इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से मूत्र एस्ट्रोसाइट और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं को निकालने, बनाए रखने और अलग करने का निर्देश देना है, जिसके बाद प्रोटोजोआ परजीवी के साथ संक्रमण होता है।
एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लिल कोशिकाएं हैं। वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में शारीरिक सहायता और होमोस्तासिस रखरखाव के लिए जिम्मेदार हैं। संक्रामक रोगों के नियंत्रण में उनकी भागीदारी के बढ़ते सबूत सीएनएस को प्रभावित करने वाले संक्रमणों के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए तरीकों में सुधार में उभरते हित को न्यायोचित ठहराते हैं । सीएनएस में ट्राइपानोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी)और टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी (टी गोंदी)संक्रमण के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, यहां हम प्रोटोजोआ परजीवी के साथ मेरिन एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं को निकालने, बनाए रखने, अलग करने और संक्रमित करने की विधि प्रदान करते हैं। नवजात कॉर्टिस से निकाली गई कोशिकाओं को आवधिक अंतर मीडिया प्रतिस्थापन के साथ 14 दिनों तक विट्रो में बनाए रखा जाता है। एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया यांत्रिक विसोजन द्वारा एक ही निष्कर्षण प्रोटोकॉल से प्राप्त किए जाते हैं। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइपिंग के बाद, कोशिकाएं प्रोटोजोआ परजीवी से संक्रमित होती हैं। संक्रमण दर विभिन्न समय बिंदुओं पर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित की जाती है, इस प्रकार प्रोटोज़ोन आक्रमण और प्रतिकृति को नियंत्रित करने के लिए ग्लियल कोशिकाओं की अंतर क्षमता का मूल्यांकन सक्षम करती है। ये तकनीकें संक्रमण के लिए एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सरल, सस्ते और कुशल तरीकों का प्रतिनिधित्व करती हैं, आगे न्यूरोइम्यूनोलॉजी विश्लेषण के लिए क्षेत्र खोलती हैं।
सीएनएस मुख्य रूप से न्यूरॉन्स और ग्लिल कोशिकाओं1,2,3से बना है । माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स सीएनएस में सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लिया कोशिकाएं हैं। माइक्रोग्लिया, निवासी मैक्रोफेज, सीएनएस3,,4में इम्यूनोसक्षम और फागोसाइटिक ग्लिया सेल है, जबकि एस्ट्रोसाइट्स होमोस्टोसिस को बनाए रखने और सहायक कार्यों को लागू करने के लिए जिम्मेदार हैं5।
हाल के साहित्य में न्यूरॉन्स6,7के समर्थन और संरक्षण के लिए जिम्मेदार होने के लिए ग्लियाल कोशिकाओं को शास्त्रीय रूप से जाना जाता है , जिसमें संक्रमण8,9,10 ,,11के प्रति उनकी प्रतिक्रियाएं शामिल हैं ।10 इस प्रकार, उनके कार्यों को व्यक्तिगत रूप से समझने के लिए इन ग्लियल कोशिकाओं को अलग करने के तरीकों को विकसित करने के लिए एक धक्का है।
प्राथमिक संस्कृतियों के बजाय ग्लिअल कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए कुछ वैकल्पिक मॉडल हैं, जैसे अमर सेल वंश और वीवो मॉडल में। हालांकि, अमर कोशिकाओं को आनुवंशिक बहती और रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरने की अधिक संभावना होती है, जबकि वीवो अध्ययनों में सीमित हेरफेर की स्थिति लागू होती है। इसके विपरीत, प्राथमिक संस्कृतियों को संभालना आसान है, बेहतर वीवो कोशिकाओं में समान है और हमें प्रायोगिक कारकों12,,13को नियंत्रित करने की अनुमति भी देता है। यहां, हम एक ही प्रोटोकॉल में मूत्र एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया प्राथमिक कोशिकाओं को निकालने, बनाए रखने और अलग करने के बारे में दिशानिर्देशों का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम इन संस्कृतियों में प्रोटोजोआ संक्रमण के साथ काम करने के तरीके पर भी उदाहरण प्रदान करते हैं।
नवजात चूहों (3 दिन तक पुराने) से निकाली गई सीएनएस कोशिकाओं को अंतर मीडिया पर 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था जो एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं के तरजीही विकास की अनुमति देता है। चूंकि माइक्रोग्लिया संलग्न एस्ट्रोसाइट्स से ऊपर आराम करते हैं, इसलिए कोशिका आबादी को कक्षीय इनक्यूबेटर में यांत्रिक रूप से अलग किया गया था। इसके बाद, हमने माइक्रोग्लिया युक्त सभी अधिनेत एकत्र किए और एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए ट्राइप्सिन जोड़ा। अलग-थलग ग्याल कोशिकाओं का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता था और वांछित प्रयोग के अनुसार चढ़ाया जाता था।
हमने इन अलग-थलग पड़े माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को प्रोटोजोआ परजीवी से कैसे संक्रमित किया जाए, इस पर उदाहरण भी दिए। टी गोंदी एक अत्यधिक न्यूरोट्रोपिक प्रोटोज़ोन है जो टॉक्सोप्लास्मोसिस14के लिए जिम्मेदार है, जबकि टी क्रूज़मैं चागास रोग के लिए जिम्मेदार है जो सीएनएस15,,16में न्यूरोलॉजिकल विकारों के विकास की ओर ले जा सकता है। इसके अलावा, यह भी बताया गया है कि टी गोंदी17,18 या टी क्रूज़ी19,,,20,,21 के साथ संक्रमण इम्यूनोसमझौता रोगियों में मौत का संभवतः कारण थे । इसलिए, प्रोटोजोआ संक्रमणों को नियंत्रित करने में सीएनएस से ग्लियल कोशिकाओं की इम्यूनोलॉजिक भूमिका का व्याख्या बहुत महत्वपूर्ण है।
अलग-अलग जैविक संदर्भों में अलग-थलग पड़े ग्लिल कोशिकाओं के कार्यों का अध्ययन करने के महत्व का पिछले दो दशकों में विस्तार किया गया है । न्यूरॉन्स से परे सीएनएस को समझना अभी भी सेल बायोलॉजी में एक बढ़ता हु…
The authors have nothing to disclose.
हम संघीय साओ पाउलो विश्वविद्यालय (UNIFESP) से प्रोफेसर डॉ रेनाटो ए मोर्टारा को mAb 2C2 विरोधी Ssp-4 के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को फंडाकाओ डी एम्पारो à पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (FAPESP, अनुदान 2017/25942-0 से केआरबी), कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेनवोल्विमेंटो सिएंटिफिको ई टेक्नोलोकोको (सीएनपीक्यू, से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था केआरबी को अनुदान 402100/2016-6), इंस्टीटो नैसिनल डी सिएनसिया ई टेक्नोलोगिया डी वैसिनास (INCTV/CNPq) और कूर्डेनकाकाओ डी एपरफेकोमेंटो डी पेस्सोल डी निवेल सुपीरियर (कैप्स, फाइनेंस कोड 001) । M.P.A. CNPq से फैलोशिप प्राप्त करता है, A.L.O.P. CAPES से फैलोशिप प्राप्त करता है, और I.S.F. और L.Z.M.F.B. FAPESP से फैलोशिप प्राप्त करता है ।
70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |