Summary
Her præsenterer vi en modificeret CLIP-seq protokol kaldet FbioCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rensning for at bestemme RNA-målene for RNA-bindende proteiner (RBPs) i pattedyrceller.
Abstract
RNA- og RNA-bindende proteiner (RBP' er) styrer flere biologiske processer. Den rumlige og tidsmæssige placering af RNA'er og ringmekanismer ligger til grund for den skrøbelige regulering af disse processer. En strategi kaldet CLIP-seq (krydsbinding og immunfrit) er udviklet til at indfange endogene protein-RNA interaktioner med UV cross-linking efterfulgt af immunoprecipitation. På trods af den udbredte brug af konventionel CLIP-seq-metode i RBP-studiet er CLIP-metoden begrænset af tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet, potentielle forurenende stoffer fra de copurified RBP'er, kravet om isotopmanipulation og potentielt tab af oplysninger under en kedelig forsøgsprocedure. Her beskriver vi en modificeret CLIP-seq metode kaldet FbioCLIP-seq ved hjælp af FLAG-biotin tag tandem rensning. Gennem tandemrensning og strenge vaskebetingelser fjernes næsten alle interagerende RNA-bindende proteiner. De RNA'er, der indirekte medieres af disse copurified RBP'er, er således også reduceret. Vores FbioCLIP-seq-metode muliggør effektiv påvisning af direkte proteinbundne RNA'er uden SDS-PAGE- og membranoverførselsprocedurer på en isotopfri og proteinspecifik antistoffri måde.
Introduction
RNA'er og RNA-bindende proteiner (RBP' er) styrer forskellige cellulære processer, herunder splejsning, oversættelse, ribosombiogenese, epigenetisk regulering og celle fate transition1,2,3,4,5,6. De sarte mekanismer i disse processer afhænger af den unikke rumlige og tidsmæssige arrangement af RNA'er og RBP'er. Derfor er et vigtigt skridt i retning af at forstå RNA-regulering på molekylært niveau at afsløre positionelle oplysninger om de bindende steder af RBPs.
En strategi kaldet krydsbinding og immunafhentning (CLIP-seq) er udviklet til at indfange protein-RNA-interaktioner med UV-krydsbinding efterfulgt af immunafhentning af protein af interesse7. Det vigtigste træk ved metoden er induktionen af kovale krydsforbindelser mellem et RNA-bindende protein og dets direkte bundne RNA-molekyler (inden for ~ 1 Å) ved UV-bestråling8. RBP-fodsporene kan bestemmes af CLIP-tagklynger og spidsopkald, som normalt har en opløsning på 30−60 nt. Alternativt kan den omvendte transskriptionstrin af CLIP føre til indels (indsættelser eller sletninger) eller erstatninger til krydsbindingsstederne, hvilket gør det muligt at identificere proteinbindingssteder på RNA'erne ved en opløsning af en enkelt nukleotid. Der er udviklet rørledninger som Novoalign og CIMS til analyse af sekventeringsresultaterne med høj kapacitet i CLIP-seq8. Der er også foreslået flere modificerede CLIP-seq-metoder, herunder individuel nukleotidopløsning krydsbinding og immunudfrielse (iCLIP), forbedret CLIP (eCLIP), irCLIP og fotoaktivatable ribonucleoside-enhanced cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
På trods af den udbredte brug af traditionelle CLIP-seq metoder i studiet af RBPs, CLIP metoder har flere ulemper. For det første kan den kedelige denatureret gelelektroforese og membranoverførselsprocedure føre til tab af information og forårsage begrænset sekvenskompleksitet. For det andet kan den proteinspecifikke antistofbaserede CLIP-metode trække et proteinkompleks ned i stedet for et enkelt målprotein, hvilket kan føre til falske positive protein-RNA-interaktioner fra de kopurified RBPs. For det tredje kræver den antistofbaserede strategi en stor mængde antistoffer af høj kvalitet, hvilket gør anvendelsen af disse metoder utilstrækkelig til undersøgelse af ringmekanismer uden antistoffer af høj kvalitet. For det fjerde kræver den traditionelle CLIP-metode radioaktivt mærkede ATP for at mærke de proteinbundne RNA'er.
Den høje affinitet af streptavidin til biotinylerede proteiner gør det til en meget kraftfuld tilgang til at rense specifikke proteiner eller protein komplekser. Den effektive biotinylation af proteiner, der bærer en kunstig peptid sekvens ved ektopisk udtrykt bakteriel BirA biotin ligase i pattedyr celler gør det til en effektiv strategi for at udføre biotin rensning in vivo13. Vi udviklede en modificeret CLIP-seq metode kaldet FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-medieret Cross-lhåndskrift og jegmmunoprecipitation efterfulgt af høj-throughput sekventering) ved hjælp af FLAG-biotin tag tandemrensning 14 (Figur 1). Gennem tandemrensning og strenge vaskebetingelser fjernes næsten alle de interagerende ringmekanismer med sideløbende ringmekanismer med samme måde (figur 2). De strenge vaskebetingelser gør det også muligt at omgå SDS-PAGE og membranoverførsel, som er arbejdskrævende og teknisk udfordrende. Og svarende til eCLIP og irCLIP, FbioCLIP-seq metode er isotop-fri. Ved at springe gelen over løbende og overføre trin undgår du tab af information, holder autentiske protein-RNA-interaktioner intakte og øger bibliotekets kompleksitet. Desuden gør mærkningssystemets høje effektivitet det til et godt valg for ringmekanismer uden antistoffer af høj kvalitet.
Her giver vi en trinvis beskrivelse af FbioCLIP-seq-protokollen for pattedyrceller. Kort, celler er krydsforbandet med 254 nm UV, efterfulgt af celle lysis og FLAG immunoprecipation (FLAG-IP). Dernæst renses protein-RNA-komplekserne yderligere ved biotinaffæritetsfangst, og RNA'er er fragmenteret ved delvis fordøjelse med MNase. Derefter dephosphorylated det proteinbundne RNA og ligated med en 3' linker. Der tilsættes en 5' RNA-linker, når RNA'et er fosforyleret med PNK og eluteret ved proteinase K-fordøjelse. Efter omvendt transskription forstærkes de proteinbundne RNA-signaler af PCR og renses ved agarosegelrensning. To RBPs blev valgt til at eksemplificere FbioCLIP-seq resultat. LIN28 er et vel karakteriseret RNA-bindende protein, der er involveret i mikroRNAmodning, proteinoversættelse og celleomprogrammering15,16,17. WDR43 er et WD40 domæne-holdige protein menes at koordinere ribososom biogenese, eukaryote transskription, og embryonale stamceller pluripotency kontrol14,18. I overensstemmelse med tidligere rapporterede resultater for LIN28 med CLIP-seq, FbioCLIP-seq afslører bindende steder af LIN28 på "GGAG" motiver i microRNA mir-let7g og mRNAs16,19 (Figur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identificerede også den bindende præference for WDR43 med 5' eksterne transskriberede afstandsholdere (5'-ETS) af præ-rRNAs20 (Figur 4). Disse resultater validere pålideligheden af FbioCLIP-seq metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellelinjekonstruktion
- Klon genet af interesse i en PiggyBac vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA af interesse]-(Hygromycin-resistente) plasmid, der bærer en FLAG-biotin epitop13,21 til at udtrykke en FLAG-biotin tag smeltet RBP (FBRBP).
- Cotransfect FBRBP udtrykke vektor med pBase vektor i en celle linje, der udtrykker BirAenzym 22.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev FBRBP-genet transficeret i museembrynale stamceller (mESC'er) med en integreret BirA-ekspressionsvektor21. Alternativt kan FBRBP udtrykke vektor cotransfected i celler med pBase og pPiggyBac-BirA-V5 sammen. - Dyrk cellerne i mESC på gelatinerede fade og vedligeholde i mES kultur medium (Tabel af Materialer) i 5% CO2 ved 37 °C. De transficerede celler markeres med hygromycin b (100 μg/ml) i 1 uge.
- Efter lægemiddelvalg høstes celler ved hjælp af SDS-lastningsbuffer ( tabel1) og brug en Western blot23 til at bekræfte mærkningen og ekspressionen af genet med henholdsvis ET FLAG-antistof og streptavidin-HRP.
2. Krydsbinding
- Plade ~3 x 106 mES-celler i en 10 cm plade 1 dag før forsøget, så cellerne vokser til 70−90% sammenløb, når de høstes (~5−10 millioner celler pr. prøve).
- Fjern mediet med et vakuum. Behandl cellerne med 2 ml 0,25% trypsin-EDTA i 2 min ved stuetemperatur (RT) og dæmp trypsinen med 4 ml frisk mESC-medium. Cellerne overføres til et centrifugerør på 15 ml. Cellerne drejes ved centrifugering ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
- Ophæng cellerne med 4 ml koldt PBS, og plade cellerne skal pladen afsendes til 10 cm pladen til krydsbinding. Krydsforbindelse cellerne ved stråling med 254 nm UV-lys (indstil UV cross-linker med en parameter på 400 mJ/cm2).
BEMÆRK: For cellemonstratorer kan cellerne krydsforbandes med UV-lys direkte på pladen, før trypsinbehandling. - Overfør de krydsforbundne celler til et 15 ml rør. Drej ned ved centrifugering ved 300 x g i 3 min ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
BEMÆRK: Den krydsforbundne cellepellet kan opbevares ved -80 °C indtil brug.
3. Forberedelse af cellelysat
- Lyse cellerne med 500 μL vaskepude A (Tabel 1) suppleret med 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteasehæmmercocktail og 400 U/mL RNase-hæmmer. Overfør cellerne til et RNase-frit 1,5 ml rør. Cellerne inkuberes i 30−60 minutter på en rotor med en forsigtig rotation ved 4 °C.
- Lysatet behandles med 30 μL DNase I ved 37 °C i 10 min. Reaktionen standses ved at tilsætte 4 μL 0,5 M EDTA. Den uopløselige pellet med 12.000 x g drejes i 20 minutter ved 4 °C, og supernatanten overføres til et nyt forskudt 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Hold dig på is til øjeblikkelig brug. Hvis supernatanten ikke anvendes med det samme, opbevares den ved -80 °C, indtil det tages i brug.
4. FLAG perler forberedelse
- Der tilsættes 40 μL gylleFLAGperler pr. prøve til et frisk 1,5 ml rør.
- Vask hurtigt perlerne med 0,5 ml iskold vaskepude A og drej med 3.000 x g i 2 min. ved 4 °C.
- Gentag trin 4.2 én gang. Drej perlerne ned med 3.000 x g i 2 min ved 4 °C. Fjern forsigtigt bufferen med en smal-end pipette spids. Undgå at fjerne perlerne.
5. Immunoprecipitation
- Cellerepeat fra trin 3.2 overføres til de præ-ligevægtede FLAG perler. Alle prøverne roteres på en rulleryser ved 4 °C forsigtigt. Flagperlerne inkuberes med lysat i 2−4 timer eller natten over.
- Centrifuge perlerne i 2 min ved 3.000 x g og fjern supernatanten.
- Perlerne vaskes med 0,5 ml forskudt vaskepude A ved inkubation i 5 min i en rotator ved 4 °C, drej perlerne ned med 3.000 x g i 2 min. og fjern supernatanten. Gentag vask 1x.
- Vasken gentages 2x som beskrevet i trin 5.3 med 0,5 ml forskudsvaskebuffer B (tabel 1).
6. Elution med 3x FLAG peptid
- Der klargør 3x FLAG-elutionopløsningsopløsning ved at opløse 1 mg 3x FLAG-peptid med 5 ml vaskepude A til en endelig koncentration på 200 ng/ml.
- Drej FLAG perlerne ned fra trin 5.4 med 3.000 x g i 2 min. Fjern supernatanten forsigtigt. Sørg for, at det meste af supernatanten fjernes ved hjælp af en smal endepipettespids.
- Der tilsættes 200 μL 3x FLAG-opløsning til hver prøve. Prøverne inkuberes med en skånsom omdrejning i 30 minutter ved 4 °C. Drej FLAG perlerne ned i 2 min ved 3.000 x g. Overfør supernatanterne til friske rør.
- Gentag elution 2x som beskrevet i trin 6.2 og 6.3 og pool eluerne sammen. Spar 5% af eluer til Western blot analyse eller sølv farvning for at kontrollere effektiviteten af FLAG-IP.
7. Streptavidin perler forberedelse
- Der tilberedes 50 μL streptavidin perleslæd for hver prøve. Saml perlerne med en magnetisk stativ til 30 s og fjern supernatanten med en pipettespids.
- Vask hurtigt perlerne med 0,5 ml iskold vaskepude A og opsaml perlerne med en magnetisk stander til 30 s.
- Gentag vask 1x. Fjern supernatanten efter vasken.
8. Rensning af affinitet for Biotin
- De samlede elluenter overføres fra trin 6.4 til streptavidinperlerne fra trin 7.3, og prøverne roteres forsigtigt ved 4 °C i 1-3 timer eller natten over.
- Saml perlerne med en magnetisk stativ i 30 s og fjern supernatanten. Perlerne vaskes 2x med 500 μL vaskepude C (tabel 1) ved forsigtig rotation ved RT i 5 min.
- Saml perlerne med den magnetiske stativ og fjern supernatanten. Perlerne vaskes 2x med 500 μL vaskepude D (tabel 1) ved rotation ved RT i 5 min.
- Saml perlerne med den magnetiske stativ og fjern supernatanten. Vask hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK-buffer (tabel 1).
9. Delvis RNA-fordøjelse
- Lav en 105-foldfortynding af MNase med MNase reaktion buffer (Tabel 1). Der tilsættes 100 μL MNase-opløsning til hver prøve. Vortex perlerne ved 37 °C med en termisk mixer indstillet til 1.200 rpm (5 s løb, 30 s stop) i 10 min, indsamle perlerne med en magnetisk stå i 30 s og fjern supernatant.
BEMÆRK: Koncentrationen af MNase skal optimeres til forskellige RNA-bindende proteiner. MNase-koncentrationen, der kan fordøje RNA'er i 30−50 nt fragmenter (bestemt af størrelsen af indsættelsen af det endelige bibliotek) er optimal. - Vask hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK+EGTA-buffer (tabel 1). Saml perlerne med en magnetisk stativ og fjern supernatanten mellem hvert vasketrin.
- Perlerne vaskes 2x med 500 μL vaskepude C ved forsigtig rotation i 5 min. ved RT. Vask derefter hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK-buffer.
10. Dephosphorylation af RNA
- Lav en kalv tarm fosfatase (CIP) reaktion blandes med 8 μL 10x CIP buffer(Tabel over materialer),3 μL CIP enzym, og 69 μL vand. Det samlede volumen er 80 μL pr. reaktion.
- Saml perlerne med en magnetisk stativ og fjern bufferen. Tilsæt CIP reaktion mix til perlerne. Vortex perlerne ved 37 °C med en termisk mixer indstillet til 1.200 rpm (5 s løb, 30 s stop) i 10 min.
- Vask hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK+EGTA buffer. Vask hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK buffer.
11. 3' linker ligation
- Lav et 3' linkermix med 4 μL 20 μM 3' linker, 4 μL 10x T4 RNA ligase buffer, 4 μL af 50% PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (afkortet) og 26 μL vand. Det samlede volumen er 40 μL pr. reaktion.
- Saml perlerne fra trin 10.3 med en magnetisk stativ og fjern bufferen. Der tilsættes 40 μL af 3' linker ligationsblandingen til perlerne. Vortex perlerne ved 16 °C med en termisk mixer indstillet til 1.200 rpm (5 s løb, 30 s stop) i 3 timer eller natten over.
- Vask hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK+EGTA buffer. Vask hurtigt perlerne 2x med 500 μL iskold PNK buffer.
12. PNK behandling
- Lav en PNK blanding med 4 μL 10x PNK buffer, 2 μL T4 PNK enzym, 1 μL 10 mM ATP og 33 μL vand. Det samlede volumen er 40 μL pr. reaktion.
- Saml perlerne med en magnetisk stativ og fjern bufferen. Tilsæt 40 μL PNK mix til perlerne. Vortex perlerne forsigtigt ved 37 °C med en termisk mixer indstillet til 1.200 rpm (5 s løb, 30 s stop) i 10 min.
- Vask hurtigt perlerne med 500 μL iskold PNK+EGTA buffer.
- Vask hurtigt perlerne med 500 μL iskold PNK-buffer. Spar 5% af perlerne til vestlig eller sølv farvning analyse for at bekræfte effektiviteten af immunoprecipitation.
13. RNA-isolation
- Saml perlerne fra trin 12.4 med en magnetisk stativ og fjern bufferen. Der tilsættes 200 μL proteinase K-fordøjelsesbuffer (tabel 1). Vortex perlerne i 30 min ved 37 °C med en termisk mixer indstillet til 1.200 rpm (5 s løb, 30 s stop). Magnetisk isolere perlerne og tage supernatant til eksperimentet.
- Der tilsættes 400 μLRNA isolationsreagesegen ( materialetabel ) til supernatanten fra trin 13.1, blandes grundigt og inkuberes på is i 5 min. Tilsæt 80 μL chloroform og bland grundigt og derefter inkuberes på is i 5 min. Spin ned med 12.000 x g i 10 min 4 °C.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i en kemisk hætte. - Tag supernatanten (~500 μL) og tilsæt to volumener isopropanol:ethanolblanding (1:1), 1/10 volumen af 3 M natriumacetat (pH = 5,5) og 1 μL glykogen. Frys ved -20 °C i 2 timer. Centrifuge ved 4 °C med 12.000 x g i 20 min.
- Vask pellet 2x med iskold 70% ethanol. Drej pellet ved 4 °C med 12.000 x g i 5 min. Fjern supernatanten og tør pellet. RNA'erne opløses i 5 μL RNase-fri H2O.
14. 5' RNA-linker ligation
- Der laves en 5' RNA-ligationsblanding med 1 μL 10x T4 RNA ligasebuffer, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 μL af 10 mM ATP, 1 μL RNase-hæmmer og 0,5 μL T4 RNA ligase. Det samlede volumen er 4 μL pr. reaktion.
- Der tilsættes 1 μL 5' 20 μM RNA-linker til RNA fra trin 13.4, der proteser RNA'et ved opvarmning ved 70 °C i 2 min. og chill straks på is.
- Der tilsættes 5' RNA ligationsblandingen til RNA'et fra trin 14.2. Inkuberes ved 16 °C natten over.
15. Omvendt transskription
- Rnas som beskrevet i afsnit 13 renses, og RNA'et opløses med 11,5 μL RNasefrit vand.
- Der tilsættes 1 μL af 10 μM omvendt transskriptionsprimer til det rensede RNA, opvarmes ved 70 °C i 2 min. og chill straks på isen.
- Lav en omvendt transskriptionsblanding med 4 μL 5x omvendt transskriptionsbuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNase-hæmmer og 0,5 μL omvendt transskription (tabel over materialer). Det samlede volumen er 7,5 μL pr. reaktion.
- Der tilsættes 7,5 μL omvendt transskriptionsblanding til RNA'et, inkuberes ved 50 °C i 30 minutter, og reaktionen stoppes ved inkubation ved 70 °C i 10 min. Lad ved 4 °C.
16. PCR-forstærkning
- Lav et PCR-forstærkningsmix med 15 μL 2x PCR-mastermix (Materialetabel),5 μL cDNA fra trin 15.4 0,6 μL af 10 μM fremprimer 1 (Tabel 2), 0,6 μL af 10 μM omvendt primer 1 (Tabel 2) og 8,8 μL H2O. Det samlede volumen er 30 μL.
- CDNA forstærkes med følgende indstillinger: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (gentag trin 2−4 i 15−20 cyklusser), 72 °C 2 min, og hold ved 4 °C. Kør PCR-produktet på en 2−3% agarosegel. Skær DNA'et på ~100−150 bp, ekstrakt DNA med geludsugningssæt (Materialetabel),og eluter DNA'et med 20 μL vand.
- Der skal være 3 μL af det rensede PCR-produkt, forstærkes med fremadrettet primer 2 (tabel 2) og vende primer 2 (indeksprimer; Tabel 2) som beskrevet i trin 16.2 for fem cyklusser for at indføre indekssekvenser. Rens PCR-produktet som beskrevet i trin 16.2.
- Sekvenser biblioteket med en sekvenseringsplatform med høj overførselshastighed.
17. Bioinformatikanalyse
- Udfør dataanalyse ved hjælp af kommercielle programmer som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skematiske repræsentation af FbioCLIP-seq-proceduren er vist i figur 1. Sammenlignet med FLAG-medieret eller streptavidin-medieret et-trins affinitetsrensning fjernede FLAG-biotin tandemrensning næsten alle kopurificerede proteiner, så man undgik forurening af indirekte protein-RNA-interaktioner (Figur 2). Repræsentative resultater for FbioCLIP-seq for LIN28 og WDR43 er afbildet i figur 3 og figur 4. Vi udførte LIN28 eller WDR43 FbioCLIP-seq med mESCs. Figur 3A viser sporvisningen af LIN28 og WDR43 FbioCLIP-seq i pre-let-7g. Den rapporterede GGAG motiv i pre-let-7g og de krydsforbundne websteder identificeret af FbioCLIP-seq er vist i figur 3B. Klassificeringen af mutationssteder kaldet af CIMS algoritme viste, at LIN28 foretrækker at binde og krydsforbindelse til G nukleotid (Figur 3C). De berigede RNA motiver i LIN28 FbioCLIP-seq bindingssteder er vist i figur 3D. Mere repræsentative spor af FbioCLIP-seq på LIN28 og HNRNPU er vist i figur 3E. Sammenligning af WDR43 og LIN28 FbioCLIP-seq viste deres forskellige bindende mønstre i Rn45 pre-rRNA locus (Figur 4). Figur 5 viser de repræsentative resultater af VALIDERING AF FLAG og biotinkode efter cellelinjekonstruktion. Figur 6 viser repræsentative resultater af effektiv (Figur 6A) eller mislykket (Figur 6B) FLAG-IP og FLAG-biotin tandem rensning.
Figur 1: Skematisk repræsentation af FbioCLIP. UV-krydsforbundne celler (trin 1) lyses i lysisbuffer (trin 2). FBRBP-RNA-komplekset immunrecipiteres ved hjælp af anti-FLAG harpiks (trin 3−4). Det eluterede protein-RNA-kompleks renses yderligere med streptavidin perler, og strenge vaskebetingelser bruges til at fjerne proteinproteininteraktioner (trin 5−6). RNA'er fordøjes delvist af MNase, og ikke-proteinbundne RNA-fragmenter fjernes ved yderligere vask (trin 7-8). RNA'erne dephosphorylated og ligated med 3 'linker (trin 9). Derefter fosforlades RNA'erne og eluteres ved proteinase K-behandling (trin 10). Rensede RNA'er er ligenet med en 5' RNA-linker, der indeholder en tilfældig stregkode på 6 nt (trin 11). Efter omvendt transskription (trin 12) forstærkes cDNA-biblioteket med PCR, og sekvensering med høj overførselshastighed udføres (trin 13-15). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FLAG-biotin tandemrensning fjerner kopurificerede proteiner. Sølv farvning af FBWDR43 viste, at næsten alle de interagerende proteiner, der præsenteres i FLAG- eller biotin-medieret et-trins rensning blev elimineret efter streng vask i tandem rensning. FLAG: FLAG-medieret affinitetsrensning, SA: streptavidin-medieret biotinrensning, tandem: FLAG-biotin tandem rensning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater af LIN28 FbioCLIP-seq. (A)Track visning af LIN28 FbioCLIP-seq tags og mutation læser kaldes af CIMS i pre-let-7g RNA. De viste tags er unikke læser af FbioCLIP-seq. I alt ~ 7,7 millioner unikke læser for LIN28 FbioCLIP-seq og ~ 2,2 millioner unikke læser for WDR43 FbioCLIP-seq blev hentet efter fjernelse overflødige læser. (B)Cross-linked sites på GGAG motiv af pre-let7-g RNA af LIN28 FbioCLIP-seq. Pilene angiver de kryds linkede websteder. c) Procentdel af muterede nukleotider i forskellige typer mutationer. G er den hyppigste krydsforbundne og muterede nukleotid. Tilfældig: tilfældig fordeling af de fire nukleotider. (D) Forudsagt LIN28 bindende motiver af FbioCLIP-seq med HOMER algoritme. (E)Spor visninger af LIN28 FbioCLIP-seq på LIN28 og HNRNPU mRNAs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater af WDR43 og LIN28 FbioCLIP-seq på Rn45S locus. Track visning af WDR43 og LIN28 FbioCLIP-seq på Rn45S locus. WDR43 og LIN28 viste forskellige bindingsmønstre på præ-rRNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative resultater af VALIDERING AF FLAG og biotintag. FLAG eller biotin Western blot validerer mærkningen af cellelinjerne. Kloner #1, #2 og #4 viste effektivt udtryk og biotinylation af mærket, mens #3 viste dårligt udtryk for det mærkede protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative resultater af FLAG-immunudratering og validering af tandemrensningseffektivitet. A) Eksempel på effektiv rensning af mærket protein ved FLAG og biotin affinitetsrensning. (B) Eksempel på ineffektiv rensning af mærket protein ved FLAG og biotin affinitetsrensning. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Sammensætning |
| SDS-indlæsningsbuffer | 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 0,1% bromophenolblue, 10% glycerol, 100 mM DTT |
| Vaskebuffer A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholate, 0,1% SDS |
| Vaskebuffer B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholate, 0,1% SDS |
| Vaskebuffer C | 50 mM Tris pH 7,4, 2% SDS |
| Vaskebuffer D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M urea |
| PNK-buffer | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase-reaktionsbuffer | 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA-buffer | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Proteinase K fordøjelsesbuffer | 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 20 μg proteinase K |
Tabel 1: Sammensætning af de buffere, der anvendes i denne undersøgelse.
| Oligo navn | Sekvens | Noter | ||||
| 3' linker | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' RNA-linker | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGUCNNNNN | |||||
| RT primer | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Fremadrettet primer 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Omvendt primer 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Fremadrettet primer 2 | AATGATACGGCGACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Omvendt primer 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T | De røde og understregede sekvenser repræsenterer Illumina-indekssekvensen. | ||||
Tabel 2: Oligonukleotider, der anvendes i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introducerer vi en modificeret CLIP-seq metode kaldet FbioCLIP-seq, drage fordel af FLAG-biotin dobbelt tagging system til at udføre tandem rensning af protein-RNA komplekser. DET DOBBELTE MÆRKNINGssystem FLAG-biotin har vist sig at være effektivt til at identificere proteinprotein- og protein-DNA-interaktioner13,21. Her demonstrerer vi den høje specificitet og bekvemmelighed af dette system i at identificere RNA'er interagere med proteiner. Gennem tandemrensning og strenge vaskeforhold sprang vi det udfordrende SDS-PAGE- og membranoverførselstrin over, så flere protein-RNA-interaktioner blev bevaret, og for at undgå forurenede RNA-signaler medieret af RBP'er i samme kompleks. Udover, bypass af disse trin undgår mærkning af RNA med radioaktivt mærket ATP. Dette gør proceduren meget lettere. Bemærk, at under udarbejdelsen af vores publikation, en lignende metode kaldet uvCLAP er også blevet foreslået24.
Flere trin er vigtige for protokollens succes. For det første skal effektiviteten af biotinyleringen af det mærkede protein bekræftes af Western blot før forsøget (figur 5). For det andet kræves den effektive elution af renset protein med 3 x FLAG-peptid for en vellykket forstærkning af RNA-signalerne. Perlerne fra trin 12.4 skal analyseres med western blot eller sølv farvning for at sikre, at en anstændig mængde målprotein hentes (Figur 6). For at øge effektiviteten skal du enten øge 3 x FLAG-peptidkoncentrationen i trin 6 op til 500 ng/ml eller gentage elution-trinnet flere gange for at få en bedre produktion. For det tredje er det optimalt at titrere MNase-koncentrationen for hvert protein ved det første forsøg. Overdigestion eller utilstrækkelig behandling kan føre til RNA-fragmenter af uhensigtsmæssige størrelser. Endelig indeholder protokollen to runder af affinitetsrensning og meget streng vask. Kun en lille mængde rensede RNA'er hentes. Reagenset skal være RNase-fri og undgå RNA-nedbrydning efter MNase-behandlingstrinnet.
På trods af den lethed af denne metode, er der stadig nogle aspekter, der kan forbedres. For eksempel kan ligation af en 5' adapter til RNA direkte begrænse genvindingen af signalerne, fordi en betydelig del af omvendt transskription vil blive afsluttet med resterende krydsforbundne peptider. Vores nuværende undersøgelse er primært baseret på ektopisk udtryk for mærkede proteiner, hvilket kan føre til nogle artefakter på grund af protein overekspression. Det er værd at forbedre metoden ved at indføre tag i endogene locus. CRISPR/Cas9-systemet gør det meget nemmere og nemmere at bygge cellelinje. Nogle undersøgelser har anvendt eCLIP-seq-eksperimentet på musevæv25. Afledning af knock-in mus med dobbelt tag er også en potentiel og lovende retning i forbedring og anvendelse af FbioCLIP-seq metode. Desuden kan ektopisk udtrykt bakteriel BirA ligase føre til uventede biotinylation begivenheder in vivo. Mærkning af proteinet kan også påvirke dets biologiske funktioner.
Et stort antal undersøgelser har vist, at cellernes genekspression og epigenome er heterogene i stedet for fuldt homogene, hvilket tyder på, at det er værdifuldt at studere interaktionsnetværket på et enkeltcelleniveau. Flere strategier er blevet udviklet til at studere transcriptome og epigenome af enkelte celler. Der er dog ikke rapporteret nogen strategier til at analysere protein-RNA-interaktionen på et enkeltcelleniveau. Uden denaturerede gelløb og membranoverførselstrin kan FbioCLIP-seq bevare flere signaler, hvilket gør det til en potentiel strategi at studere protein-RNA-interaktioner på et enkeltcelleniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Grant support er fra National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095) og Center for Life Sciences på Tsinghua University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
