Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.
Abstract
חלבונים מחייבי RNA ו-RNA שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. הסידור המרחבי והזמני של RNAs ו-RBPs מדגיש את הרגולציה העדינה של תהליכים אלה. אסטרטגיה הנקראת CLIP-seq (קישור צולב ו-immunoprecipitation) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA אנדוגניים עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation. למרות השימוש הרחב בשיטת CLIP-seq קונבנציונלית במחקר RBP, שיטת CLIP מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים באיכות גבוהה, מזהמים פוטנציאליים מן RBPs copurified, דרישה של מניפולציה איזוטופ, ואובדן פוטנציאלי של מידע במהלך הליך ניסיוני מייגע. כאן אנו מתארים שיטת CLIP-seq שונה הנקראת FBIoCLIP-seq באמצעות טיהור תג FLAG-ביוטין טנדם. באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל החלבונים המחייבים את ה-RNA האינטראקציה מוסרים. לכן, RNAs אינטראקציה בעקיפין מתווכים על ידי RBPs אלה copurified מופחתים גם. שיטת ה-FBIoCLIP-seq שלנו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדים בחלבון ישיר ללא נהלי העברת SDS-PAGE וממברנה באופן ללא איזוטופים וללא נוגדנים ספציפיים לחלבון.
Introduction
חלבונים מחייבים RNAs ו- RNA שולטים בתהליכים תאיים מגוונים, כולל שחבור, תרגום, ביוגנזה ריבוזום, ויסות אפיגנטי ומעברלגורל תאים 1,2,3,4,5,6. המנגנונים העדינים של תהליכים אלה תלויים בהסדר המרחבי והזמני הייחודי של RNAs ו-RBPs. לכן, צעד חשוב לקראת הבנת ויסות RNA ברמה המולקולרית היא לחשוף את המידע המיקום על אתרי האיגוד של RBPs.
אסטרטגיה המכונה קישור צולב וimmunoprecipitation (CLIP-seq) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation של החלבון שלעניין 7. התכונה העיקרית של המתודולוגיה היא אינדוקציה של קוולנטי cross-links בין חלבון מחייב RNA מולקולות RNA הקשורות ישירות שלה (בתוך ~ 1 Å) על ידי קרינה UV8. ניתן לקבוע את עקבות ה- RBP על-ידי קיבוץ באשכולות תגיות CLIP וקריאה לשיא, שבדרך כלל יש להם רזולוציה של 30-60 nt. לחלופין, שלב שעתוק הפוך של CLIP יכול להוביל לכופרים (הוספות או מחיקות) או החלפות לאתרים המקשרים צולב, המאפשר זיהוי של אתרי איגוד חלבונים ב- RNAs ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד. צינורות כמו Novoalign ו CIMS פותחו לניתוח של תוצאות רצף תפוקה גבוהה של CLIP-seq8. כמו כן הוצעו מספר שיטות שונות של CLIP-seq, כולל קישור צולב וחיבור חיסוני (iCLIP), קליפ משופר (eCLIP), irCLIP, ו-ribonucleoside-משופרת בקישור צולב ואימונו-פקטריציה (PAR-CLIP)9,10,11,12.
למרות השימוש הרחב בשיטות CLIP-seq מסורתיות בחקר RBPs, שיטות CLIP יש מספר חסרונות. ראשית, אלקטרופורזה ג'ל מייגע והליך העברת קרום עלול להוביל לאובדן מידע, ולגרום למורכבות רצף מוגבלת. שנית, שיטת CLIP מבוססת נוגדן ספציפית לחלבון עשויה למשוך את תסביך חלבון במקום חלבון יעד יחיד, אשר עלול להוביל לאינטראקציות חלבון-RNA חיוביות כוזבות מן RBPs copurified. שלישית, האסטרטגיה מבוססת נוגדנים דורשת כמות גדולה של נוגדנים באיכות גבוהה, מה שהופך את היישום של שיטות אלה לא מספיק לצורך המחקר של RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין. רביעית, שיטת CLIP המסורתית דורשת ATP עם תווית רדיו כדי לתייג את ה-RNAs המאוגדים בחלבון.
הזיקה הגבוהה של סטרפטאבידין לחלבונים ביוטינילציה הופכת אותו לגישה חזקה מאוד לטהר חלבונים ספציפיים או תסביכי חלבון. biotinylation יעיל של חלבונים נושאים רצף פפטיד מלאכותי על ידי חוץ חוץ ביוטין חיידקי BirA biotin ligase בתאים יונקים עושה את זה אסטרטגיה יעילה לבצע טיהור ביוטין ב vivo13. פיתחנו שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq (FLAG-ביופח בתיווך Cross-lסימון בדיו ואניmmunop recipitationואחריו רצף תפוקה גבוהה) באמצעות דגל-ביוטין תג טנדםטיהור 14 ( איור1). באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל ה-RBPs אינטראקציה מוסרים(איור 2). תנאי השטיפה המחמירים מאפשרים גם לעקוף את העברת ה-SDS-PAGE והמברנה, שהיא עבודה אינטנסיבית ומאתגרת מבחינה טכנית. ובדומה ל-eCLIP ול-irCLIP, שיטת ה-FBIOCLIP-seq היא ללא איזוטופים. דילוג על הג'ל פועל ולהעביר שלבים מונע אובדן מידע, שומר על אינטראקציות אותנטיות של חלבון-RNA ללא פגע ומגביר את מורכבות הספרייה. יתר על כן, היעילות הגבוהה של מערכת התיוג עושה את זה בחירה טובה עבור RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין.
כאן אנו מספקים תיאור שלב אחר שלב של פרוטוקול ה-FBIOCLIP-seq עבור תאים יונקים. בקצרה, תאים מקושרים על ידי 254 נה"מ UV, ואחריו פירוק תא ו- FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). לאחר מכן, תסביכי החלבון-RNA מטוהרים עוד יותר על ידי לכידת זיקה ביוטין וRNAs מפוצלים על ידי עיכול חלקי עם MNase. לאחר מכן, RNA האוגד בחלבון הוא dephosphorylated ורצועה עם מקשר 3 '. מקשר RNA 5' מתווסף לאחר RNA הוא זרחן עם PNK ו- eluted על ידי עיכול K חלבונים. לאחר שעתוק הפוך, אותות RNA הקשורים לחלבון מוגברים על ידי PCR ומטוהרים על ידי טיהור ג'ל agarose. שני RBPs נבחרו כדי להדגים את התוצאהקליפ-seq FBIO. LIN28 הוא חלבון מחייב RNA מאופיין היטב מעורב התבגרות microRNA, תרגום חלבונים, ותכנות מחדש של תאים15,16,17. WDR43 הוא חלבון המכיל תחום WD40 חשב לתאם ביוגנזה ריבוזום, שעתוק אאוקריוטי, ובקרה pluripotency תאי גזעעוברי 14,18. עולה בקנה אחד עם תוצאות שדווחו בעבר עבור LIN28 עם CLIP-seq, FBIOCLIP-seq חושף אתרים מחייבים של LIN28 על "GGAG" מוטיבים microRNA מיר-let7g ו mRNAs16,19 (איור 3). WDR43 FBIOCLIP-seq זיהה גם את העדפת האיגוד של WDR43 עם 5' חיצוני מתעתק רווחים (5'-ETS) של pre-rRNAs20 (איור 4). תוצאות אלה מאמתות את האמינות של שיטת ה-FBIOCLIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית קו תא
- לשבט את הגן של עניין לתוך pPiggyBac וקטור וקטור pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA של עניין]-(היגרומיצין עמיד) plasmid הנושאת אפיטופ דגל ביוטין13,21 כדי לבטא תג דגל-ביוטין התמזגו RBP(FBRBP).
- שיתוף תרגום RBP FBהמביע וקטור עם וקטור pBase לתוך קו תא המביע את אנזים BirA22.
הערה: במחקר זה, הגן FBRBP עבר לתאי גזע עובריים של עכבר (mESCs) הנושאת וקטור ביטוי BirAמשולב 21. לחלופין, RBP המביעיםוקטור יכול להיות cotransfected לתאים עם pBase ו pPiggyBac-BirA-V5 יחד. - לגדל את התאים mESC על כלים ג'לטין ולשמור על תרבות mES בינוני (טבלת חומרים) ב 5% CO2 ב 37 ° C. בחר את התאים הנגועים עם hygromycin b (100 μg / mL) במשך שבוע אחד.
- לאחר בחירת תרופות, לקצור תאים על ידי מאגר טעינת SDS (טבלה 1) ולהשתמש כתםמערבי 23 כדי לאשר את התיוג והביטוי של הגן עם נוגדן FLAG סטרפטאבידין-HRP, בהתאמה.
2. קישור צולב
- צלחת ~ 3 x 106 mES תאים בצלחת 10 ס"מ יום אחד לפני הניסוי, כך התאים יגדלו 70-90% confluence בעת קציר (~ 5-10 מיליון תאים לכל מדגם).
- הסר את המדיום באמצעות ואקום. לטפל בתאים עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהרוות את הטריפסין על ידי 4 מ"ל של mESC טרי בינוני. העבר את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו את התאים על-ידי צנטריפוגציה ב-300 x g למשך 3 דקות ב-4°C והסרו את הסופרנטנט.
- להשעות את התאים עם 4 מ"ל של PBS קר וצלחת התאים בחזרה לצלחת 10 ס"מ עבור קישור צולב. חבר את התאים באמצעות קרינה עם אור UV של 254 ננ"מ (הגדר את המקשר הצולב UV עם פרמטר של 400 mJ/cm2).
הערה: עבור מונושכבות תא, התאים יכולים להיות מקושרים עם אור UV ישירות על הלוח לפני טיפול trypsin. - העבר את התאים המקושרים לצינור של 15 מ"ל. סובבו על ידי צנטריפוגציה ב-300 x g למשך 3 דקות ב-4°C והסרו את הסופרנטנט.
הערה: ניתן לאחסן את גלולת התא המקושרת ב- -80 °C עד לשימוש.
3. הכנת תאי ליוס
- Lyse התאים עם 500 μL של מאגר כביסה A (טבלה 1) טרי בתוספת עם 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 קוקטייל מעכב פרוטאז, ו 400 מעכב U/mL RNase. העבר את התאים לצינור 1.5 מ"ל ללא RNase. דגירה התאים במשך 30-60 דקות על רוטור עם סיבוב עדין ב 4 ° C.
- לטפל lysate עם 30 μL של DNase I ב 37 ° C במשך 10 דקות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 4 μL של 0.5 M EDTA. סובבו את הגלולה המסיסה ב-12,000 x g למשך 20 דקות ב-4°C והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
הערה: לשימוש מיידי, לשמור על קרח. אם לא ייווה שימוש בסופרנט באופן מיידי, אחסן אותו ב- -80 °C עד לשימוש.
4. הכנת חרוזי דגל
- להוסיף 40 μL של חרוזי דגל slurry לכל דוגמה לצינור טרי 1.5 מ"ל.
- שוטפים במהירות את החרוזים עם 0.5 מ"ל של חוצץ שטיפה קר כקרח A וסובבים ב-3,000 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C.
- חזור על שלב 4.2 פעם אחת. סובבו את החרוזים עם 3,000 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C. הסר בזהירות את המאגר עם קצה פיפטה צר. הימנע מהסרת החרוזים.
5. ערך חיסוני
- מעבירים את תא התא לשלב 3.2 לחרוזי הדגל המיוחלים מראש. סובבו את כל הדגימות על שייקר גלילה ב-4°C בעדינות. לדגם את חרוזי הדגל עם ליסטו במשך 2-4 שעות או לילה.
- צנטריפוגה את החרוזים במשך 2 דקות ב 3,000 x g ולהסיר את supernatant.
- לשטוף את החרוזים עם 0.5 מ"ל של מאגר כביסה prechilled A על ידי דגירה במשך 5 דקות ב סיבוב ב 4 מעלות צלזיוס, לסובב את החרוזים עם 3,000 x g עבור 2 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על השטיפה 1x.
- חזור על השטיפה 2x כמתואר בשלב 5.3 עם 0.5 מ"ל של מאגר כביסה prechilled B(טבלה 1).
6. אלגנטיות עם פפטיד דגל 3x
- הכן 3x פתרון חומוס דגל על ידי המסת 1 מ"ג של פפטיד דגל 3x עם 5 מ"ל של מאגר כביסה A לריכוז סופי של 200 ng/mL.
- סובב את חרוזי FLAG מ- 5.4 עם 3,000 x g למשך 2 דקות. הסר את הסופרנטנט בזהירות. ודא שרוב הסופרנטנט מוסר באמצעות קצה פיפטה צר.
- הוסף 200 μL של 3x פתרון תסה דגל לכל דוגמה. מדגרים את הדגימות עם סיבוב עדין במשך 30 דקות ב-4°C. סובב את חרוזי הדגל למשך 2 דקות ב- 3,000 x g. מעבירים את הסופרנטנטים לצינורות טריים.
- חזור על ההתחכך 2x כמתואר בשלבים 6.2 ו 6.3 והבריכה eluents יחד. חסוך 5% מהבלוטות לניתוח כתם מערבי או כתמי כסף כדי לבדוק את היעילות של FLAG-IP.
7. הכנת חרוזים סטרפטאבידין
- הכינו 50 μL של חרוז סטרפטאבידין slurry לכל מדגם. לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s ולהסיר את supernatant עם קצה פיפטה.
- לשטוף במהירות את החרוזים עם 0.5 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח A ולאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s.
- חזור על השטיפה 1x. הסר את חומר העל לאחר השטיפה.
8. טיהור זיקה ביוטין
- העבר את האדונים הנצברים מ- 6.4 לחרוזי סטרפטאבידין מ- 7.3 וסובב בעדינות את הדגימות ב- 4°C למשך 1-3 שעות או לילה.
- לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של מאגר כביסה C (שולחן 1) על ידי סיבוב עדין ב RT במשך 5 דקות.
- לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של מאגר כביסה D (טבלה 1) על ידי סיבוב ב RT במשך 5 דקות.
- לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח(שולחן 1).
9. עיכול RNA חלקי
- לעשות דילול10 5-קיפולשל MNase עם מאגר תגובה MNase (טבלה 1). הוסף 100 μL של פתרון MNase לכל מדגם. מערבולת החרוזים ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר ב 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s stop) במשך 10 דקות, לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי עבור 30 s ולהסיר את supernatant.
הערה: יש לייעל את הריכוז של MNase עבור חלבונים שונים מחייבי RNA. ריכוז MNase שיכול לעכל RNAs לתוך 30-50 nt שברי (נקבע על-ידי גודל ההוספה של הספריה הסופית) הוא אופטימלי. - לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח + EGTA(שולחן 1). לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant בין כל שלב לשטוף.
- לשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של מאגר כביסה C על ידי סיבוב עדין במשך 5 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח.
10. דפוספורילציה של RNA
- להפוך פוספטאז מעיים עגל (CIP) תגובה לערבב עם 8 μL של 10x CIP מאגר(טבלת חומרים),3 μL של אנזים CIP, ו 69 μL של מים. הנפח הכולל הוא 80 μL לכל תגובה.
- לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. הוסף את תערובת תגובת CIP לחרוזים. מערבולת החרוזים ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר על 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק) במשך 10 דקות.
- לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח + EGTA. לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח.
11. 3' קישור קשירה
- לעשות 3 ' מקשר לערבב עם 4 μL של 20 μM 3 ' מקשר, 4 μL של 10x T4 RNA ליגאס מאגר, 4 μL של 50% PEG8000, 2 μL של T4 RNA ligase 2 (נחתך), ו 26 μL של מים. הנפח הכולל הוא 40 μL לכל תגובה.
- לאסוף את החרוזים מ שלב 10.3 עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. להוסיף 40 μL של 3 ' מקשר קשירה לחרוזים. מערבולת החרוזים ב 16 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר על 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק) עבור 3 שעות או לילה.
- לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח + EGTA. לשטוף במהירות את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח.
12. טיפול PNK
- לעשות תערובת PNK עם 4 μL של 10x PNK מאגר, 2 μL של אנזים PNK T4, μL 1 של 10 mM ATP, ו 33 μL של מים. הנפח הכולל הוא 40 μL לכל תגובה.
- לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. להוסיף 40 μL של תערובת PNK לחרוזים. מערבולת החרוזים בעדינות ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר על 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק) במשך 10 דקות.
- לשטוף במהירות את החרוזים עם 500 μL של חיץ PNK / EGTA קר כקרח.
- לשטוף במהירות את החרוזים עם 500 μL של חיץ PNK קר כקרח. שמור 5% מהחרוזים לניתוח כתמי כתמים מערביים או כסופים כדי לאשר את היעילות של פירוק חיסוני.
13. בידוד RNA
- לאסוף את החרוזים מ שלב 12.4 עם מעמד מגנטי ולהסיר את המאגר. להוסיף 200 μL של חלבון K עיכול מאגר(שולחן 1). מערבולת החרוזים במשך 30 דקות ב 37 ° C עם מיקסר תרמי להגדיר ב 1,200 סל"ד (5 s לרוץ, 30 s להפסיק). לבודד מגנטית את החרוזים ולקחת את supernatant לניסוי.
- מוסיפים 400 μL של ריגנט בידוד RNA (טבלת חומרים) לסופרנט משלב 13.1, מערבבים ביסודיות, וגרה על קרח במשך 5 דקות. מוסיפים 80 μL של כלורופורם ומערבבים היטב ולאחר מכן דגירה על קרח במשך 5 דקות. סובב עם 12,000 x גרם למשך 10 דקות ו-4°C.
הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה מנוע כימי. - קח את supernatant (~ 500 μL) ולהוסיף שני כרכים של isopropanol:אתנול לערבב (1:1), 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט (pH = 5.5), ו 1 μL של גלוקוגן. מקפיאים ב-20°C למשך 2 שעות. צנטריפוגה ב-4°C עם 12,000 x גרם ל-20 דקות.
- לשטוף את הגלולה 2x עם קר כקרח 70% אתנול. סובבו את הגלולה ב-4°C עם 12,000 x גרם למשך 5 דקות. מסירים את הסופרנט וייבשים את הגלולה. לפזר את RNAs ב 5 μL של RNase חינם H2O.
14. 5' רצועה מקשר RNA
- לעשות 5 ' תמהיל קשירה RNA עם 1 μL של 10x T4 RNA ליגאז מאגר, 0.5 μL של BSA (1 μg / μL), 1 μL של 10 mM ATP, 1 μL של מעכב RNase, ו 0.5 μL של T4 RNA ligase. הנפח הכולל הוא 4 μL לכל תגובה.
- הוסף 1 μL של 5 ' 20 μM RNA מקשר RNA מ שלב 13.4, denature RNA על ידי חימום ב 70 ° C במשך 2 דקות, ולהירגע על קרח באופן מיידי.
- הוסף את תערובת קשירה RNA 5 ' RNA משלב 14.2. דגירה ב 16 מעלות צלזיוס בלילה.
15. שעתוק הפוך
- לטהר את RNAs כמתואר בסעיף 13 ולהמיס את RNA עם 11.5 μL של מים ללא RNase.
- מוסיפים 1 μL של 10 μM פריימר שעתוק הפוך RNA מטוהר, חום ב 70 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות, ומצננים על קרח באופן מיידי.
- לעשות תמהיל שעתוק הפוך עם 4 μL של 5x מאגר שעתוק הפוך, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 0.1 M DTT, 1 μL של מעכב RNase, ו 0.5 μL של תעתיק הפוך(טבלת חומרים). הנפח הכולל הוא 7.5 μL לכל תגובה.
- להוסיף 7.5 μL של תמהיל שעתוק הפוך ל-RNA, דגירה ב 50 °C במשך 30 דקות, ולעצור את התגובה על ידי דגירה ב 70 ° C במשך 10 דקות. לעזוב ב-4 מעלות צלזיוס.
16. הגבירת PCR
- הפוך לערבב ההגדלה PCR עם 15 μL של 2x PCR אב תערובת(טבלת חומרים),5 μL של cDNA משלב 15.4, 0.6 μL של פריימר 10 μM קדימה 1 (טבלה 2), 0.6 μL של פריימר הפוך 10 μM 1 (טבלה 2), ו 8.8 μL של H2O. הנפח הכולל הוא 30 μL.
- הגביר את ה- cDNA עם ההגדרות הבאות: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (חזור על שלבים 2-4 עבור 15-20 מחזורים), 72 °C 2 דקות והחזק ב- 4 °C. הפעל את מוצר PCR על ג'ל agarose 2-3%. חותכים את ה-DNA של ~ 100-150 bp, לחלץ DNA עם ערכת חילוץג'ל (טבלת חומרים),ולתקוע את ה-DNA עם 20 μL של מים.
- קח 3 μL של מוצר PCR מטוהר, להגביר עם פריימר קדימה 2 (טבלה 2) והפוך פריימר 2 (פריימר אינדקס; שולחן 2) כמתואר בשלב 16.2 עבור חמישה מחזורים כדי להציג רצפי אינדקס. טהר את מוצר ה- PCR כמתואר בשלב 16.2.
- רצף הספריה עם פלטפורמת רצף בתפוקה גבוהה.
17. ניתוח ביואינפורמטיקה
- בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכניות מסחריות כפי שתואר קודם לכן8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הייצוג השרטוטי של הליך ה-FBIOCLIP-seq מוצג באיור 1. בהשוואה לטיהור זיקה חד-שלבי-שלבי-שלד,טיהור ה-FLAG-ביוטין הסיר כמעט את כל החלבונים הדו-תכליתיים, ומנע זיהום של אינטראקציות עקיפות של חלבון-RNA(איור 2). תוצאות מייצגות עבור FBIoCLIP-seq עבור LIN28 ו- WDR43 מתוארות באיור 3 ואיור 4. ביצענו LIN28 או WDR43 FBIoקליפ-seq עם mESCs. איור 3A מציג את תצוגת המסלול של LIN28 ו- WDR43 FBIoCLIP-seq ב- pre-let-7g. מוטיב GGAG שדווח בטרום-let-7g ואתרים מקושרים שזוהו על ידי FBIoCLIP-seq מוצגים איור 3B. הסיווג של אתרי המוטציה הנקראים על ידי אלגוריתם CIMS הראה כי LIN28 מעדיף לאגד ולקשר צולב לנוקלאוטיד G (איור 3C). מוטיבים RNA מועשר ב LIN28 FBIoCLIP-seq אתרי איגוד מוצגים איור 3D. רצועות מייצגות נוספות של FBIoCLIP-seq ב- LIN28 ו- HNRNPU מוצגות באיור 3E. השוואה של WDR43 ו LIN28 FBIoקליפ-seq הראה דפוסי האיגוד השונים שלהם Rn45 טרום rRNA לוקוס (איור 4). איור 5 מציג את התוצאות המייצגות של אימות תג FLAG וביוטין לאחר בניית קו תא. איור 6 מציג תוצאות מייצגות של טיהור דו-מושבי יעיל (איור 6A) או לא מוצלח ( איור6B) FLAG-IP ו-FLAG-biotin.
איור 1: ייצוג סכמטי של ה-FBIOCLIP. תאים המקושרים UV (שלב 1) הם lysed במאגר lysis (שלב 2). קומפלקס FBRBP-RNA הוא immunoprecipitated באמצעות שרפ (שלבים 3-4). קומפלקס החלבון-RNA המשופר מטוהר עוד יותר עם חרוזים סטרפטאבידין ותנאי שטיפה מחמירים משמשים להסרת אינטראקציות חלבון-חלבון (שלבים 5-6). RNAs מתעכלים חלקית על-ידי MNase ושברי RNA שאינם קשורים לחלבון מוסרים על-ידי שטיפה נוספת (שלבים 7-8). לאחר מכן, ה- RNAs מנוקבים ומקוגרים באמצעות מקשר של 3 אינץ' (שלב 9). לאחר מכן RNAs הם זרחן וsed על ידי טיפול חלבון K (שלב 10). RNAs מטוהרים קשורים עם מקשר RNA 5 ' המכיל ברקוד אקראי 6 nt (שלב 11). לאחר שעתוק הפוך (שלב 12), ספריית cDNA מתעצמת עם PCR ומבוצעת רצף תפוקה גבוהה (שלבים 13-15). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: טיהור טנדם FLAG-ביוטין מסיר חלבונים copurified. כתמי כסף של FBWDR43 הראו כי כמעט כל החלבונים אינטראקציה המוצגים FLAG- או ביוטין בתיווך טיהור צעד אחד בוטלו לאחר שטיפה מחמירה בטיהור דו-מושבי. דגל: טיהור זיקה מתווכת דגל, SA: סטרפטאבידין מתווכים ביוטין טיהור, טנדם: טיהור דגל-ביוטין טנדם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תוצאות מייצגות של LIN28 FBIoקליפ-seq. (A)מעקב אחר תגיות LIN28 FBIoקליפ-seq ומוטציה קורא על ידי CIMS ב RNA pre-let-7g. התגים המוצגים הם קריאה ייחודית של FBIOCLIP-seq. בסך הכל, ~ 7.7 מיליון קורא ייחודי עבור LIN28 FBIoקליפ-seq ו ~ 2.2 מיליון קורא ייחודי עבור WDR43 FBIoCLIP-seq אוחזרו לאחר הסרת קורא מיותר. (ב)אתרים מקושרים על מוטיב GGAG של rna pre-let7-g על ידי LIN28 FBIoקליפ-seq. החצים מציינים את האתרים המקושרים. (ג)אחוז הנוקלאוטידים שעברו מוטציה בסוגים שונים של מוטציות. ג'י הוא הנוקלאוטיד המקושר והמוטציה השכיח ביותר. אקראי: התפלגות אקראית של ארבעת הנוקלאוטידים. (D)מוטיבים מחייבים של LIN28 חזוי על ידי FBIOCLIP-seq עם אלגוריתם הומר. (ה)מעקב אחר תצוגות של LIN28 FBIoקליפ-seq על LIN28 ו HNRNPU mRNAs. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של WDR43 ו- LIN28 FBIoCLIP-seq על לוקוס Rn45S. מעקב אחר תצוגה של WDR43 ו LIN28 FBIoקליפ-seq על לוקוס Rn45S. WDR43 ו- LIN28 הראו דפוסי איגוד שונים ב- pre-rRNA. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של אימות תג FLAG וביוטין. FLAG או כתם ביוטין מערבי מאמת את התיוג של קווי התא. שיבוטים #1, #2, #4 הראו ביטוי יעיל וביוטינילציה של התג בעוד #3 הראו ביטוי גרוע של החלבון מתויג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: תוצאות מייצגות של אימות יעילות פירוק של FLAG וטיהור דו-מושבי. (א)דוגמה לטיהור יעיל של חלבון מתויג על ידי FLAG וטיהור זיקה ביוטין. (ב)דוגמה לטיהור לא יעיל של חלבון מתויג על ידי טיהור FLAG וביוטין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| מאגר | הרכב |
| מאגר טעינת SDS | 50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 0.1% ברומומנובללו, 10% גליצטרול, 100 mM DTT |
| מאגר כביסה A | 1 pBS, 0.5% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS |
| מאגר כביסה B | 5 pBS, 0.5% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS |
| מאגר כביסה C | 50 mM tris pH 7.4, 2% SDS |
| מאגר כביסה D | 5x PBS, 0.5% NP-40, 0.5% SDS, 1 M urea |
| מאגר PNK | 50 mTris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| מאגר תגובה MNase | 10 מ'מ-ג',ק.י. 8.0, 1 מ"מ |
| מאגר PNK+EGTA | 50 מ'מ טריס 7.4, 0.5% NP-40, 10 מ'-מ' EGTA |
| מאגר עיכול של חלבון K | 50 מ'מ מ', טריס pH 7.4, 10 מ"ר אדטה, 50 מ"ר NaCl, 0.5% SDS, 20 μg של חלבון K |
טבלה 1: הרכב מאגרים המשמשים במחקר זה.
| שם אוליגו | רצף | הערות | ||||
| מקשר 3' | ראגאגה קאקקט-NH2 | |||||
| מקשר RNA של 5 אינם | גוקאגאגוקאקאקאגוגוגהג'וקנן | |||||
| פריימר RT | ג'ורג'יה | |||||
| פריימר קדמי 1 | ג'י.טי.ג'י.טי.גטקטק | |||||
| פריימר הפוך 1 | ג'ורג'יה | |||||
| פריימר קדמי 2 | אתאגאט אצ'קגאגאטקטג'אק | |||||
| פריימר הפוך 2 | קאגאגאטגאטגטגאגאטטגאגגג'יגהגטגטגגטק-ס-טי | הרצפים האדומים והמסווים בקו תחתון מייצגים רצף אינדקס של אילומינה. | ||||
טבלה 2: אוליגונוקלאוטידים המשמשים במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoCLIP-seq, ניצול של מערכת תיוג כפול FLAG-ביוטין כדי לבצע טיהור טנדם של תסביכי חלבון-RNA. מערכת התיוג הכפול FLAG-biotin הוכחה כחזקת עוצמה בזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבוןוחלבון-DNA 13,21. כאן אנו מדגימים את הייפציפיות והנוחות הגבוהות של מערכת זו בזיהוי RNAs אינטראקציה עם חלבונים. באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, דילגנו על שלב העברת SDS-PAGE וממברנה מאתגר, כך שיותר אינטראקציות של חלבון-RNA נשמרו ולהימנע מאותות RNA מזוהמים בתיווך RBPs באותו מתחם. חוץ מזה, מעקף של שלבים אלה מונע תיוג של RNA עם ATP עם תווית רדיו. זה עושה את ההליך הרבה יותר קל. שים לב כי במהלך הכנת הפרסום שלנו, שיטה דומה בשם UVCLAP הוצע גם24.
מספר שלבים חשובים להצלחת הפרוטוקול. ראשית, היעילות של הביו-טינילציה של החלבון המתויג צריכה להיות מאושרת על ידי כתם מערבי לפני הניסוי (איור 5). שנית, ההתחכך היעילה של חלבון מטוהר על ידי 3 x פפטיד FLAG נדרשת להגברה מוצלחת של אותות RNA. החרוזים מ שלב 12.4 יש לנתח עם כתם מערבי או כתם כסף כדי להבטיח כי כמות סבירה של חלבון היעד מאוחזר(איור 6). כדי להגביר את היעילות, או להגדיל את ריכוז פפטיד 3 x FLAG בשלב 6 עד 500 ng/mL או לחזור על שלב ההתחכות מספר פעמים כדי לקבל ייצור טוב יותר. שלישית, זה אופטימלי כדי titrate ריכוז MNase עבור כל חלבון בניסוי הראשון. קיבה יתר או טיפול לא מספיק עלולים להוביל לברי RNA בגדלים בלתי הולמים. לבסוף, הפרוטוקול מכיל שני סבבים של טיהור זיקה ושטיפה מחמירה ביותר. רק כמות קטנה של RNAs מטוהרים מאוחזרת. ריאגנט צריך להיות RNase ללא ולהימנע השפלה RNA לאחר שלב טיפול MNase.
למרות הקלות של שיטה זו, יש עדיין כמה היבטים שניתן לשפר. לדוגמה, קשירה של מתאם בגודל 5 אינץ' ל-RNA ישירות עשויה להגביל את שחזור האותות מכיוון שחלק משמעותי של שעתוק הפוך יסתיים על ידי שאריות פפטידים מקושרים. המחקר הנוכחי שלנו מבוסס בעיקר על ביטוי חוץ-טאופי של חלבונים מתויגים, מה שעשוי להוביל לחפצים מסוימים בשל ביטוי יתר של חלבונים. כדאי לשפר את השיטה על ידי החדרת התג לתוך הלוקוס אנדוגני. מערכת CRISPR/Cas9 הופכת את בניית קו התאים לקלה וניתנה הרבה יותר. מחקרים מסוימים יישמו את הניסוי eCLIP-seq לרקמות עכבר25. נגזרת של עכברים לדפוק-in עם התג הכפול הוא גם כיוון פוטנציאלי ומבטיח בשיפור ויישום של שיטת ה-FBIOCLIP-seq. יתר על כן, חוץ-חוץ מבוטא חיידקי BirA ligase עלול להוביל אירועים ביוטינילציה בלתי צפויים ב vivo. תיוג החלבון עשוי להשפיע גם על תפקודיו הביולוגיים.
מספר רב של מחקרים הראו כי ביטוי הגן האפיגנום של תאים הם הטרוגניים במקום הומוגני לחלוטין, המצביע על כך שזה יקר ללמוד את רשת האינטראקציה ברמה של תא אחד. מספר אסטרטגיות פותחו כדי ללמוד את התמליל והאפיגנום של תאים בודדים. עם זאת, לא דווח על אסטרטגיות לנתח את האינטראקציה של חלבון-RNA ברמת תא אחד. ללא ג'ל denatured פועל וצעדי העברת קרום, FBIoCLIP-seq יכול לשמר אותות נוספים, מה שהופך את זה אסטרטגיה פוטנציאלית ללמוד אינטראקציות חלבון-RNA ברמה של תא יחיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
תמיכה במענק היא מהתוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31630095) והמרכז למדעי החיים באוניברסיטת צגחואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M.
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
