvalueerd door de fluorescentiemicroscoopsoftware (zie Tabel van Materialen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Astrocyten en microglia-infectie met fluorescerende protozoïënparasieten. (A) 3 x 104 astrocyten en microglia van C57BL/6 muizen waren besmet (MOI = 1:1) met T. gondii RH YFP (groen) gedurende 48 uur, kamers werden vastgesteld met 1% PFA en gekleurd met DAPI (blauw). (B) 3 x 104 astrocyten en microglia van C57BL/6 muizen waren besmet (MOI = 5:1) met T. cruzi Y voor 96 uur, en kamers werden bevestigd met pure methanol en gekleurd met DAPI (groen) en mAb 2C2 anti-Ssp-4 (oranje). Beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belang van het bestuderen van geïsoleerde gliacellen functies in verschillende biologische contexten is uitgebreid in de afgelopen twee decennia. Inzicht in het CNS buiten neuronen is nog steeds een groeiend gebied in de celbiologie, vooral onder infecties of ontstekingsaandoeningen8,9,24. Gliacellen zijn niet alleen cruciaal voor de fysieke ondersteuning van neuronen (zoals voorheen bekend), maar ook in vele andere fysiologische situaties zoals neuron energievoorziening, neurometabolisme, immuunbewaking, synaptisch snoeien, vormen en moduleren van het weefsel, onder andere3,25,26,27,28,29.
Aangezien astrocyten en microglia differentieel kunnen worden gemoduleerd tijdens infectie of steriele ontsteking, is het van groot belang om de individuele en relatieve rol van deze gliacellen te begrijpen. Hoewel microglia bekend is om het mononucleaire fagocytesysteem (MPS) in CNS te vertegenwoordigen, zijn astrocyten ook beschreven als een cruciale speler in de CNS-immuunresponsen8. Om de rol van elke gliale subgroep in de context van infectie en/of ontsteking te vergelijken, is het verplicht om ze uit dezelfde extractie en omstandigheden te halen. Er zijn weinig rapporten over de effectorreacties van microglia en astrocyten om infecties te beheersen, vooral met betrekking tot protozoan parasieten. In deze zin hebben we onlangs aangetoond dat de eis van NLRP3 inflammasoom aan de controle van T. cruzi replicatie in microglia, maar niet in astrocyten door een mechanisme met stikstofmonoxide (NO) afscheiding11.
Dit protocol beschrijft een methode die is gericht op het gelijktijdig extraheren van de twee meest voorkomende gliacellen populaties, astrocyten en microglia, van postnatale (tot 3-dagen-oude) muizen. Pasgeboren muizen ouder dan 3-dagen-oud kan worden gebruikt, maar we hebben ervaren dat de opbrengst van beide cellen iets afneemt na verloop van tijd (gegevens niet getoond). Onze methode verschilt van eerder beschreven protocollen voor astrocyten of microglia-isolatie, omdat we ons richtten op het verkrijgen en isoleren van beide celtypen in dezelfde extractie, onder dezelfde omstandigheden, waardoor het gebruik van proefdieren werd geoptimaliseerd en de studie van de relatieve rol voor die cellen in immunologische contexten werd verbeterd. Bovendien optimaliseerde ons protocol ook de opbrengst van beide celtypen. De opbrengst is meestal 3-5 x 106 astrocyten en 3-5 x 105 microglia per kolf. Vergelijk dit met andere protocollen die resulteren in minder cellen met meer dieren per T-75 kolf (sommige protocollen gebruiken 2-3 dieren per kolf)30,31.
Een ander voordeel van dit protocol is de tijd die nodig is om geïsoleerde astrocyten en microglia te verkrijgen. Binnen 14 dagen is het mogelijk om volwassen microglia te verkrijgen. In feite is het belangrijk om te benadrukken dat, zoals Flode en Combs aangetoond, microglia ouder dan 14 dagen aanwezig verminderd vermogen om cytokines afscheiden; het is zeer belangrijk om dit te overwegen in neuroimmunologische contexten30. Ondanks het feit dat de volwassen makers voor astrocyten niet volledig worden begrepen, wordt GFAP grotendeels gebruikt om responsieve en actieve astrocyten te karakteriseren. Sommige protocollen bereiken niveaus van 90% GFAP positieve cellen pas na 21 of 28 dagen van de cultuur. Om die reden stelden we een methode voor die voorzag, cellen die immunoresponsief zijn en meestal binnen 7-14 dagen volwassen zijn. Hoewel de zuiverheid lager kan zijn dan andere methoden voor zowel astrocyten31 als microglia30,was de belangrijkste focus het verkrijgen van microglia en astrocyten in grotere hoeveelheden in een gelijktijdige extractie. We begrijpen dat celpopulaties verder kunnen worden gesorteerd of geïsoleerd met kolomscheiding om hun zuiverheid te verbeteren. Hiervoor kunnen extra celmarkeringen worden opgenomen, zoals Iba1 of TMEM119 voor microglia; Aquaporin-4 of S100B voor astrocyten, CC1 of O4 voor oligodendrocyten en NeuN voor neuronen22,,31,32,33. Echter, een belangrijk celverlies aan het einde van het protocol moet worden overwogen.
Zo hebben we een aangepaste methode om gelijktijdig te verkrijgen microglia en astrocyten in een efficiënte en goedkope protocol. Bovendien biedt dit protocol de voordelen van een grote opbrengst waardoor de vergelijkende studies van gliale subgroepen in neuroimmunologische contexten mogelijk zijn, zoals hier geïllustreerd tijdens T. cruzi en T. gondii-infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen professor Dr. Renato A. Mortara van de Federale Universiteit van São Paulo (UNIFESP) bedanken voor mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, subsidie 2017/25942-0 aan K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, subsidie 402100/2016-6 aan K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. ontvangt beurs van CNPq, A.L.O.P. ontvangt beurs van CAPES, en I.S.F en L.Z.M.F.B. ontvangt beurs van FAPESP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
