Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig isolering av primära astrocyter och mikroglia för protozoparasitinfektion

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

Det övergripande målet med detta protokoll är att instruera hur man extraherar, underhåller och separerar murine astrocyt- och mikrogliaceller från det centrala nervsystemet, följt av infektion med protozoparasiter.

Abstract

Astrocyter och mikroglia är de vanligast förekommande gliacellerna. De är ansvariga för fysiologiskt stöd och homeostas underhåll i centrala nervsystemet (CNS). De ökande beläggen för deras inblandning i bekämpningen av infektionssjukdomar motiverar det framväxande intresset för att förbättra metoderna för att isolera primära astrocyter och mikroglia för att utvärdera deras svar på infektioner som påverkar CNS. Med tanke på effekterna av Trypanosoma cruzi (T. cruzi) och Toxoplasma gondii (T. gondii)infektion i CNS, här ger vi en metod för att extrahera, underhålla, separera och infektera murine astrocyter och mikroglia celler med protozoa parasiter. Extraherade celler från nyfödda cortices upprätthålls in vitro i 14 dagar med periodiska differentialmedia ersättning. Astrocyter och mikroglia erhålls från samma extraktionsprotokoll genom mekanisk dissociation. Efter fenotypning av flödescytometri är celler infekterade med protozoparasiter. Infektionsfrekvensen bestäms genom fluorescensmikroskopi vid olika tidpunkter, vilket gör det möjligt att utvärdera differentiell förmåga gliaceller att kontrollera protozoiska invasion och replikering. Dessa tekniker representerar enkla, billiga och effektiva metoder för att studera svaren från astrocyter och mikroglia till infektioner, vilket öppnar fältet för ytterligare neuroimmunologi analys.

Introduction

CNS består huvudsakligen av nervceller och gliaceller1,2,3. Mikroglia och astrocyter är de vanligast förekommande gliacellerna i CNS. Microglia, den inhemska makrofag, är immunkompetenta och fagocytiska glia cellen i CNS3,4, medan astrocyter är ansvariga för att upprätthålla homeostas och utöva stödjande funktioner5.

Trots gliaceller är klassiskt kända för att vara ansvarig för stöd och skydd av nervceller6,7, nya funktioner i dessa celler har beskrivits i den senaste litteraturen, inklusive deras svar på infektioner8,9,10,11. Således finns det en push för att utveckla metoder för att isolera dessa gliaceller för att förstå deras funktioner individuellt.

Det finns några alternativa modeller för att studera gliaceller snarare än primära kulturer, som förevigade cell härstamningar och in vivo-modeller. Emellertid, förevigade celler är mer benägna att genomgå genetiska drivande och morfologiska förändringar, medan in vivo studier införa begränsade manipulation villkor. Omvänt, primära kulturer är lätta att hantera, bättre liknar in vivo celler och även tillåta oss att kontrollera experimentella faktorer12,13. Här beskriver vi riktlinjer för hur man extraherar, underhåller och separerar murine astrocyter och microglia primära celler i samma protokoll. Dessutom ger vi också exempel på hur man arbetar med protozoainfektion i dessa kulturer.

CNS celler utvinns ur neonatal möss (upp till 3 dagar gamla) odlades i 14 dagar på differentiella medier som gör det möjligt att prioritera tillväxt av astrocyter och microglia celler. Eftersom microglia vila ovanför de bifogade astrocytes, cell populationer var mekaniskt separerade i en orbital inkubator. Därefter samlade vi alla supernatant som innehåller mikroglia och lade trypsin att lossa astrocyter. Isolerade gliaceller utvärderades fenotypiskt av flöde cytometri och pläterade enligt önskat experiment.

Vi gav också exempel på hur man infekterar dessa isolerade mikroglia och astrocyter med protozoparasiter. T. gondii är en mycket neurotrop protozo som ansvarar för toxoplasmos14, medan T. cruzjag är ansvarig för Chagas sjukdom som kan leda till utveckling av neurologiska sjukdomar i CNS15,16. Dessutom har det också rapporterats att infektion med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den förmodligen dödsorsaken i immunkomprometterade patienter. Därför är förtydligandet av immunologiska roll gliaceller från CNS för att kontrollera protozoa infektioner av stor betydelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden med möss utfördes i enlighet med den brasilianska nationella lagen (11.794/2008) och godkändes av institutionella djurvårds- och användningskommittéer (IACUC) vid Federala universitetet i São Paulo (UNIFESP).

1. Gliaceller Extraktion, underhåll och dissociation

OBS: Antalet möss som används för gliacellsutdragningen beror på mängden celler som krävs för att utföra de önskade experimenten. I detta protokoll erhölls totalt 2,7 x 107 astrocyter och 4 x 106 mikroglia från sex neonatal C57BL/6 möss. Alla förfaranden utfördes under sterilt tillstånd i en klass II biosäkerhet skåp.

  1. Dag 1
    1. Förbered ren Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och HBSS + 10 % av det värmeinaktiverade fetala bovinserumet (FBS) (se Materialförteckning).
    2. Förbered kompletterad Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicillin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbikarbonat, pH 7,2) och filtrera den med ett 0,22 μm filter (se Tabell över material).
      OBS: Alla kulturmedier bör lagras vid 4 °C, men det är nödvändigt att förbeväxla dem vid 37 °C i 20 min innan experimentet påbörjas.
    3. Sterilisera alla kirurgiska instrument (sax, spatel och pincett) i en autoklav och använd 70% etanol under förfarandet.
    4. Sätt nyfödda (upp till 3 dagar gamla) möss i en förseglad kammare som innehåller bomull indränkt med isofluran i 5 min för djupgående anestesi.
    5. Spraya muspungen med 70% etanol och halshugg djuret med sax.
    6. Gör sagittal cut (bakre till främre) med sax längs kraniet för att öppna den och exponera hjärnan. Separera skallen från hjärnan med hjälp av pincett. Ta bort hjärnan med hjälp av en mikro spatel för att upprätthålla hjärnans integritet.
    7. Placera hjärnan i en torr petriskål (6 cm i diameter). Ta bort luktlampan och lillhjärnan med hjälp av en mikrospatel. Flytta cortex till en annan petriskål (6 cm diameter) som innehåller HBSS + 10% FBS (2 mL/Petri dish).
    8. Skär hjärnvävnaden i små bitar med steril sax och med hjälp av en p1000 mikropipette överföring varje hjärnvävnad med HBSS + 10% FBS till olika 15 ml koniska rör. Se till att den slutliga volymen är 2 ml/rör. Om inte, komplett med HBSS + 10% FBS.
      Protokollet kan pausas här. Om så är fallet måste koniska rör med CNS-vävnad placeras på is upp till 1 h.
    9. Tvätta den skurna hjärnvävnaden med 3 ml HBSS + 10% FBS (per rör) och efter dekantering. Ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa detta steg 3 gånger.
      OBS: Detta steg syftar till att ta bort skräp och att återvinna den extraherade vävnaden.
    10. Tvätta den skurna hjärnvävnaden med 3 ml ren HBSS (per rör) och efter dekantering, ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa detta steg 3 gånger.
      OBS: Detta steg syftar till att ta bort de återstående serum från föregående tvättar, som celler kommer att trypsinized i nästa steg.
    11. Tillsätt 3 ml trypsin per rör och placera i ett vattenbad vid 37 °C i 30 min, skaka försiktigt rören var 5:e minut. Undvik bubblor genom att vända eller plötsligt blanda rören.
      OBS: Detta steg syftar till att smälta den insamlade vävnaden.
    12. För att inaktivera trypsin, tvätta vävnaden med 3 ml per rör HBSS + 10% FBS och, efter dekantering av vävnaden, ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa detta steg 3 gånger.
    13. Tvätta vävnaden med 3 ml per rör av ren HBSS och ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa det här steget 2 gånger.
    14. Tillsätt 7 ml per rör av ren HBSS och homogenisera vävnaden genom successiva passager i pipetter: först med 10 ml serologiska pipetten, följt av 5 ml och slutligen med p1000 mikropipette.
    15. Efter homogenisering, centrifugrör vid 450 x g i 5 min vid 4 °C.
    16. Kasta supernatanten och resuspend pelleten med 4 ml HBSS + 10% FBS per rör.
    17. Överför celler till en förbehandlad T-75-kolv för optimal cellodlingsvidhäftning (se Tabell över material).
      OBS: Processvävnad från varje djur per kolv.
    18. Placera kolven i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter för vidhäftning.
    19. Tillsätt 10 ml kompletterad DMEM/F12 per kolv och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
      OBS: Den slutliga volymen är 14 ml per kolv.
  2. Dag 3
    1. Ta bort 7 ml odlingsmedium från T-75-kolven och tillsätt 7 ml färskt tillkallat DMEM/F12.
      Obs: Kolvarna kommer att innehålla en hel del cellulära skräp och ett grumligt utseende.
  3. Dag 5
    1. Ta bort allt medium från T-75-kolven och tillsätt 14 ml färskt tillkallat DMEM/F12.
      OBS: Medium byts ut från kolvarna för att avlägsna skräp och icke-vidhäftande celler.
    2. Efter varje 48 h, ta bort 6 ml av supernatanten och tillsätt 7 ml färskt kompletterat DMEM/F12 medium fram till dag 14 av kulturen.
  4. Dag 14
    1. Efter avlägsnande 6 ml av supernatanten och tillsätt 7 ml färskt tillklat DMEM/F12 medium, stäng T-75-kolvarna tätt.
    2. Placera dem i golvet orbital shaker vid 200 rpm och 37 °C över natten för att mekaniskt separera mikroglia från astrocyter.
  5. Dag 15
    1. Ta kolvarna från shakern och tvätta dem kraftigt med sitt eget medium för att optimera celldissociationen och skörda det maximala antalet mikroglia. Samla sedan supernatanten (innehållande mikroglia) och överför till ett koniskt rör på 50 ml.
    2. Tillsätt därefter 4 ml trypsin i varje kolv och inkubera i 5 min vid 37 °C för att lossa astrocyterna.
    3. Tillsätt 5 ml per kolv med kompletterad DMEM/F12 för att inaktivera trypsin. Tvätta kolvarna med sitt eget medium och överför innehållet till ett koniskt rör på 50 ml.
    4. Centrifugera alla rör som innehåller separerad mikroglia och astrocyter vid 450 x g i 5 min vid 4 °C.
    5. Kasta supernatanten. Resuspend microglia pelleten i 1 ml och astrocyterna i 10 ml kompletterad DMEM/F12.
    6. Fortsätt till cellräkning i en Neubauer kammare eller en automatisk cellräknare. Plätera cellerna med kompletterat DMEM/F12 på önskad täthet i en anslå lägenhet bottencellodlingplatta (förbehandlat för optimal celltillbehör; se Bordlägga av material). Inkubera celler vid 37 °C och 5% CO2 för 24 h så att de kan fästas.
      OBS: Reservera 1,5 x 106 av varje cellpopulation för att bekräfta deras renhet genom flödescytometri.
    7. Utför en flödescytometrisk analys för att verifiera cellpopulationernas renhet.
      OBS: Vi anser microglia CD11b+/CD45+/GFAP- och astrocyter CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 och TMEM119 färgning kan övervägas för att fullt ut karakterisera microglia22.
    8. Tillsätt en FMO (Fluorescens Minus One)23 och ett ofläckat prov för varje cellpopulation (atrocyter och mikroglia) som kontroller av flödescytometrianalys.
    9. För varje cellpopulation, reservera 5 x 105 celler för varje färgade och ofläckade prover. För FMO, reservera två andra rör av mikroglia som innehåller 2,5 x 105 celler vardera och även reservera ett annat rör på 5 x 105 astrocyter.
      Obs: Eftersom mikrogliatal kan vara en begränsande faktor är det möjligt att använda färre celler för ofläckade kontroller och FMO-kontroller.
    10. Centrifugera alla mikrorör vid 450 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten och resuspend pelleten med 500 μL/microtube FACS buffert (fosfat-buffrad saltlösning (PBS) + 0,5% bovin serum albumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).
    11. Centrifugera alla mikrorör vid 450 x g vid 4 °C i 5 min. Kassera supernatanten och återanvända pelleten med 100 μL/mikrorör anti-CD16/CD32 (klon 93) (1:50) utspätt i FACS-buffert. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
    12. Tillsätt 500 μL/mikrorör FACS-buffert i alla mikrorör och centrifugera vid 450 x g vid 4 °C i 5 min. Kassera supernatanten. Resuspend astrocyter och microglia färgningsrör och även astrocyte FMO rör med 50 μL/microtube av ytmarkörer blanda: anti-CD45 (PE, klon 30-F11) och anti-CD11b (eFluor 450, klon M1/70) (båda utspädda vid 1: 100 i FACS buffert).
    13. För ofläckade celler, återuppstå med samma volym FACS-buffert. För microglia FMO, inkubera varje mikrogliarör med anti-CD45 eller anti-CD11b. Inkubera alla prover vid 4 °C i mörker.
    14. Tillsätt 500 μl FACS-buffert per mikrotube. Centrifugera vid 450 x g vid 4 °C i 5 min. Kasta supernatanten och sätt tillbaka pelleten med 100 μl/mikrorör fixeringsbuffert (se Materialbord) i 20 min vid rumstemperatur i mörker.
    15. Tillsätt 500 μL/mikrorör permeabiliseringsbuffert 1x (se materialförteckning)och inkubera vid 4 °C i 5 min i mörker.
    16. Centrifugera alla mikrorör vid 450 x g vid 4 °C i 5 min. Kassera supernatanten. Resuspend astrocyter och microglia färgningsrör och även microglia FMO rör med 50 μL/microtube av intracellulära antikroppar anti-GFAP (APC, klon GA5) i en 1:100 utspädning i 1x permeabilization buffert. För ofläckade celler och astrocyt FMO återanvändas cellerna med samma volym FACS-buffert. Inkubera alla prover vid 4 °C i 30 min i mörker.
    17. Tvätta alla rör genom att tillsätta 500 μL/mikrorör med 1x permeabiliseringsbuffert. Centrifugera alla mikrorör vid 450 x g, i 5 min vid 4 °C. Återanvända varje mikrotube i 200 μL facs buffert. Förvärva 1 x 105 händelser/prov på flödescytometern.
    18. För analys måste cellerna först gated på CD11b x CD45 och sedan GFAP histogram.
      Ofläckade och FMO-kontroller är användbara för att bestämma grindar.

2. Infektion och utvärdering av infektion priser

  1. Infektion av gliaceller med T. gondii
    1. Platta 3 x 104 mikroglia eller astrocyter med kompletterad DMEM/F12 vid 37 °C och 5% CO2 för 24 timmar i en förbehandlad 96-brunnsplatta (se Materialförteckning).
    2. Infektera varje cellpopulation med tachyzoiter från T. gondii RH-stam som uttrycker gult fluorescerande protein (YFP) vid en infektionsmultipendium (MOI) på 1:1 (parasit:cell) utspätt 200 μl/brunn kompletterad RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicillin + 0,18 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbikarbonat, pH 7.2) (se Materialtabell). Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 för 48 timmar.
    3. Kassera sedan supernatanten och fixera cellerna genom att tillsätta 100 μl/brunn på 1% paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS vid 4 °C i 24 timmar.
    4. Byt ut PFA mot 100 μl/brunn PBS vid pH 7.2.
    5. Avlägsna försiktigt supernatant- och fläckcellskärnorna genom pipettering 50 μL/brunn AV DAPI (5 mg/ml) utspädd i PBS pH 7.2 (1:1 000) i 1 min vid rumstemperatur i mörker.
    6. Byt ut DAPI-färgningslösning med 100 μl/brunn PBS (pH 7.2) och analysera den med fluorescensmikroskopi.
  2. Infektion av gliaceller med T. cruzi
    1. Platta 3 x 104 mikroglia eller astrocyter med kompletterad DMEM/F12 vid 37 °C och 5% CO2 för 24 timmar i en förbehandlad 96-brunnsplatta (se Materialförteckning).
      OBS: Använd en annan platta för varje infektionspunkt.
    2. Infektera gliacellerna med trypomastigotes från T. cruzi Y-stam vid en MOI på 5:1 (parasiter:cell) utspädd i 200 μL/brunn kompletterad RPMI och inkubera vid 37 °C och 5% CO2 för 2 h.
      OBS: Detta steg är viktigt för cellinvasionen av parasiten.
    3. Ta bort alla supernatant och tvätta brunnarna genom att lägga till 200 μL/brunn kompletterad RPMI för att avlägsna alla extracellulära parasiter. Ta bort supernatant och tillsätt 200 μl/brunn av färskt kompletterad RPMI.
      OBS: Detta steg avser att ta bort alla parasiter som inte invaderar de vidhäftande cellerna.
    4. Inkubera infekterade celler i 2 h, 48 h och 96 h för att utvärdera T. cruzi-replikation i gliaceller11.
    5. Efter varje tidpunkt, ta bort supernatanten och fixera cellerna med 100 μl/brunn metanol i 15 min vid rumstemperatur och byt sedan ut metanol med 100 μl/brunn PBS (pH 7.2).
    6. Efter fixering, förbereda cellerna för immunofluorescensanalysen enligt följande.
      1. För att undvika autofluorescens, behandla cellerna med 100 μl/brunn på 50 mM NH4Cl utspätt i PBS (pH 8.0) i 15 min. Tvätta cellerna genom att tillsätta 100 μl/brunn PBS och ta omedelbart bort den (upprepa detta steg 3 gånger).
      2. Därefter permeabilize cellerna genom att tillsätta 100 μL/brunn på 0,5% Triton utspädd i PBS i 15 min. Tvätta celler genom att tillsätta 100 μL/brunn pbs och omedelbart ta bort den (upprepa detta steg 3 gånger).
      3. Inkubera sedan cellkulturen med 100 μL/brunn av blockerande lösning (5 % fettfri mjölk + 2% BSA utspädd i PBS [pH 7.2]) i 1 h vid rumstemperatur. Tvätta cellerna genom att tillsätta 100 μl/brunn PBS och ta omedelbart bort den (upprepa detta steg 3 gånger).
      4. För att färga amastigotes, inkubera med 30 μL/brunn av icke-kommersiell monoklonal antikropp (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 protein (1:200) utspätt i blockerande lösning för 1 h vid rumstemperatur.
      5. Tvätta cellerna genom att tillsätta 100 μl/brunn PBS och ta omedelbart bort den (upprepa detta steg 3 gånger). Inkubera plattan med 30 μL/brunn sekundär antimusantikropp (1:500) utspätt i PBS i 1 h vid rumstemperatur.
        OBS: Den icke-kommersiella mAb 2C2 anti-Ssp-4 protein var en snäll gåva från prof. Dr Renato A. Mortara från Institutionen för mikrobiologi, immunologi och parasitologi vid Federal University of São Paulo.
      6. Ta försiktigt bort supernatant- och fläckkärnorna genom att tillsätta 50 μl/brunn av DAPI (5 mg/ml) utspätt i PBS pH 7.2 (1:1 000) i 1 min vid rumstemperatur i mörker.
      7. Byt ut DAPI-färgningslösning med 100 μl/brunn PBS pH 7.2 och analysera den genom fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På den 14:e dagen genomgick gliaceller kultur (figur 1A) mekanisk dissociation. Isolerade cell populationer analyserades av flöde cytometri enligt CD11b, CD45 och GFAP markörer. Vi kunde observera en renhet på 89,5% för astrocytpopulationen och 96,6% för mikrogliapopulationen (figur 1B). Efter isolering, celler var pläterade i en 96-väl platt tallrik och efter 24 h de var redo att smittas av T. cruzi eller T. gondii enligt respektive infektion protokoll. Här gav vi en tid-kurs infektion av T. cruzi som ett exempel på infektion hastighet utvärdering i dessa gliaceller.

Astrocyter och mikroglia (3 x 104 celler/brunn) smittades med T. cruzi vid MOI = 5:1 (parasiter:cell) för 2–96 timmar (figur 2). Infektionsfrekvensen utvärderades genom immunofluorescens genom att räkna antalet celler och antalet parasiter som färgats med en DNA-intercalator (DAPI). Kortfattat kunde vi konstatera att T. cruzi kan invadera mikroglia och astrocyter i liknande takt. Dessutom replikerar T. cruzi i båda celltyperna och når den högsta infektionsfrekvensen vid 96 h postinfektion (p.i.). Intressant, vid 96 h p.i. infektionsfrekvensen är mer uttalad i astrocyter än i mikroglia, vilket tyder på att mikroglia celler kan kontrollera parasiten replikering mer effektivt än astrocyter, som vi tidigare beskrivit11.

Det är viktigt att notera att användningen av genetiskt modifierade parasiter som uttrycker fluorescerande reportrar eller parasiter märkta med specifika fluorescerande antikroppar kan förbättra immunofluorescensmikroskopin, eftersom de är bättre skiljer sig från cellkärnan (figur 3). Dessutom kan infektionshastigheten av fluorescerande parasiter bestämmas av andra tekniker såsom flödescytometri. Här gav vi exempel på T. gondii RH stam som utgör YFP(figur 3A)och T. cruzi Y stam färgas med icke-kommersiella mAb 2C2 anti-Ssp-4 protein (figur 3B).

Sammantaget beskriver detta protokoll hur man extraherar, underhåller, separerar och infekterar murine mikroglia och astrocyter primära celler, vilket kan vara ett kraftfullt verktyg för att studera till exempel immunsvar av gliaceller till protozoinfektion som kortfattat klarlagt Här.

Figure 1
Figur 1: Primära astrocyter och mikrogliaceller. (A)Bilder av C57BL/6 murine gliaceller på den 14:e dagen av kultur erhölls genom inverterad mikroskop (400x). Den röda pilen anger lagret av astrocyter och den svarta pilen indikerar mikroglia. (B)Efter mekanisk dissociation färgades astrocyter och mikroglia (5 x 105 celler) med fluorescerande anti-CD11b, anti-CD45 och anti-GFAP och utvärderades med flödescytometri (1 x 105 cells acquisition). Astrocyter betraktas som CD11b-/CD45- och GFAP+ celler, medan microglia är CD11b+/CD45+ och GFAP- celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Time-course av T. cruzi infektion i gliaceller. Astrocyter och microglia från C57BL/6 möss var infekterade med T. cruzi Y (MOI = 5:1). Efter 2 h, 48 h och 96 h, var kamrarna fixerade med metanol och färgas med cellkärnan markör DAPI (blå) och anti-GFAP (röd). Bilder erhölls genom inverterad fluorescensmikroskop (400x). Antalet amastigotes inuti cellerna och frekvensen av infekterade celler utvärderades av fluorescensmikroskopprogramvaran (se Tabell över material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Astrocyter och microglia infektion med fluorescerande protozoiska parasiter. (A)3 x 104 astrocyter och mikroglia från C57BL/6 möss var infekterade (MOI = 1:1) med T. gondii RH YFP (grön) för 48 h, kammare fixerades med 1% PFA och färgas med DAPI (blå). (B)3 x 104 astrocyter och mikroglia från C57BL/6 möss var infekterade (MOI = 5:1) med T. cruzi Y för 96 h, och kamrarna fixerades med ren metanol och färgades med DAPI (grön) och mAb 2C2 anti-Ssp-4 (orange). Bilder förvärvades med hjälp av en inverterad fluorescens mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vikten av att studera isolerade gliaceller fungerar i olika biologiska sammanhang har expanderat under de senaste två decennierna. Förstå CNS bortom nervceller är fortfarande ett växande område i cellbiologi, särskilt under infektioner eller inflammatoriska tillstånd8,9,24. Glialceller är avgörande inte bara för nervceller fysiskt stöd (som det tidigare var känt), men också i många andra fysiologiska situationer såsom neuron energiförsörjning, neurometabolism, immun övervakning, synaptisk beskärning, formning och modulering av vävnaden, bland annat3,25,26,27,28,29.25

Eftersom astrocyter och mikroglia kan differentialmoduleras under infektion eller steril inflammation, är det av stor betydelse att förstå de enskilda och relativa roll dessa gliaceller. Även om mikroglia är kända för att representera mononukleära fagocyte systemet (MPS) i CNS, astrocyter har också beskrivits som en central aktör i CNS immunsvar8. För att jämföra rollen av varje gliadelgrupp i samband med infektion och/eller inflammation är det obligatoriskt att få dem från samma extraktion och tillstånd. Det finns få rapporter om effektorn svaren av mikroglia och astrocyter för att kontrollera infektioner, särskilt när det gäller protozoparasiter. I denna mening visade vi nyligen kravet på NLRP3 inflammasome till kontroll av T. cruzi replikering i mikroglia men inte i astrocyter av en mekanism som involverar kväveoxid (NO) sekretion11.

Detta protokoll beskriver en metod som är inriktad på att samtidigt extrahera de två mest rikliga gliaceller populationer, astrocyter och mikroglia, från postnatala (upp till 3-dagars gamla) möss. Nyfödda möss äldre än 3-dagars gamla kan användas, men vi upplevde att avkastningen av båda cellerna minskar något över tiden (data visas inte). Vår metod skiljer sig från tidigare beskrivna protokoll för astrocyter eller microglia isolering eftersom vi fokuserade på att erhålla och isolera båda celltyperna i samma extraktion, under samma förhållanden, vilket optimerar användningen av försöksdjur och förbättra studien av den relativa rollen för dessa celler i immunologiska sammanhang. Dessutom optimerade vårt protokoll också avkastningen för båda celltyperna. Avkastningen är vanligtvis 3–5 x 106 astrocyter och 3–5 x 105 mikroglia per kolv. Jämför detta med andra protokoll som leder till färre celler som använder fler djur per T-75-kolv (vissa protokoll använder 2–3 djur per kolv)30,31.

En annan fördel med detta protokoll är den tid som krävs för att få isolerade astrocyter och mikroglia. Inom 14 dagar är det möjligt att få mogna mikroglia. I själva verket är det viktigt att betona att, som Flode och Combs visat, mikroglia äldre än 14 dagar närvarande minskad förmåga att utsöndra cytokiner; Det är mycket viktigt att beakta detta i neuroimmunologiska sammanhang30. Trots att de mogna beslutsfattare för astrocyt inte är helt klarlagda, är GFAP till stor del används för att karakterisera lyhörda och aktiva astrocyter. Vissa protokoll uppnå nivåer av 90% GFAP positiva celler först efter 21 eller 28 dagar av kultur. Av den anledningen föreslog vi en metod som tillhandahålls, celler som är immunresponsiva och mestadels mogna inom 7-14 dagar. Även om repurity kan vara lägre än andra metoder för både astrocyte31 och microglia30,var huvudfokus att få mikroglia och astrocyter i större mängder i en samtidig extraktion. Vi förstår att cell populationer kan sorteras ytterligare eller isoleras med kolumn separation för att förbättra deras renhet. För detta kan ytterligare cellmarkörer inkluderas, till exempel Iba1 eller TMEM119 för mikroglia; Aquaporin-4 eller S100B för astrocyter, CC1 eller O4 för oligodendrocyter och NeuN för nervceller22,31,32,33. En viktig cellförlust i slutet av protokollet bör dock övervägas.

Således gav vi en modifierad metod för att samtidigt få microglia och astrocyter i ett effektivt och billigt protokoll. Dessutom ger detta protokoll fördelarna med en stor avkastning som gör det möjligt för jämförande studier av gliala delmängder i neuroimmunological sammanhang, vilket illustreras här under T. cruzi och T. gondii infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka professor Dr Renato A. Mortara från Federal University of São Paulo (UNIFESP) för mAb 2C2 anti-Ssp-4. Detta arbete stöddes av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, bidrag 2017/25942-0 till K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, bidrag 402100/2016-6 till K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. får stipendium från CNPq, A.L.O.P. får stipendium från CAPES, och I.S.F och L.Z.M.F.B. får stipendium från FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Tags

Immunologi och infektion Glia celler astrocyter microglia protozoa infektion T. cruzi T. gondii
Samtidig isolering av primära astrocyter och mikroglia för protozoparasitinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter