Summary
Her presenterer vi en modifisert CLIP-seq protokoll kalt FbioCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rensing for å bestemme RNA mål av RNA-bindende proteiner (RBPs) i pattedyr celler.
Abstract
RNA- og RNA-bindende proteiner (RBO-er) kontrollerer flere biologiske prosesser. Det romlige og timelige arrangementet av RNA-er og RBPer ligger til grunn for den delikate reguleringen av disse prosessene. En strategi kalt CLIP-seq (krysskobling og immunforebutning) er utviklet for å fange endogene protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunprecipitation. Til tross for den brede bruken av konvensjonell CLIP-seq-metode i RBP-studien, er CLIP-metoden begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet, potensielle forurensninger fra de copurified RBPs, kravet om isotopmanipulasjon og potensielt tap av informasjon under en kjedelig eksperimentell prosedyre. Her beskriver vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing. Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RNA-bindende proteinene. Dermed reduseres RNA-ene som samhandler indirekte mediert av disse kopurifiserte RBP-ene også. Vår FbioCLIP-seq-metode muliggjør effektiv påvisning av direkte proteinbundne RNA-er uten SDS-PAGE- og membranoverføringsprosedyrer på en isotopfri og proteinspesifikk antistofffri måte.
Introduction
RNAs og RNA-bindende proteiner (RBPs) kontrollerer ulike cellulære prosesser, inkludert skjøting, oversettelse, ribosombiogenese, epigenetisk regulering og celleskjebneovergang1,2,3,4,5,6. De delikate mekanismene i disse prosessene avhenger av det unike romlige og timelige arrangementet av RNAer og RBPer. Derfor er et viktig skritt mot å forstå RNA-regulering på molekylært nivå å avsløre posisjonsinformasjon om de bindende stedene til RBPs.
En strategi referert til som kryss-linking og immunprecipitation (CLIP-seq) er utviklet for å fange protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunforutslettelse av protein av interesse7. Hovedtrekket ved metodikken er induksjon av kovalente kryssforbindelser mellom et RNA-bindende protein og dets direkte bundne RNA-molekyler (innen ~ 1 Å) ved UV-bestråling8. RBP-fotavtrykkene kan bestemmes av CLIP-kodeklynging og toppsamtaler, som vanligvis har en oppløsning på 30-60 nt. Alternativt kan det omvendte transkripsjonstrinnet i CLIP føre til indels (innsettinger eller slettinger) eller erstatninger til krysskoblingsstedene, noe som gjør det mulig å identifisere proteinbindingssteder på RNA-ene ved en enkeltkjerneotidoppløsning. Rørledninger som Novoalign og CIMS er utviklet for analyse av sekvenseringsresultatene med høy gjennomstrømning av CLIP-seq8. Flere modifiserte CLIP-seq metoder har også blitt foreslått, inkludert individuell-nukleotid oppløsning kryss-linking og immunoprecipitation (iCLIP), forbedret CLIP (eCLIP), irCLIP, og fotoaktiv ribonucleoside-forbedret kryss-linking og immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Til tross for den brede bruken av tradisjonelle CLIP-seq metoder i studien av RBPs, har CLIP-metodene flere ulemper. For det første kan den kjedelige denaturerte gelelektroforese og membranoverføringsprosedyren føre til tap av informasjon, og forårsake begrenset sekvenskompleksitet. For det andre kan den proteinspesifikke antistoffbaserte CLIP-metoden trekke ned et proteinkompleks i stedet for et enkelt målprotein, noe som kan føre til falske positive protein-RNA-interaksjoner fra de copurified RBPs. For det tredje krever den antistoffbaserte strategien en stor mengde antistoffer av høy kvalitet, noe som gjør anvendelsen av disse metodene utilstrekkelig for studiet av RBPs uten antistoffbaserte antistoffer tilgjengelige. For det fjerde krever den tradisjonelle CLIP-metoden radiomerket ATP for å merke de proteinbundne RTA-ene.
Den høye affiniteten til streptavidin til biotinylererte proteiner gjør det til en svært kraftig tilnærming for å rense spesifikke proteiner eller proteinkomplekser. Effektiv biotinylering av proteiner som bærer en kunstig peptidsekvens ved ektopisk uttrykt bakteriell BirA biotin ligase i pattedyrceller gjør det til en effektiv strategi for å utføre biotinrensing in vivo13. Vi utviklet en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq(FLAG-Biotinn-mediert Cross-linking og jegmmunoprecipitation etterfulgt av høy gjennomstrømning sekvensering) ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing14 (Figur 1). Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RBPs (figur 2). De strenge vaskeforholdene gjør det også mulig å omgå SDS-PAGE og membranoverføring, som er arbeidsintensiv og teknisk utfordrende. Og i likhet med eCLIP og irCLIP, er FbioCLIP-seq-metoden isotopfri. Hoppe gel kjører og overføring trinn unngår tap av informasjon, holder autentisk protein-RNA interaksjoner intakt, og øker biblioteket kompleksitet. Videre gjør den høye effektiviteten av merkesystemet det til et godt valg for RBPs uten høykvalitets antistoffer tilgjengelig.
Her gir vi en trinnvis beskrivelse av FbioCLIP-seq-protokollen for pattedyrceller. Kort sagt, celler er krysskoblet av 254 nm UV, etterfulgt av cellelysis og FLAG immunprecipitation (FLAG-IP). Deretter blir protein-RNA-kompleksene ytterligere renset av biotin affinitetsfangst og RNA-er fragmentert av delvis fordøyelse med MNase. Deretter er den proteinbundne RNA defosforylert og ligated med en 3'linker. En 5' RNA linker tilsettes etter at RNA er fosforylert med PNK og eluted av proteinase K fordøyelsen. Etter omvendt transkripsjon forsterkes de proteinbundne RNA-signalene av PCR og renses ved agarose gelrensing. To RBPs ble valgt til å eksemplifisere FbioCLIP-seq resultatet. LIN28 er et godt karakterisert RNA-bindende protein involvert i microRNA modning, proteinoversettelse og celleomprogrammering15,16,17. WDR43 er et WD40-domeneholdig protein som antas å koordinere ribosometbiogenese, eukaryotisk transkripsjon og embryonal stamcellepuripotencykontroll14,18. I samsvar med tidligere rapporterte resultater for LIN28 med CLIP-seq, avslører FbioCLIP-seq bindende nettsteder av LIN28 på "GGAG" motiver i microRNA mir-let7g og mRNAs16,19 ( Figur3). WDR43 FbioCLIP-seq identifiserte også den bindende preferansen til WDR43 med 5' eksterne transkriberte avstandssyr (5'-ETS) av pre-rRNAs20 (figur 4). Disse resultatene validerer påliteligheten til FbioCLIP-seq-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellelinjekonstruksjon
- Klone genet av interesse i en PiggyBac vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA av interesse]-(Hygromycin-resistent) plasmid som bærer en FLAG-biotin epitop13,21 å uttrykke en FLAG-biotin tag smeltet RBP (FBRBP).
- Cotransfect FBRBP uttrykker vektor med pBase vektor i en cellelinje som uttrykker BirAenzymet 22.
MERK: I denne studien ble FBRBP-genet transfisert til embryonale stamceller (mESCer) med en integrert BirA-uttrykksvektor21. Alternativt kan FBRBP som uttrykker vektor bli cotransfected inn i celler med pBase og pPiggyBac-BirA-V5 sammen. - Dyrk cellene i mESC på gelatiniserte retter og vedlikehold i mES kulturmedium(Table of Materials)i 5% CO2 ved 37 °C. Velg de trans infiserte cellene med hygromycin b (100 μg/ml) i 1 uke.
- Etter legemiddelvalg, høst celler ved SDS lasting buffer (Tabell 1) og bruke en vestlig flekk23 for å bekrefte merking og uttrykk av genet med en FLAG antistoff og streptavidin-HRP, henholdsvis.
2. Krysskobling
- Plate ~ 3 x 106 mES celler i en 10 cm plate 1 dag før eksperimentet slik at cellene vil vokse til 70-90% samløpet når høstet (~ 5-10 millioner celler per prøve).
- Fjern mediet med et vakuum. Behandle cellene med 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA i 2 min ved romtemperatur (RT) og slukke trypsin med 4 ml friskt mESC-medium. Overfør cellene til et 15 ml sentrifugerør. Spinn ned cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 3 min ved 4 °C og fjern supernatanten.
- Suspender cellene med 4 ml kald PBS og plate cellene tilbake til 10 cm plate for krysskobling. Kryss-koble cellene ved stråling med 254 nm UV-lys (sett UV cross-linker med en parameter på 400 mJ / cm2).
MERK: For cellemonolag kan cellene kryss-koblet med UV-lys direkte på platen før trypsinbehandling. - Overfør de krysskoblede cellene til et 15 ml rør. Spinn ned ved sentrifugering ved 300 x g i 3 min ved 4 °C og fjern supernatanten.
MERK: Den krysskoblede cellepelleten kan oppbevares ved -80 °C til bruk.
3. Cellelylat forberedelse
- Lyse cellene med 500 μL vaskebuffer A (Tabell 1) nylig supplert med 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteasehemmercocktail og 400 U/ml RNase-hemmer. Overfør cellene til et RNase-fritt 1,5 ml rør. Inkuber cellene i 30-60 min på en rotor med mild rotasjon ved 4 °C.
- Behandle lysatet med 30 μL DNase I ved 37 °C i 10 min. Stopp reaksjonen ved å tilsette 4 μL på 0,5 M EDTA. Spinn ned den uoppløselige pelleten med 12 000 x g i 20 min ved 4 °C og overfør supernatanten til et nytt prechilled 1,5 ml rør.
MERK: For umiddelbar bruk, hold på is. Hvis supernatanten ikke vil bli brukt umiddelbart, oppbevar den ved -80 °C til bruk.
4. FLAG perler forberedelse
- Tilsett 40 μL slurry FLAG perler per prøve til et friskt 1,5 ml rør.
- Vask perlene raskt med 0,5 ml iskald vaskebuffer A og spinn ned med 3000 x g i 2 min ved 4 °C.
- Gjenta trinn 4.2 én gang. Spinn ned perlene med 3000 x g i 2 min ved 4 °C. Fjern bufferen forsiktig med en smal pipettespiss. Unngå å fjerne perlene.
5. Immunprecipitation
- Overfør cellelylat fra trinn 3.2 til de pre-equilibrated FLAG perler. Roter alle prøvene på en rullerist ved 4 °C forsiktig. Inkuber FLAG perlene med lysate i 2-4 timer eller over natten.
- Sentrifuger perlene i 2 min ved 3000 x g og fjern supernatanten.
- Vask perlene med 0,5 ml prechilled vaskebuffer A ved inkubasjon i 5 min i en rotator ved 4 °C, spinn ned perlene med 3000 x g i 2 min og fjern det overnaturlige. Gjenta vasken 1x.
- Gjenta vasken 2x som beskrevet i trinn 5.3 med 0,5 ml prechilled vaskebuffer B (tabell 1).
6. Elution med 3x FLAG peptid
- Forbered 3x FLAG elution løsning ved å oppløse 1 mg 3x FLAG peptid med 5 ml vaskebuffer A til en endelig konsentrasjon på 200 ng / ml.
- Spinn ned FLAG perlene fra trinn 5,4 med 3000 x g i 2 min. Fjern supernatanten forsiktig. Kontroller at det meste av supernatanten fjernes ved hjelp av en smal endepipettespiss.
- Tilsett 200 μL 3x FLAG elution løsning til hver prøve. Inkuber prøvene med skånsom rotasjon i 30 min ved 4 °C. Spinn ned FLAG perlene i 2 min ved 3000 x g. Overfør supernativa til friske rør.
- Gjenta elution 2x som beskrevet i trinn 6.2 og 6.3 og samle eluentene sammen. Spar 5% av eluents for Vestlig flekk analyse eller sølv farging for å sjekke effektiviteten av FLAG-IP.
7. Streptavidin perler forberedelse
- Forbered 50 μL av en streptavidin perle slurry for hver prøve. Samle perlene med et magnetisk stativ i 30 s og fjern supernatanten med en pipettespiss.
- Vask perlene raskt med 0,5 ml iskald vaskebuffer A og samle perlene med et magnetisk stativ i 30 s.
- Gjenta vasken 1x. Fjern det overnaturlige etter vasken.
8. Biotin affinitet rensing
- Overfør de samlede eluentene fra trinn 6,4 til streptavidinperlene fra trinn 7.3 og roter prøvene forsiktig ved 4 °C i 1−3 timer eller over natten.
- Samle perlene med et magnetisk stativ i 30 s og fjern det overnaturlige. Vask perlene 2x med 500 μL vaskebuffer C (tabell 1) ved skånsom rotasjon ved RT i 5 min.
- Samle perlene med magnetstativet og fjern det overnaturlige. Vask perlene 2x med 500 μL vaskebuffer D (tabell 1) ved å rotere ved RT i 5 min.
- Samle perlene med magnetstativet og fjern det overnaturlige. Vask perlene raskt 2x med 500 μL iskald PNK-buffer (tabell 1).
9. Delvis RNA fordøyelse
- Lag en 105-foldfortynning av MNase med MNase reaksjonsbuffer (tabell 1). Tilsett 100 μL MNase-løsning i hver prøve. Vortex perlene ved 37 °C med en termisk mikser satt til 1200 o/min (5 s løp, 30 s stopp) i 10 min, samle perlene med et magnetisk stativ i 30 s og fjern det overnaturlige.
MERK: Konsentrasjonen av MNase bør optimaliseres for ulike RNA-bindende proteiner. MNase konsentrasjonen som kan fordøye RNAs i 30-50 nt fragmenter (bestemmes av størrelsen på innsatsen til det endelige biblioteket) er optimal. - Vask perlene raskt 2x med 500 μL iskald PNK+EGTA buffer (tabell 1). Samle perlene med et magnetisk stativ og fjern supernatanten mellom hvert vasketrinn.
- Vask perlene 2x med 500 μL vaskebuffer C ved skånsom rotasjon i 5 min ved RT. Vask deretter forsiktig perlene 2x med 500 μL iskald PNK-buffer.
10. Defosforylering av RNA
- Lag en kalvetarmfosfatase (CIP) reaksjon blanding med 8 μL av 10x CIP buffer (Table of Materials),3 μL av CIP enzymet, og 69 μL vann. Det totale volumet er 80 μL per reaksjon.
- Samle perlene med et magnetisk stativ og fjern bufferen. Tilsett CIP reaksjonsblandingen til perlene. Vortex perlene ved 37 °C med en termisk mikser satt til 1200 o/min (5 s løp, 30 s stopp) i 10 min.
- Vask perlene raskt 2x med 500 μL iskald PNK+EGTA-buffer. Vask perlene raskt 2x med 500 μL iskald PNK-buffer.
11. 3' linker ligation
- Lag en 3'linker blanding med 4 μL av 20 μM 3 ' linker, 4 μL av 10x T4 RNA ligase buffer, 4 μL av 50% PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (avkortet), og 26 μL vann. Det totale volumet er 40 μL per reaksjon.
- Samle perlene fra trinn 10.3 med et magnetisk stativ og fjern bufferen. Tilsett 40 μL av 3'linker ligation blandingen til perlene. Vortex perlene ved 16 °C med en termisk mikser satt til 1200 o/min (5 s løp, 30 s stopp) i 3 timer eller over natten.
- Vask perlene raskt 2x med 500 μL iskald PNK+EGTA-buffer. Vask perlene raskt 2x med 500 μL iskald PNK-buffer.
12. PNK behandling
- Lag en PNK-blanding med 4 μL 10x PNK-buffer, 2 μL T4 PNK-enzym, 1 μL på 10 mM ATP og 33 μL vann. Det totale volumet er 40 μL per reaksjon.
- Samle perlene med et magnetisk stativ og fjern bufferen. Tilsett 40 μL PNK-bland til perlene. Vortex perlene forsiktig ved 37 °C med en termisk mikser satt til 1200 o/min (5 s løp, 30 s stopp) i 10 min.
- Vask perlene raskt med 500 μL iskald PNK+EGTA-buffer.
- Vask perlene raskt med 500 μL iskald PNK-buffer. Lagre 5% av perlene for vestlig eller sølv farging analyse for å bekrefte effektiviteten av immunforebukk.
13. RNA isolasjon
- Samle perlene fra trinn 12.4 med et magnetisk stativ og fjern bufferen. Tilsett 200 μL proteinase K fordøyelsesbuffer (tabell 1). Vortex perlene i 30 min ved 37 °C med en termisk mikser satt til 1200 o/min (5 s løp, 30 s stopp). Magnetisk isolere perlene og ta overnatant for eksperimentet.
- Tilsett 400 μL RNA-isolasjonsreagens (Materialstable ) til supernatanten fra trinn 13.1, bland godt og inkuber på is i 5 min. Tilsett 80 μL kloroform og bland godt og inkuber deretter på is i 5 min. Spinn ned med 12 000 x g i 10 min 4 °C.
MERK: Dette trinnet skal utføres i en kjemisk hette. - Ta det supernaturlige (~ 500 μL) og legg til to volumer isopropanol: etanolblanding (1:1), 1/10 volum på 3 M natriumacetat (pH = 5,5) og 1 μL glykogen. Frys ved -20 °C i 2 timer. Sentrifuge ved 4 °C med 12 000 x g i 20 min.
- Vask pellet 2x med iskald 70% etanol. Spinn ned pelleten ved 4 °C med 12 000 x g i 5 min. Fjern det overnaturlige og tørk pellet. Oppløs RNA-ene i 5 μL RNase-fri H2O.
14. 5' RNA linker ligation
- Lag en 5' RNA ligation blanding med 1 μL av 10x T4 RNA ligase buffer, 0,5 μL BSA (1 μg / μL), 1 μL av 10 mM ATP, 1 μL RNase hemmer, og 0,5 μL T4 RNA ligase. Det totale volumet er 4 μL per reaksjon.
- Tilsett 1 μL 5' 20 μM RNA-kobling til RNA fra trinn 13,4, denatur RNA ved oppvarming ved 70 °C i 2 min, og chill på is umiddelbart.
- Legg til 5' RNA ligation mix til RNA fra trinn 14.2. Inkuber ved 16 °C over natten.
15. Omvendt transkripsjon
- Rens RNA-ene som beskrevet i avsnitt 13, og oppløs RNA med 11,5 μL RNasefritt vann.
- Tilsett 1 μL av 10 μM omvendt transkripsjon primer til renset RNA, varme ved 70 ° C i 2 min, og chill på isen umiddelbart.
- Lag en omvendt transkripsjonsblanding med 4 μL 5x omvendt transkripsjonsbuffer, 1 μL på 10 mM dNTPer, 1 μL på 0,1 M DTT, 1 μL RNase-hemmer og 0,5 μL reverstranskripase (Materialtabell). Det totale volumet er 7,5 μL per reaksjon.
- Tilsett 7,5 μL omvendt transkripsjonsblanding til RNA, inkuber ved 50 °C i 30 min, og stopp reaksjonen ved inkubasjon ved 70 °C i 10 min. La ved 4 °C.
16. PCR-forsterkning
- Lag en PCR-forsterkningsblanding med 15 μL 2x PCR-hovedblanding (Materialsekk),5 μL cDNA fra trinn 15,4, 0,6 μL på 10 μM fremover primer 1 (tabell 2), 0,6 μL på 10 μM revers primer 1 (tabell 2) og 8,8 μL av H2O. Det totale volumet er 30 μL.
- Forsterk cDNA med følgende innstillinger: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (gjenta trinn 2−4 for 15−20 sykluser), 72 °C 2 min, og hold ved 4 °C. Kjør PCR-produktet på en 2-3% agarose gel. Skjær ut DNA av ~ 100-150 bp, ekstrakt DNA med gel ekstraksjon kit (Table of Materials), og elute DNA med 20 μL vann.
- Ta 3 μL av det rensede PCR-produktet, forsterk med fremover primer 2 (tabell 2) og omvendt primer 2 (indeks primer; Tabell 2) som beskrevet i trinn 16.2 for fem sykluser for å introdusere indekssekvenser. Rens PCR-produktet som beskrevet i trinn 16.2.
- Sekvens biblioteket med en sekvenseringsplattform med høy gjennomstrømming.
17. Bioinformatikk analyse
- Utfør dataanalyse ved hjelp av kommersielle programmer som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skjematiske representasjonen av FbioCLIP-seq-prosedyren vises i figur 1. Sammenlignet med FLAG-mediert eller streptavidin-mediert ett-trinns affinitetsrensing, fjernet FLAG-biotin tandemrensing nesten alle kopurified proteiner, unngå forurensning av indirekte protein-RNA interaksjoner (figur 2). Representative resultater for FbioCLIP-seq for LIN28 og WDR43 er avbildet i figur 3 og figur 4. Vi utførte LIN28 eller WDR43 FbioCLIP-seq med mESCer. Figur 3A viser sporvisningen av LIN28 og WDR43 FbioCLIP-seq i pre-let-7g. Det rapporterte GGAG-motivet i pre-let-7g og de krysskoblede nettstedene identifisert av FbioCLIP-seq er vist i figur 3B. Klassifiseringen av mutasjonsstedene kalt av CIMS-algoritmen viste at LIN28 foretrekker å binde og kryss-koble til G-nukleotid (figur 3C). De berikede RNA-motivene i LIN28 FbioCLIP-seq bindingssteder er vist i figur 3D. Flere representative spor av FbioCLIP-seq på LIN28 og HNRNPU er vist i figur 3E. Sammenligning av WDR43 og LIN28 FbioCLIP-seq viste sine forskjellige bindingsmønstre i Rn45 pre-rRNA locus (figur 4). Figur 5 viser de representative resultatene av FLAG og biotin tag validering etter cellelinjekonstruksjon. Figur 6 viser representative resultater av effektiv (figur 6A) eller mislykket (figur 6B) FLAG-IP og FLAG-biotin tandem rensing.
Figur 1: Skjematisk representasjon av FbioCLIP. UV-krysskoblede celler (trinn 1) lyses i lysisbuffer (trinn 2). FBRBP-RNA-komplekset er immunforeskrevet ved hjelp av anti-FLAG harpiks (trinn 3−4). Det eluted protein-RNA komplekset er ytterligere renset med streptavidin perler og strenge vaskeforhold brukes til å fjerne protein-protein interaksjoner (trinn 5-6). RNA-er fordøyes delvis av MNase, og ikke-proteinbundne RNA-fragmenter fjernes ved ytterligere vask (trinn 7−8). RNAs blir deretter defosforylert og ligated med 3 'linker (trinn 9). Deretter er RNA-ene fosforylert og eluted av proteinase K-behandling (trinn 10). Rensede RNA-er er ligated med en 5' RNA linker som inneholder en 6 nt tilfeldig strekkode (trinn 11). Etter omvendt transkripsjon (trinn 12) forsterkes cDNA-biblioteket med PCR, og sekvensering med høy gjennomstrømning utføres (trinn 13-15). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: FLAG-biotin tandemrensing fjerner kopurifiserte proteiner. Sølvfarging av FBWDR43 viste at nesten alle de interagerende proteinene som presenteres i FLAG- eller biotinmediert ett-trinns rensing ble eliminert etter streng vask i tandemrensing. FLAGG: FLAGGmediert affinitetsrensing, SA: streptavidin-mediert biotinrensing, tandem: FLAG-biotin tandem rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater av LIN28 FbioCLIP-seq. (A) Spor visning av LIN28 FbioCLIP-seq koder og mutasjon leser kalt av CIMS i pre-let-7g RNA. Kodene som vises er unike leser av FbioCLIP-seq. Totalt ~ 7,7 millioner unike leser for LIN28 FbioCLIP-seq og ~ 2,2 millioner unike leser for WDR43 FbioCLIP-seq ble hentet etter å ha fjernet overflødige leser. (B) Krysskoblede nettsteder på GGAG motiv av pre-let7-g RNA av LIN28 FbioCLIP-seq. Pilene angir de krysskoblede områdene. (C) Prosentandel av muterte nukleotider i ulike typer mutasjoner. G er den hyppigste krysskoblede og muterte nukleotid. Tilfeldig: tilfeldig fordeling av de fire nukleotider. (D) Spådd LIN28 bindende motiver av FbioCLIP-seq med HOMER algoritme. (E) Spor visninger av LIN28 FbioCLIP-seq på LIN28 og HNRNPU mRNAs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater fra WDR43 og LIN28 FbioCLIP-seq på Rn45S locus. Spor visning av WDR43 og LIN28 FbioCLIP-seq på Rn45S locus. WDR43 og LIN28 viste ulike bindingsmønstre på pre-rRNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av VALIDERING AV FLAG- og biotintagg. FLAG eller biotin Western blot validerer merkingen av cellelinjene. Kloner #1, #2 og #4 viste effektivt uttrykk og biotinylering av taggen mens #3 viste dårlig uttrykk for det merkede proteinet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative resultater av FLAG immunforekomst og tandem rensing effektivitet validering. (A)Eksempel på effektiv rensing av merket protein av FLAG og biotin affinitet rensing. (B)Eksempel på ineffektiv rensing av merket protein av FLAG og biotin affinitet rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer | Sammensetning |
| SDS-innlastingsbuffer | 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 0,1% bromofenolblå, 10% glyserol, 100 mM DTT |
| Vaskebuffer A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS |
| Vaskebuffer B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS |
| Vaskebuffer C | 50 mM Tris pH 7,4, 2% SDS |
| Vaskebuffer D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M urea |
| PNK-buffer | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase reaksjonsbuffer | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA-buffer | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Proteinase K fordøyelsesbuffer | 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 20 μg proteinase K |
Tabell 1: Sammensetning av buffere som brukes i denne studien.
| Oligo navn | Sekvens | Notater | ||||
| 3' linker | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' RNA linker | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGUCNNNNNNN | |||||
| RT primer | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Primer forover 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Omvendt primer 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Primer forover 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Omvendt primer 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T | De røde og understrekede sekvensene representerer Illumina-indekssekvensen. | ||||
Tabell 2: Oligonucleotides brukt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introduserer vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq, dra nytte av FLAG-biotin dobbel merking system for å utføre tandem rensing av protein-RNA komplekser. FLAG-biotin dobbelt merking systemet har vist seg å være kraftig i å identifisere protein-protein og protein-DNAinteraksjoner 13,21. Her demonstrerer vi den høye spesifisiteten og bekvemmeligheten til dette systemet i å identifisere RNAs som samhandler med proteiner. Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold hoppet vi over det utfordrende SDS-PAGE- og membranoverføringstrinnet, slik at flere protein-RNA-interaksjoner ble bevart og for å unngå forurensede RNA-signaler mediert av RBPs i samme kompleks. Dessuten unngår bypass av disse trinnene merking av RNA med radiomerket ATP. Dette gjør prosedyren mye enklere. Merk at under utarbeidelsen av vår publikasjon, en lignende metode kalt uvCLAP har også blitt foreslått24.
Flere trinn er viktige for å lykkes med protokollen. For det første bør effektiviteten av biotinyleringen av det merkede proteinet bekreftes av vestlig flekk før eksperimentet (figur 5). For det andre er effektiv elution av renset protein med 3 x FLAG peptid nødvendig for vellykket forsterkning av RNA-signalene. Perlene fra trinn 12.4 bør analyseres med vestlig flekk eller sølvfarging for å garantere at en anstendig mengde målprotein hentes (figur 6). For å øke effektiviteten, enten øke 3 x FLAG peptid konsentrasjon i trinn 6 opp til 500 ng / ml eller gjenta elution trinn flere ganger for å få bedre produksjon. For det tredje er det optimalt å titrere MNase-konsentrasjonen for hvert protein i første studie. Overbesvær eller utilstrekkelig behandling kan føre til RNA-fragmenter av upassende størrelser. Sist inneholder protokollen to runder med affinitetsrensing og svært streng vask. Bare en liten mengde rensede RNA-er hentes. Reagensen skal være RNase-fri og unngå RNA-nedbrytning etter MNase behandlingstrinn.
Til tross for den enkle denne metoden, er det fortsatt noen aspekter som kan forbedres. For eksempel kan ligation av en 5 'adapter til RNA direkte begrense utvinningen av signalene fordi en betydelig del av omvendt transkripsjon vil bli avsluttet av gjenværende krysskoblede peptider. Vår nåværende studie er hovedsakelig basert på ektopisk uttrykk for merkede proteiner, noe som kan føre til noen artefakter på grunn av proteinoveruttrykk. Det er verdt å forbedre metoden ved å introdusere koden i endogene locus. CRISPR/Cas9-systemet gjør cellelinjebyggingen mye enklere og gjennomførbar. Noen studier har brukt eCLIP-seq eksperimentet til mus vev25. Avledning av knock-in mus med dobbel tag er også en potensiell og lovende retning i forbedring og anvendelse av FbioCLIP-seq metoden. Videre kan ektopisk uttrykt bakteriell BirA ligase føre til uventede biotinyleringshendelser in vivo. Merking av proteinet kan også påvirke dens biologiske funksjoner.
Et stort antall studier har vist at genuttrykket og epigenomet av celler er heterogene i stedet for helt homogen, noe som tyder på at det er verdifullt å studere interaksjonsnettverket på encellet nivå. Flere strategier er utviklet for å studere transkripsjon og epigenom av enkeltceller. Det er imidlertid ikke rapportert noen strategier for å analysere protein-RNA-interageromet på encellet nivå. Uten denaturert gel kjører og membran overføring trinn, FbioCLIP-seq kan bevare flere signaler, noe som gjør det til en potensiell strategi for å studere protein-RNA interaksjoner på encellet nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Grant støtte er fra National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095), og Center for Life Sciences ved Tsinghua University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M.
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
