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Genetics

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और हाई-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का उपयोग करके साल्मोनेला बायोफिल्म में सीएसजीडी नियामक लक्ष्यों की खोज

Published: January 18, 2020 doi: 10.3791/60736
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Vaccine and Infectious Disease Organization-International Vaccine Centre, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Saskatchewan, 3Department of Cell Biology and Genetics, Shenzhen University Health Science Center

Summary

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (ChIP-seq) के साथ मिलकर एक विधि है जिसका उपयोग ट्रांसक्रिप्शन कारकों और जीनोमिक दृश्यों के बीच बातचीत स्थापित करने के लिए किया जाता है जो वे नियंत्रित करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइथिमुरियम बैक्टीरियल बायोफिल्म का उपयोग करते हुए बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के साथ ChIP-seq प्रदर्शन करने के लिए तकनीकों को रेखांकित करता है।

Abstract

अनुक्रमण (ChIP-seq) के बाद क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिफिकेशन एक तकनीक है जिसका उपयोग प्रतिलेखन कारकों, हिस्टोन संशोधनों और अन्य डीएनए से जुड़े प्रोटीन के नियामक लक्ष्यों की खोज के लिए किया जा सकता है। सीआईपी-सीक्यू डेटा का उपयोग विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों या सेल प्रकारों में प्रतिलेखन कारकों के अंतर बाध्यकारी खोजने के लिए भी किया जा सकता है। प्रारंभ में, सीआईपी को माइक्रोऐरे (सीएचपी-चिप) पर संकरण के माध्यम से किया गया था; हालांकि, ChIP-seq तकनीकी प्रगति के माध्यम से पसंदीदा तरीका बन गया है, अनुक्रमण के लिए वित्तीय बाधाओं को कम करने, और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पादन की भारी मात्रा में । बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के साथ सीआईपी-सीक्यू प्रदर्शन करने की तकनीक, लगातार और पुराने संक्रमण का एक प्रमुख स्रोत, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। सीआईपी-सीक्यू दो सेल प्रकारों में अंतर बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए मास्टर बायोफिल्म नियामक, सीएसजीडी को लक्षित करते हुए साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइफिमुरियम बायोफिल्म और प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं पर किया जाता है। यहां, हम फसल के लिए बायोफिल्म की उचित मात्रा प्रदर्शित करते हैं, एक तख्ते के नियंत्रण नमूने को सामान्य बनाते हैं, क्रॉस-लिंकर एक्सेस के लिए बायोफिल्म को समरूप करते हैं, और उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए नियमित सीआईपी-सीक्यू चरणों का प्रदर्शन करते हैं।

Introduction

बैक्टीरियल बायोफिल्म्स, स्वयं-उत्पादित मैट्रिक्स में एम्बेडेड कोशिकाओं के संरचनात्मक समुचेय, डीविक्शन, एंटीबायोटिक दवाओं और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिरोधी हैं1। जैसे, वे लगातार और पुराने संक्रमण का कारण बनते हैं और अस्तित्व और संचरण के समाधान के कारण शोधकर्ताओं को अनूठी चुनौतियां पेश करते हैं। साल्मोनेला आंत्रकारिसेवर टाइथिमुरियम (एस. टाइथिमुरियम) बायोफिल्म एग्रीगेट की फेनोआमतौर पर विषम आबादी स्थापित करने के लिए पाया गया है जो डीसिकाशन और एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोधी हैं, और प्लैंक्टोनिक कोशिकाएं जो पर्यावरण तनाव (28 डिग्री सेल्सियस, सीमित पोषक तत्वों)2के संपर्क में आने पर शुद्ध संस्कृति में उग्रता कारकों को व्यक्त करती हैं। ये दो सेल प्रकार मास्टर बायोफिल्म नियामक, सीएसजीडी3की द्विस्थिर अभिव्यक्ति के कारण उत्पन्न होते हैं। हमने परिकल्पना की है कि यह साल्मोनेलाके लिए एक शर्त हेजिंग रणनीति हो सकती है, जहां प्लैंक्टोनिक कोशिकाएं अल्पकालिक संचरण में भाग लेती हैं और बायोफिल्म कोशिकाएं पर्यावरण में दीर्घकालिक बनी रहती हैं जब तक कि एक नए मेजबान को संक्रमित करने का अवसर2,4उत्पन्न नहीं होता । सीजेआर ओपरन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले कई नियामक तत्व ों की विशेषता5है . हालांकि, एड्रा और सीएसजी ऑपरन6के अलावा सीएसजीडी के कुछ रेग्युलेटरी टारगेट ्स को जाना जाता है। सीएसजीडी नियामक नेटवर्क की पहचान करने से हमें साल्मोनेला जीवनचक्र और बायोफिल्म्स के संचरण में भूमिका को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी।

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिफिकेशन के बाद हाई-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग (सीएचपी-सीक्यू) प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की जीनोम-वाइड पहचान के लिए वीवो तकनीक में एक शक्तिशाली है और प्रतिलेखन कारकों, हिस्टोन संशोधनों, या न्यूक्लियोसोम्स7से जुड़ी नियामक प्रक्रियाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है। नए अध्ययनों ने इस तकनीक का उपयोग विकास की स्थिति और कोशिका प्रकार8के बीच अंतर प्रोटीन बाध्यकारी का आकलन करने के लिए किया है । क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन (सीआईपी) में, इंटरैटिंग प्रोटीन के साथ डीएनए के टुकड़े लक्ष्य प्रोटीन के एंटीबॉडी चयन के माध्यम से समृद्ध होते हैं। कोशिकाओं की कटाई की जाती है और डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन फॉर्मलडिहाइड क्रॉस-लिंकर उपचार के माध्यम से वीवो में डीएनए से जुड़े होते हैं। कोशिकाओं को ले जाता है, कोशिका सामग्री जारी करते हैं, और क्रोमेटिन लगभग 200-600 बीपी टुकड़ों7में कतरनी है। लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य डीएनए टुकड़े एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोप्रीप्रिमिटेड हैं, और 9 प्रोटीन पाचन के बाद डी-क्रॉसलिंकिंग द्वारा अलग होते हैं। ये डीएनए टुकड़े संकरण से मेल खाती प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को माइक्रोरे (सीएचपी-चिप) से या जीनोम अनुक्रम10,11को गहरे अनुक्रमण और मानचित्रण द्वारा मेल खाते हैं । हालांकि ChIP-चिप प्रयोगों पर्याप्त नियामक डेटा उपज, वे महंगी जांच के उपयोग के कारण सीमित हैं, साथ ही संकरण और सरणी पूर्वाग्रह12। ChIP-seq में न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन और कवरेज में वृद्धि, बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात, और सीआईपी-चिप7की तुलना में कम कलाकृतियों के साथ एक बड़ी गतिशील सीमा है।

सीएचपी का उपयोग साल्मोनेला सेरोवर टाइथिमुरियाम13,14, विब्रियो एल्गिनोलिटिकस15में कोरम-सेंसिंग अफानियमन, एस्चेरिचियामें आरपीओएस विनियमन में एसएफएच और ओएमपीआर नियमन का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। कोलाई16,विरुलेंस रेगुलेटर ईएसपीआर रेगुलेशन इन माइकोबैक्टीरियम तपेदिक17, स्यूडोमोनास एरुजिनोसा18में अमर्ग्स रेगुलेशन के माध्यम से संभावित डिगुएनेलेट साइक्ल्स, साथ ही वीआरएसआर स्टेफिलोकोकस ऑरियस19में रेगुलेशन. बैक्टीरियल ChIP-seq प्रयोगों का वर्णन किया गया है कि तरल मीडिया में बढ़ती कोशिकाओं और एकल सेल के रूप में कटाई के साथ शुरू करते हैं । हालांकि, बायोफिल्म्स और इसी जीन विनियमन का विश्लेषण एक सफल सीआईपी-सीक्यू प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के लिए चुनौतियों का एक नया सेट का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रोटोकॉल में, सीएचपी-सीक्यू का उपयोग सीएसजीडी, एस के अंतर नियामक लक्ष्यों को खोजने के लिए किया जाता है। बायोफिल्म और प्लैंक्टोनिक सेल प्रकारों में टाइथिमुरियाम मास्टर बायोफिल्म रेगुलेटर। यह प्रोटोकॉल ChIP-seq के लिए बायोफिल्म की उचित मात्रा, फ्लास्क संस्कृति से फसल बायोफिल्म, बायोफिल्म और एकल सेल नियंत्रण नमूनों को सामान्य बनाने, बायोफिल्म को समरूप करने और पूर्ण इम्यूनोप्रिसिप्रिमिटेशन के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों का वर्णन करता है। यह बैक्टीरियल बायोफिल्म्स में नियामक लक्ष्यों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होगा और कई प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

1. फ्लास्क संस्कृति सेल विकास

  1. जमे हुए स्टॉक से, स्ट्रीक साल्मोनेला सेवर टाइफीमुरियम एलबी एगर (100 मिमी पेट्री प्लेट में 20 मीटर ठोस मीडिया) पर उपयुक्त एंटीबायोटिक और इनक्यूबेट के साथ 16-20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग-अलग कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए उपभेदों।
  2. एक 25 मिमी x 150 मिमी बोरोसिलिकेट संस्कृति ट्यूब में उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त 5 mL पौंड शोरबा का टीका 1.1 से लकीर प्लेटों से 1-3 कालोनियों के साथ। 7 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शोरबा संस्कृति के ओडी600 को मापें। पीबीएस में 4 में संस्कृति 1 का एक एलिकोट 2 मिलीएल क्यूवेट में पतला करें और 600 एनएम पर अवशोषण को मापें। हमने इस कदम पर सबसे महत्वपूर्ण कारक विकास का समय पाया है । ओडी मूल्यों का उपयोग चरण 1.4 में कोशिकाओं की वांछित संख्या देने के लिए संस्कृतियों को सामान्य करने के लिए किया जाता है।
  4. उचित एंटीबायोटिक के साथ 1% ट्राइप्टोन के 100 मिलील वाले एर्लेनमेयर फ्लास्क में सेल कल्चर (यानी ~ 109 कोशिकाओं) के बराबर 1.0 ओडी600 वॉल्यूम जोड़ें। 13 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: बायोफिल्म कोशिकाएं एकत्रित गुच्छे के रूप में दिखाई देंगी और एकल तख्ते की कोशिकाएं बादल मीडिया में हैं।

2. सेल-फ्री वातानुकूलित 1% ट्राइप्टोन एकत्र करना

  1. सेल-फ्री वातानुकूलित 1% ट्राइप्टोन के लिए फ्लास्क संस्कृति एकत्र करें। पिपेट फ्लास्क संस्कृति कई बार एक अपकेंद्रित्र ट्यूब को जोड़ने से पहले मिश्रण करने के लिए ।
  2. सभी कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
  3. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर इकाई, वैक्यूम फिल्टर में Decant supernatant, और एक नई ट्यूब में बांटना।
    नोट: बायोफिल्म एग्रीगेट पारंपरिक समाधानों (जैसे पीबीएस) में अनुयायी हैं और ट्यूब और पिपेट युक्तियों के किनारों से चिपके रहेंगे। चूंकि यह आसान हेरफेर के लिए अनुमति देता है, हम वातानुकूलित मीडिया (1% ट्रिप्टोन) का उपयोग शुरू में बायोफिल्म को स्थानांतरित करने के लिए करते हैं और मीडिया में मौजूद किसी भी प्रोटीन क्रॉसलिंकिंग सब्सट्रेट्स को हटाने के लिए क्रॉस-लिंकिंग (चरण 4.5) से तुरंत पहले गर्म पीबीएस का उपयोग करते हैं।

3. फ्लास्क संस्कृतियों से बायोफिल्म और प्लैंकटोनिक कोशिकाओं को अलग करना2

  1. एक बाँझ 25 mL पिपेट का उपयोग करना, 15 mL ट्यूबों में फ्लाकोट फ्लास्क संस्कृति । दो सेल प्रकारों को अलग करने के लिए, 2 मिन के लिए धीमी गति (210 x ग्राम)पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: बायोफिल्म कोशिकाओं ट्यूब के तल पर एक ढीला गोली फार्म चाहिए
  2. बाद में (चरण 5) के लिए दो 40 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में प्लैंकटोनिक कोशिकाओं वाले सुपरनेट को पिपेट करें। शेष सभी तरल को हटा दें, सावधान रहें कि गोली को परेशान न करें। दोहराएं जब तक सेल प्रकार फ्लास्क संस्कृति मीडिया के सभी से अलग किया गया है ।

4. बायोफिल्म एग्रीगेट तैयार करना

नोट: बायोफिल्म को गीले वजन से काटा जाता है ताकि डीएनए का 25 μg निकलता है, ChIP के लिए अनुशंसित न्यूनतम प्रारंभिक सामग्री। एस का बायोफिल्म कन्वर्जन फैक्टर (बीसीएफ) टाइथिमुरियम 1.73 x 108 सीएफयू/एमजी2है। अन्य बायोफिल्म प्रकार तैयार करने वाले शोधकर्ताओं को अनुभवजन्य रूप से बायोफिल्म के प्रति इकाई वजन कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित करने की आवश्यकता होगी, जिसका उपयोग इस समीकरण का उपयोग करके डीएनए शुरू करने वाली सामग्री के 25 μg के लिए आवश्यक बायोफिल्म के वजन को खोजने के लिए किया जाता है:
Equation 1

  1. एक 2 mL स्नैप कैप या स्क्रू कैप ट्यूब सही वजन।
  2. वातानुकूलित ट्राइप्टोन के 1 मिलील में बायोफिल्म पैलेट को फिर से निलंबित करें। पुनर्निलंबित बायोफिल्म को पूर्व-तौला गया 2 mL स्नैप कैप या स्क्रू कैप ट्यूब में ले जाएं।
  3. 1 1 11 000 x ग्राम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज
  4. ध्यान से ट्यूब से सभी अलौकिक निकालें और ट्यूब का सही वजन करें। बायोफिल्म का वजन खोजने के लिए बायोफिल्म के साथ ट्यूब के वजन से ट्यूब का वजन घटाएं। यह लक्ष्य बायोफिल्म वजन का ± 10% होना चाहिए।
  5. शेष वातानुकूलित ट्राइप्टोन को हटाने के लिए कोशिकाओं को धोएं। गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब और भंवर में गर्म पीबीएस के 1 mL जोड़ें। पैलेट बायोफिल्म के लिए 8 000 x ग्राम पर 3 मिन के लिए सेंट्रलाइज करें और सुपरनेटेंट को हटा दें। गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब और भंवर में पीबीएस के 1 mL जोड़ें।

5. प्लैंटोनिक कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करधीमी गति केंद्रीकरण (चरण 3.2) से प्लैंक्टोनिक सुपरनेटेंट की मात्रा और ओडी600 रिकॉर्ड करें
  2. 6.0 के अंतिम ओडी600 के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें:
    Equation 2
  3. सेंट्रलाइज को 10 डिग्री सेल्सियस और तलछट प्लैंटोनिक कोशिकाओं को सेंट्रलाइज्ड (10,000 x ग्राम,10 00 00 से 10 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें)
  4. सुपरनेट को हटा दें और चरण 5.2 में गणना किए गए पीबीएस की अंतिम मात्रा में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के ओडी600 को फिर से मापें और 6.0 ओडी600 प्लैंटोनिक कोशिकाओं की मात्रा को 2 मिलील स्नैप कैप या स्क्रू कैप ट्यूब में वितरित करें।
  6. पीबीएस के साथ 1 mL करने के लिए मात्रा लाओ।

6. समरूप कोशिकाएं

  1. प्रत्येक ट्यूब में एक निष्फल 5 मिमी स्टेनलेस स्टील का माक डालें।
  2. 30 हर्ट्ज पर 5 मिन के लिए मिक्सर मिल का उपयोग कर के समरूपता। कुल ट्यूबों का निरीक्षण करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि बायोफिल्म को अलग कर दिया गया है।
  3. धातु के माक से बचते हुए, समरूप कोशिकाओं को एक नई 1.5 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। पीबीएस के साथ वॉल्यूम को 1 mL पर लाएं।
    नोट: इनपुट कोशिकाओं की गणना करने के लिए धारावाहिक कमजोरप्रदर्शन करें और जांच ें कि अंतिम सेल नंबर वांछित या भविष्यवाणी की गई संख्या के करीब है।

7. डीएनए के लिए प्रोटीन के पार जोड़ने

  1. 1% की अंतिम एकाग्रता के लिए नमूना ट्यूबों में ताजा फॉर्मलडिहाइड बांटें। एक घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
    सावधानी: फॉर्मलडिहाइड संक्षारक, त्वचा, आंख और श्वसन अड़चन, और ज्वलनशील है। एक धुएं हुड में बांटना।
  2. क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए 125 mM की अंतिम एकाग्रता में 1 एम ग्लाइसिन जोड़ें। एक घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।

8. अतिरिक्त क्रॉसलिंकर को हटाने के लिए धोने की कोशिकाएं

  1. 3 मिन के लिए 8,000 x ग्राम पर कोशिकाओं तलछट और supernatant हटा दें
  2. 25x प्रोटीज अवरोधकों के 20 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें और फिल्टर स्टरलइज्ड पीबीएस के 500 माइक्रोन।
  3. 8000 x ग्राम पर 3 मिन के लिए सेंट्रलाइज ट्यूब और सुपरनेटेंट को हटा दें।

9. लाइसिंग कोशिकाएं

  1. 600 माइक्रोन लाइस बफर (टेबल 1को देखें) में गोली को फिर से निलंबित करें और 10 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  2. आईपी कमजोर पड़ने वाले बफर (टेबल 1को देखें) का 1.4 मिलील एक बाँझ 15 मिलील ट्यूब में जोड़ें और 15 मिलील ट्यूब पर ले जाया गया कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। ट्यूब को 1.5-2 घंटे के लिए बर्फ पर रखें, और भंवर धीरे और कभी-कभी।
    नोट: कुछ प्रतिरोधी कोशिका सामग्री ट्यूबों में रह सकती है। कभी-कभी भंवर के साथ बर्फ पर एक लंबी ऊष्मायन अवधि अलग सामग्री को तोड़ देगी। शेष को सोनिकेशन के माध्यम से तोड़ा जाएगा।

10. सोनिकेशन द्वारा डीएनए खंडित

  1. 15 मीटर ट्यूब को बर्फ के बीकर में रखें और 3 एमएम की जांच को ट्यूब के अंदर रखें।
  2. फटने के बीच बर्फ पर 2 मिन ठंडा करने के साथ 400 डब्ल्यू के 20-40% पर 30 एस के 5 ध्वनि दौर प्रदर्शन करें।
  3. तलछट ने 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज्ड (8000 x ग्राम,10 मिन) द्वारा सामग्री उपजी। एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण।
  4. वैकल्पिक रूप से, उचित आकार के टुकड़ों की जांच करने के लिए 2% अगारोज जेल पर चलने से पहले 30-60 मीटर के लिए 30-60 मीटर के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर 65 डिग्री सेल्सियस पर डीक्रॉसलिंकिंग करें और 30-60 मीटर पर आरएनए और प्रोटीन को डाइजेस्ट करें।
    नोट: सेल में जांच विसर्जित करें। सोनिका और आराम करते समय बर्फ पर समाधान रखें। पॉनिकेटर जांच स्पंदन करते समय ट्यूब को न हटाएं। समाधान बादल पूर्व ध्वनि और स्पष्ट पोस्ट-सोनिकेशन दिखाई देना चाहिए।

11. इम्यूनोप्रीसिपिटटिंग डीएनए-प्रोटीन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स

  1. तैयारी
    1. इम्यूनोप्रीसिप्रिशन के लिए 1.35 एमएल अलीकोट और इनपुट कंट्रोल के रूप में 1 200 माइक्रोन एलिकोट बांटें। इनपुट नियंत्रण को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि डीक्रॉसलिंकिंग और पचाने वाले चरण ों को नहीं किया जाता है।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रिसिप्रिशन
    1. 1.35 माइक्रोन अलीकोट में शुद्ध प्रोटीन-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 μg जोड़ें। एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, उच्च गुणवत्ता वाले पॉलीक्लोनल सीरम या वाणिज्यिक एपिटोप एंटीबॉडी (यानी, एंटी-फ्लैग) हो सकता है।
    2. चरण 11.2.1 से ट्यूबों में प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों का 50 माइक्रोन जोड़ें और घूर्णन पहिया पर 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. एक बर्फ बाल्टी में आईपी वॉश बफर 1, आईपी वॉश बफर 2, और TE पीएच 8.0 (टेबल 1को देखें) रखें। गर्म एलुशन बफर से 65 डिग्री सेल्सियस तक।
      नोट: बर्फ पर एल्यूटियन बफर युक्त समाधान न डालें।
    4. प्रोटीन जी चुंबकीय मोती को चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके ट्यूबों के किनारे बांधें
    5. वॉश करें: 750 माइक्रोन कोल्ड आईपी वॉश बफर 1 के साथ 2x धोएं, 750 माइक्रोन कोल्ड आईपी वॉश बफर 2 के साथ 1x धोएं, और पीएच 8.0 पर 750 माइक्रोन कोल्ड टीई के साथ 2x धोएं। धोती के दौरान ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
    6. प्रत्येक ट्यूब में आईपी एल्यूटियन बफर (टेबल 1को देखें) के 450 माइक्रोन जोड़ें और हर 5 मिन के साथ 30 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके ट्यूबों के किनारे मोतियों को बांधें। समाधान स्पष्ट होने तक कम से कम 2 मिन का इंतजार करें।
    8. एक नया 1.5 mL ट्यूब के लिए मंजूरी दे दी supernatant बांटना, चुंबकीय मनका गोली परेशान नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है।

12. डीएनए-प्रोटीन परिसरों को डीक्रॉसलिंक करना और सह-शुद्ध आरएनए और प्रोटीन को पचाना

  1. प्रत्येक ट्यूब के लिए 0.3 मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए 2 μg RNase A और NaCl जोड़ें।
  2. 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 6 एच, या रात भर के लिए।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 180 माइक्रोन प्रोटीनके को जोड़कर प्रोटीन पाचन को पूरा करें, फिर 3-5 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करें।

13. पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण

  1. चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर डीएनए शुद्ध करें
    नोट: चुंबकीय मोती आमतौर पर बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ ChIP के दौरान बरामद डीएनए की छोटी मात्रा को अलग करने के लिए पसंद कर रहे हैं ।
  2. चयनित अनुक्रमण मंच के साथ संगत है कि एक किट का उपयोग कर पुस्तकालयों तैयार करें।
  3. फ्लोरोमीटर और एक विस्तृत रेंज dsDNA किट या एक क्यूआरटी-पीसीआर लाइब्रेरी क्वांटिफिकेशन किट के साथ पुस्तकालय एकाग्रता की जांच करें।
    नोट: हमारे अनुभव में, फ्लोरोमीटर माप डीएनए एकाग्रता को अधिक आंक सकते हैं।
  4. पूल पुस्तकालयों, प्रत्येक पुस्तकालय नमूने के लिए पर्याप्त कवरेज के लिए लेखांकन । साल्मोनेलाके साथ Illumina अनुक्रमण के लिए, हम 10-12 पुस्तकालयों पूल । 1 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए Tris-HCl पीएच 8.0 जोड़ें।
  5. चयनित मंच के विनिर्देशों के अनुसार अनुक्रम।

Representative Results

बैक्टीरियल बायोफिल्म से क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन नमूनों की तैयारी में कई कदम शामिल हैं, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है । इनमें फ्लास्क कल्चर में बायोफिल्म बढ़ाना शामिल है, वातानुकूलित मीडिया का संग्रह, नियंत्रण के रूप में बायोफिल्म और तख्ते की कोशिकाओं की एक पर्याप्त मात्रा का संग्रह, PBS में कोशिकाओं को धोने, समरूपता, डीएनए के लिए प्रोटीन को पार करना, कोशिकाओं को लाइजनिंग करना, सोनिकेशन द्वारा डीएनए को खंडित करना, उपयुक्त एंटीबॉडी और प्रोटीन जी मोतियों के साथ डीएनए को इम्यूनोप्रिमिट करने, डीएनए को धोना और अनुकरण करना, और पुस्तकालय तैयार करने और अनुक्रमण के लिए डीएनए को शुद्ध करना ।

बायोफिल्म-उत्प्रेरण स्थितियों के तहत तरल संस्कृति में उगाई जाने वाली एस टाइथिमुरियम कोशिकाएं बहुकोशिकीय बायोफिल्म एग्रीगेट और प्लैंकटोनिक कोशिकाओं के रूप में फेनोटाइप स्विचिंग से गुजरती हैं। इस आबादी में लगभग 40% बायोफिल्म एग्रीगेट होंगे, जो डिगुएनलेट साइक्ल्स (डीजीसीएस) और बायोफिल्म नियामकों के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, और 60% प्लैंकटोनिक कोशिकाएं, जो उग्रता से जुड़े जीन2,4 (चित्रा 2ए)के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम सीआईपी-सीक्यू के माध्यम से प्रतिलेखन साइटों की तुलना करने के लिए दोनों सेल प्रकारों की कटाई करने की विधि का वर्णन करते हैं; हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य जीवाणु प्रजातियों द्वारा गठित अन्य प्रकार की बायोफिल्मों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। बायोफिल्म एग्रीगेट और प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को धीमी गति से केंद्रीकरण से अलग किया जाता है, जो बायोफिल्म को छर्रों औरसुपरनेटेंट 2 (चित्रा 2बी)में प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को छोड़ देता है। सेल प्रकार तो प्रोटोकॉल में बाद के चरणों के लिए अलग से इलाज कर रहे हैं ।

ChIP-seq के लिए डीएनए इनपुट की अनुशंसित राशि 10-25 μg20है । एस में टाइथिमुरियम फ्लास्क संस्कृति, 30 मिलीग्राम बायोफिल्म लगभग 25 माइक्रोन डीएनए की पैदावार करती है। चूंकि बायोफिल्म एग्रीगेट में प्रोटीनसियस एक्सेलर्युलर सामग्री की बहुतायत होती है, इसलिए हमने परिकल्पना की कि यह क्रॉस-लिंकिंग की दक्षता में हस्तक्षेप करेगा। यदि हम केवल सेल संख्या द्वारा विभिन्न सेल प्रकारों को सामान्य करने के लिए थे, तो प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के उपचार के परिणामस्वरूप इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के लिए प्रस्तुत क्रॉसलिंक्ड उत्पाद की असमान मात्रा हो सकती है। 30 मिलीग्राम बायोफिल्म(चित्रा 3)से मेल खाने के लिए प्लैंकटोनिक सेल सामग्री की समकक्ष मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटीन परख का प्रदर्शन किया गया था। 30 मिलीग्राम बायोफिल्म से मेल खाने के लिए प्लैंकटोनिक कोशिकाओं के 6.0 ओडी600 काटे गए।

बायोफिल्म एग्रीगेट को पहले सभी कोशिकाओं को क्रॉस-लिंकर की समान पहुंच की अनुमति देने के लिए अलग तोड़ा जाना चाहिए। हमने पाया कि कोशिकाओं को समरूप बनाने का सबसे समान और उच्च-थ्रूपुट तरीका मिक्सर मिल और 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मनका(चित्रा 4ए)का उपयोग कर रहा था। प्लैंकटोनिक कोशिकाओं को सीआईपी-सीक्यू प्रयोग(चित्रा 4बी)में चर को कम करने के लिए उसी तरह माना जाता है।

एक बार डीएनए को सोनिकेशन, क्रॉसलिंक्ड और आरएनएसई और प्रोटीनेस के के साथ शोधित किया गया है, तो इसे 2% अगारोज जेल पर कल्पना की जा सकती है। सोनिकाड डीएनए को उन टुकड़ों के संग्रह में तोड़ दिया जाता है जो अगारोज जेल पर एक धब्बा के रूप में दिखाई देते हैं। ध्वनि फटने की बढ़ती संख्या(चित्रा 5)के साथ औसत टुकड़ा आकार कम हो जाता है। ऊर्जा हस्तांतरण विभिन्न सोनिकेटर इकाइयों के लिए भिन्न होगा, इसलिए डीएनए को 1 केबी से कम के औसत से खंडित करने के लिए आवश्यक सोनिकेशन फटने की संख्या निर्धारित करने के लिए एक सोनिकेशन परख की सिफारिश की जाती है। हमारे ChIP-seq प्रयोग के लिए, हम 5 फटने चुना ।

एनकोड दिशानिर्देश प्रतिकार 21 के साथ एंटीबॉडी लक्ष्य-बाध्यकारी गतिविधि की पुष्टि की सलाहदेतेहैं । इस मामले में हमने सीआईपी(चित्रा 6)के लिए तैयार पूरे सेल लिसेट्स पर इम्यूनोब्लॉट द्वारा अपने एंटीबॉडी की विशिष्टता और बाध्यकारी की ताकत को मापा। हमने पुष्टि की है कि एंटीबॉडी CsgD-3xFLAG को बांधता है; एंटी-फ्लैग और एंटी-सीएसजीडी संकेत अपेक्षित आणविक वजन (28 केडीए)22पर colocalize ।

ChIP प्रक्रियाओं अक्सर डीएनए की कम सांद्रता उपज । इसलिए, एक शुद्धि विधि जो संदूषकों को हटाती है और डीएनए के उच्च अनुपात को बरकरार रखती है, चुना गया था। चुंबकीय मनका शुद्धिकरण कॉलम आधारित शुद्धिकरण पर चुना गया था क्योंकि यह इनपुट ChIP डीएनए बेहतर(चित्र7)की कम सांद्रता बनाए रखा और संदूषकों को हटा दिया (डेटा नहीं दिखाया गया) ।

डीएनए की कम शुरुआती मात्रा के कारण, सीआईपी डीएनए की लाइब्रेरी तैयार करने के लिए पतला एडाप्टर और पीसीआर संवर्धन की आवश्यकता हो सकती है। अनुक्रमण से पहले, पुस्तकालयों को पीसीआर संवर्धन(चित्र8)से पहले और बाद में सही आकार वितरण की पुष्टि करने के लिए बायोएनालाइजर ट्रेस द्वारा कल्पना की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, यदि प्रतिलेखन कारक का एक ज्ञात नियामक लक्ष्य है, तो क्यूपीसीआर का उपयोग इम्यूनोप्रिपिटाइज्ड और सोनिकाइज्ड इनपुट डीएनए में ज्ञात लक्ष्य और संदर्भ जीन अनुक्रम बहुतायत के बीच गुना परिवर्तन (सीटी) की तुलना करके बाध्यकारी क्षेत्रों के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए।

ChIP-अनुक्रमण डेटा गुणवत्ता स्कोर निर्दिष्ट करके विश्लेषण किया जाना चाहिए, कम गुणवत्ता वाले ठिकानों ट्रिमिंग, आगे और रिवर्स पढ़ता है संरेखित (बनती अंत अनुक्रमण में), एक उच्च गुणवत्ता वाले संदर्भ जीनोम को कोडांतरण, पृष्ठभूमि के ऊपर चोटियों को खोजने, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण प्रदर्शन(चित्र 9ए)। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में चोटियों की दृश्य और एनोटेशन, जैविक दोहराने के नमूनों के साथ निरंतरता, और आदर्श विश्लेषण शामिल होना चाहिए, और इसमें शर्तों या कोशिका प्रकारों के बीच अंतर बाध्यकारी विश्लेषण और ज्ञात मार्गों से जीन अभिव्यक्ति के साथ डेटा एकीकरण शामिल हो सकता है। हमारे जैसे ChIP-seq डेटा के लिए, चोटियों को केवल गुना-परिवर्तन द्वारा नहीं, एक पी मूल्य निर्धारण के साथ पृष्ठभूमि (चित्रा 9 बी, सी, लाल सलाखों) से ऊपर की पृष्ठभूमि(चित्रा 9बी, सी,लाल सलाखों) के रूप में पहचाना जाना चाहिए। अंतिम विश्लेषण में, मैप किए गए पढ़ता संदर्भ जीनोम(चित्र 9डी) के एनोटेशन के खिलाफ कल्पना की जातीहै। एक गरीब ChIP-seq परिणाम पृष्ठभूमि के ऊपर किसी भी महत्वपूर्ण चोटियों के बिना इनपुट-सीक्यू की तरह दिखाई देगा ।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के साथ सीआईपी-सीक्यू में चरणों का चित्रण। वर्णित प्रक्रिया में, एस टाइपिमुरीम कोशिकाएं 1% ट्राइप्टोन फ्लास्क संस्कृति में 28 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रित (1) के साथ उगाई जाती हैं, बायोफिल्म सेल प्रकार (2) से निपटने के लिए सेल-मुक्त वातानुकूलित मीडिया एकत्र किया जाता है, जिसका उपयोग पर्याप्त मात्रा में बायोफिल्म और प्लैंकटोनिक कोशिकाओं (3) को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है। इन कोशिकाओं को पीबीएस के साथ धोया जाता है और अलग बायोफिल्म (4) को तोड़ने के लिए समरूप किया जाता है। प्रोटीन को फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकर के साथ डीएनए से क्रॉसलिंक किया जाता है, जिसके बाद कोशिकाओं को सेल सामग्री (5) जारी करने के लिए लाइसेकिया जाता है। कोशिका में डीएनए सोनिकेशन (6) से खंडित है। लक्ष्य प्रोटीन से जुड़े डीएनए को इम्यूनोप्रिसिपेटेशन के माध्यम से एक एंटीबॉडी के साथ चुना जाता है जो लक्ष्य प्रोटीन और प्रोटीन जी चुंबकीय मोती (7) को बांधता है। चयनित डीएनए को प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों (8) से धोया और पतला किया जाता है और पुस्तकालय तैयार करने और अनुक्रमण (9) के लिए शुद्ध किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एस अध्ययन के लिए इन विट्रो फ्लास्क मॉडल । टाइथिमुरियम बायोफिल्म विकास। (A) एस। 28 डिग्री सेल्सियस पर 13 घंटे के लिए 1% ट्राइप्टोन में उगाई जाने वाली टाइजिमुरियाम कोशिकाएं फ्लास्क संस्कृति के तरल चरण में बायोफिल्म एग्रीगेट और प्लैंकटोनिक कोशिकाओं के रूप में स्विचिंग करते हुए फेनोटाइप से गुजरती हैं। (ख)2 मिन के लिए 210 x ग्राम पर केंद्रीकरण के माध्यम से बायोफिल्म एग्रीगेट और प्लैंकटोनिक कोशिकाओं को अलग किया गया था। लैंट को प्लैंटोनिक सेल तैयारकरने के लिए काटा गया था और बायोफिल्म सेल की तैयारी के लिए गोली काटी गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: तख्ते कोशिकाकोशिकाओं और बायोफिल्म सेल एस से काटा नमूनों के लिए कुल प्रोटीन सांद्रता । टाइथिमुरियाम फ्लास्क संस्कृति। कोलोरेमेट्रिक प्रोटीन परख ों का प्रदर्शन किया गया और बीएसए मानक वक्र के सापेक्ष प्रोटीन की मात्रा 750 एनएम मापी गई। 4.0, 6.0 और 8.0 ओडी600 पर लिड प्लैंकटोनिक सेल नमूनों की प्रोटीन सामग्री 30 मिलीग्राम बायोफिल्म एग्रीगेट की तुलना में थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एस से सेल नमूनों का समरूपीकरण टाइथिमुरियम बायोफिल्म फ्लास्क संस्कृतियां। (A)पीबीएस (बाएं) में निलंबित फ्लास्क संस्कृति से बायोफिल्म कुल 5 मिन (दाएं) के लिए 30 हर्ट्ज पर मिक्सर मिल का उपयोग कर समरूप थे। (ख)पीबीएस में फ्लास्क संस्कृति से प्लैंकटोनिक कोशिकाओं को मिक्सर मिल द्वारा 5 मिन के लिए 30 हर्ट्ज पर संसाधित किया गया ताकि सेल प्रकार के नमूनों के बीच स्थिरता सुनिश्चित की जा सके । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्री-सीआईपी सेल लिसेट्स के साथ सोनिकेशन परख। बायोफिल्म एग्रीगेट और प्लैंक्टोनिक सेल के नमूनों को अलग, समरूप, क्रॉसलिंक और लाइसेड किया गया था। डीएनए-प्रोटीन परिसरों को 30 एस पर 8 बार और बर्फ पर 2 मिन बंद करने के लिए छोटे टुकड़ों में डीएनए तोड़ने के लिए ध्वनिथे । सोनिका लेसैट का एक हिस्सा 2% अगारोज जेल पर अलग हो गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: सीआईपी-सीक्यू में उपयोग किए जाने वाले एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी की लक्ष्य-बाध्यकारी विशिष्टता। एंटीबॉडी विशिष्टता का आकलन एस की फ्लास्क संस्कृतियों से तैयार पूरे सेल लिसेट्स के खिलाफ इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। के रूप में दिखाया गया है Typhimurium उपभेदों । तनाव , csgD + p3xFLAG/csgD और WT बायोफिल्म नमूने फ्लैक्स से काटे गए बायोफिल्म एग्रीगेट ्स का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि तनाव ,सीएसजीडी ± p3xFLAG और WT प्लैंकटोनिक कोशिकाएं प्लैंकटोनिक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। शुद्ध उसकी टैग सीएसजीडी एक नियंत्रण के रूप में भरी हुई थी । पूरे सेल लाइसेट्स को सामान्य किया गया ताकि प्रत्येक लेन में कुल प्रोटीन के 30 μg का विश्लेषण किया जा सके। बाईं ओर की संख्या पूर्वदाग आणविक वजन मार्कर के आकार (केडीए में) को संदर्भित करती है। ऊपरी दाग के लिए उपयोग किया जाने वाला प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश-एंटी-फ्लैग पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (सिग्मा-एल्ड्रिच #F7425) था, जबकि निचले दाग को सीएसजीडी-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी2के साथ खरगोश-विरोधी ध्वज के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) और बकरी विरोधी माउस IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया । ओडिसी एसएलएक्स इमेजिंग सिस्टम और इमेज स्टूडियो 4.0 सॉफ्टवेयर पैकेज (ली-कोर बायोसाइंसेज) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट संकेतों की कल्पना की गई थी। प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ChIP-seq प्रयोगों के परिणामस्वरूप डीएनए की छोटी मात्रा के लिए कॉलम या चुंबकीय मनका आधारित शुद्धिकरण रणनीतियां । डीएनए की ज्ञात मात्रा के नमूनों को कॉलम आधारित किट या चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके शुद्ध किया गया था और शुद्धिकरण के बाद एल्यूएट की एकाग्रता को मापा गया था । चुंबकीय मोती कम डीएनए के स्तर पर बेहतर वसूली दिखाया, डीएनए की कम मात्रा के समान आम तौर पर ChIP-seq प्रोटोकॉल के अंत में सामना करना पड़ा, लेकिन NGS पुस्तकालय की तैयारी से पहले । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: सीआईपी डीएनए तैयारी और बाद में बायोएनालाइजर द्वारा कल्पना पुस्तकालयों। (क)कोशिका लिसिस और सोनिकेशन के बाद जीनोमिक डीएनए का औसत टुकड़ा आकार & 1000 बीपी था, जिसमें 200-500 बीपी रेंज में अधिकांश टुकड़े थे। (ख)पुस्तकालय तैयार करने के लिए शुरू सामग्री का पता लगाने से नीचे था । (ग)एडाप्टर लिगेशन और पीसीआर संवर्धन पुस्तकालय के टुकड़ों के प्रवर्धन की अनुमति देता है। (D)एक खराब पुस्तकालय तैयार करने में डीएनए चोटियां, विषम आकार या उच्च आणविक वजन की चोटियां, या लगभग 100 बीपी पर प्रचुर मात्रा में एडाप्टर चोटियां होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र9: सीआईपी-सीक्यू डेटा का विश्लेषण बायोइन्फॉर्मेटिक टूल्स का उपयोग करके किया जाता है और जीनोम ब्राउज़र पर कल्पना की जाती है। एचआईपी-सीक्यू डेटा के विशिष्ट बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण के लिए एफ्लोचार्ट। रॉ बायोफिल्म के लिए पढ़ता है (,csgD तनाव + p3xFLAG/csgD) और प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं (,csgD + p3xFLAG) कम गुणवत्ता वाले पढ़ता है और एडाप्टर के लिए साफ किया गया, और एसको मैप किया गया । टाइपिमुरियम 14028s जीनोम (गुणसूत्र के लिए NC_016856.1 और प्लाज्मिड के लिए NC_016855.1) द्वारा बोटाई2 (v2.3.3.1) द्वारा डिफ़ॉल्ट मापदंडों23के साथ। MACS2 (v2.1.2) का उपयोग चोटियों को '-क्यू 0.01 -- नोमॉडल' के मापदंडों के साथ कॉल करने के लिए किया गया था, जिसमें बायोफिल्म प्रतिकृति को परीक्षण डेटासेट और प्लैंकटोनिक लोगों को नियंत्रण24के रूप में लिया गया था। MACS2 bdgcmp मॉड्यूल का उपयोग '-एम एफई' के मापदंडों के साथ गुना-संवर्धन ट्रैक उत्पन्न करने के लिए किया गया था। गुना-संवर्धन ट्रैक के साथ महत्वपूर्ण चोटी फ़ाइल को बेडटूल/बेडक्लिप/बेडग्राफटोबिगविग25 का उपयोग करके विग फ़ाइल में बदल दिया गया था और एकीकृत जीनोमिक्स दर्शक v2.5.126का उपयोग करके संदर्भ जीनोम पर कल्पना की गई थी। प्रतिनिधि चोटियों (लाल सलाखों) दिखाया गया है । (ख)~ 40 केबीपी का बड़ा क्षेत्र, जिसमें कई चोटियां होती हैं, एक असामान्य परिणाम है लेकिन अभी भी संभावित रूप से मूल्यवान है। (ग)यह एक अधिक विशिष्ट परिणाम है, जिसमें दो महत्वपूर्ण शिखर क्षेत्र दिखाई दे रहे हैं । (डी)सी में बाईं चोटी पर ज़ूम इन, एस के क्षेत्र के लिए मानचित्रण पढ़ता दिखा । टाइथिमुरियम 14028s जीनोम जिसमें यूएसपीए और यूएसपीबीके लिए अलग प्रमोटर होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सेल लिसिस बफ़र्स
लिस बफर
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.1
10 मीटर EDTA
1% एसडीएस
अवरोधकों को प्रोटीज़ करें
आईपी कमजोर पड़ने बफर
20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.1
2 मीटर EDTA
150 एमएम एनआल
1% ट्राइटन एक्स-100
0.01% एसडीएस
इम्यूनोप्रिसिप्रिशन बफर
आईपी वॉश बफर 1
20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.1
2 मीटर EDTA
50 एमएम एनआल
1% ट्राइटन एक्स-100
0.1% एसडीएस
आईपी वॉश बफर 2
10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.1
250 एमएम लिसीएल
1 एमएम EDTA
1% एनपी-40
1% डिऑक्सीकोलिक एसिड
TE (टी10ई1)पीएच 8.0
10 एमएम ट्रिस-एचसीएल
1 एमएम EDTA
एल्यूटियन बफर
1% एसडीएस
100 एमएम NaHCO3

तालिका 1. बफर व्यंजनों।

Discussion

यह प्रोटोकॉल मास्टर बायोफिल्म नियामक, सीएसजीडी के नियामक लक्ष्यों को खोजने के लिए, शुद्ध संस्कृति से साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइफिमुरीम बायोफिल्म और प्लैंकटोनिक कोशिकाओं के साथ ChIP-seq प्रदर्शन करने के लिए एक तकनीक की रूपरेखा तैयार करता है। हम दो सेल प्रकारों में सीएसजीडी की द्वि-स्थिरता के कारण अंतर बाध्यकारी जानकारी की उम्मीद करते हैं, जिसमें बायोफिल्म एग्रीगेट में उच्च स्तर और प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं में निम्न स्तर2,3है। हालांकि, इस तकनीक को अन्य बैक्टीरियल ट्रांसक्रिप्शन कारकों, सेल प्रकारों या विकास की स्थिति पर भी लागू किया जा सकता है। विशेष रूप से, बायोफिल्म कोशिकाओं के प्रति यूनिट वजन सीएफयू के लिए प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित रूपांतरण कारक का उपयोग करके इस तकनीक को अन्य जीवाणु बायोफिल्मों के अनुकूल बनाया जा सकता है।

सीआईपी-सीक्यू अनुक्रमण के माध्यम से तकनीकी त्रुटि के प्रवर्धन के लिए प्रवण हो सकता है; हालांकि, क्रिटिकल स्टेप्स पर पुष्टि इस27को रोक सकता है . प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्टता केवल लक्ष्य प्रतिलेखन कारक और डीएनए यह इम्यूनोप्रिसिप्रिशन7के दौरान नियंत्रित करने के चयन के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रयोग में, सीएसजीडी को जीन के 3 ' अंत में प्लाज्मिड-एन्कोडेड 3xFLAG टैग से जुड़ा हुआ था, जो सीएसजीडी22के सी-टर्मिनस के अनुरूप था। सीसीडी के बिना पी3एक्सफ्लैग प्लाज्मिड का उपयोग "नियंत्रण"(एस" के रूप में किया गया था। टाइथिमुरियम 14028 ‧सीएसजीडी + पी3एक्सफ्लैग)। एनकोड दिशानिर्देश ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लॉट करने की सलाह देते हैं, और सीएचपी उपभेदों और हटाने के लाइसेट्स21। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी और डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण परिणामों में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए विकास की स्थिति प्रतिकृति में सुसंगत है। यदि कोई यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान है कि इनोकुलम आकार और पूर्व-इनोकुलम विकास की स्थिति लगातार हो, तो फ्लास्क संस्कृति में बायोफिल्म वृद्धि लगातार4है। यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि सभी जैव फिल्म को समरूपता के बाद तोड़ दिया गया है, सभी कोशिकाओं के लिए अभिकर्ताओं, विशेष रूप से फॉर्मलडिहाइड क्रॉस-लिंकर की समान पहुंच सुनिश्चित करने के लिए।

कई संशोधनों शोधकर्ताओं को अन्य डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन, सेल प्रकार, उपभेदों, विकास की स्थिति, या प्रयोगशाला उपकरण के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सक्षम हो सकता है । यदि इसका उपयोग एस के अलावा बायोफिल्म बनाने वाली प्रजातियों के लिए किया जाता है। टाइपिमुरियूम, बायोफिल्म के प्रति यूनिट वजन के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों के रूपांतरण कारक को प्रयोगात्मक रूप से जैव फिल्म की विभिन्न मात्रा में कटाई, बायोफिल्म को अच्छी तरह से समरूप बनाकर, और एक मानक वक्र बनाने के लिए धारावाहिक कमजोर और प्लेट गिनती करने के द्वारा निर्धारित करने की आवश्यकता है, जो कम बायोफिल्म वजन2पर सटीक नहीं हो सकता है। सोनिकेटर ऊर्जा हस्तांतरण और सेल प्रकार प्रतिरोध अलग हो सकता है; इसलिए, एक सोनिकेशन परख को सोनिकेशन फटने की संख्या खोजने की सिफारिश की जाती है जो डाउनस्ट्रीम लाइब्रेरी तैयार करने औरअनुक्रमण 11के लिए आवश्यक खंड आकार सीमा का उत्पादन करेगा । माइक्रोकोकल न्यूक्लीज द्वारा क्रोमेटिन विखंडन सोनिकेशन का एक विकल्प है जो अधिभोग साइटों के उच्च संकल्प का उत्पादन करता है; हालांकि, इस विधि विखंडन पूर्वाग्रह7,28परिचय हो सकता है . डीएनए आकार सीमा डाउनस्ट्रीम पुस्तकालय तैयार करने किट और अनुक्रमण प्लेटफार्मों के आधार पर बदला जा सकता है । मिक्सर मिल के बदले समरूपता के अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक ग्लास ऊतक समरूपता को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन यह बायोफिल्म को एयरोसोलाइज या अधूरा तोड़ सकता है। नियंत्रण के संदर्भ में, पूर्व इम्यूनोप्रिसिपिटेट डीएनए को अनुक्रमण प्रसंस्करण और विश्लेषण में सामान्यीकृत किया जा सकता है। प्रजातियों से मेल खाने वाले सामान्य एंटीबॉडी सीरम के साथ एक नकली-आईपी नियंत्रण को नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से13के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

शोधकर्ताओं को एक ChIP-seq प्रयोग पर विचार करते समय इस विधि की सीमाओं पर विचार करना चाहिए । अन्य बायोफिल्म प्रकारों के लिए इसे अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, साल्मोनेला टाइथिमुरीम के साथ पीबीएस में बायोफिल्म के तत्काल निलंबन से बायोफिल्म एग्रीगेट की औसत दर्जे की हानि होती है। बैक्टीरिया में प्रतिलेखन कारकों के नियामक लक्ष्यों को लक्षित करने वाले इम्यूनोप्रिसिपेटेशन के परिणामस्वरूप डीएनए की बहुत कम मात्रा हो सकती है, जो बाद के चरणों में शुद्धिकरण और पता लगाने के लिए एक चुनौती है । लाइब्रेरी डिटेक्शन9के दौरान बाल काटना और डाउनस्ट्रीम हेराफेरी के दौरान पूर्वाग्रह पेश किया जा सकता है । इसके अलावा, यह विधि प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी के जवाब में वीवो अभिव्यक्ति के स्तर में प्रकट नहीं होती है। जिन शोधकर्ताओं को बायोइन्फॉर्मेटिक्स का कम अनुभव है, उन्हें विश्लेषण पाइपलाइन से चुनौती दी जा सकती है । यह विधि समय-गहन और महंगी हो सकती है; हालांकि, अनुक्रमण की लागत अक्सर एक माइक्रोसरण ी की तुलना में कम होती है और समय के साथ कम हो रही है क्योंकि तकनीकी सुधार किए जाते रहते हैं।

साहित्य में कुछ विधियां सीएचपी को बैक्टीरिया के साथ बताती हैं,और अधिकांश जीवाणु प्रयोग एक साधारण विकास स्थिति13,14,15,17,18से शुरू होते हैं। एकल कोशिकाओं के साथ सीआईपी नमूना तैयारकरना सीधा है और बायोफिल्म समुच्चय के साथ सीआईपी नमूना तैयारी की तुलना में कम चुनौतियां प्रस्तुत करता है। ChIP-seq के लिए, घातीय संवर्धन (SELEX), इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता बदलाव परख (EMSA), ChIP-चिप, प्रमोटर हटाने और रिपोर्टर विश्लेषण द्वारा ligands के व्यवस्थित विकास सहित cis-नियामक सर्किटरी का अध्ययन करने के पिछले तरीकों को सीआईपी-एसईक्यू29द्वारा पूरित या प्रतिस्थापित किया गया है । सीआईपी-सीक्यू प्रौद्योगिकियों को आगे बढ़ाने और अनुक्रमण की उपलब्धता के कारण सीएचपी-चिप की जगह ले रहा है। डीप सीक्वेंसिंग शोधकर्ताओं को भारी मात्रा में डेटा प्रदान करता है जो सीआईपी-चिप11,30की तुलना में कम प्रारंभिक सामग्री के साथ कम बाध्यकारी आत्मीयता और उच्च आधार जोड़ी संकल्प वाली साइटों की पहचान कर सकते हैं। उच्च गुणवत्ता वाले संदर्भ जीनोम वाले जीवों से सीआईपी डेटा का विश्लेषण आम तौर पर तेज और विशिष्ट होता है। इसके अतिरिक्त, ChIP-seq सिलिको भविष्यवाणी बाध्यकारी साइटों है कि सभी सेल प्रकार, विकास चरण, या पर्यावरण की स्थिति31में कब्जा नहीं किया जा सकता है में खोज के लिए एक पूरी तरह से विधि है ।

भविष्य में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग बैक्टीरियल रोगजनन, विशेष रूप से बायोफिल्म बनाने वाले जीवों की समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक को व्यापक रूप से अपनाना और नए डेटासेट की उपलब्धता प्रोटीन के समूहों की पहचान करने के लिए डेटा एकीकरण का कारण बन सकती है जो बायोफिल्म बनाने वालेसूक्ष्मजीवों 32में सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए सह-स्थानीयकरण करते हैं। इसके अलावा, सीआईपी-सीक्यू और आरएनए-सीक्यू डेटा को नियामक प्रणाली मॉडल33बनाने के लिए एकीकृत किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस शोध को प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (एनएसईआरसी) (एनएसईआरसी) (#2017-05737) से एडब्ल्यू और जैव प्रौद्योगिकी में जारिसलोस्की चेयर के माध्यम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सांसद को साकटचेवान विश्वविद्यालय में संक्रामक रोगों, खाद्य सुरक्षा और सार्वजनिक नीति (ITraP) में एकीकृत प्रशिक्षण कार्यक्रम के माध्यम से एनएसईआरसी-सृजन छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।

लेखक दानी डेल को फिल्मांकन और संपादन के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose powder FroggaBio A87-500G
Balance (Explorer pro) Ohaus EP214
Benchtop Centrifuge (8510R) Eppendorf 022627023
Bioanalyzer 2100 Agilent G2939BA
BR dsDNA kit ThermoFisher Scientific Q32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling Technology 9006
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich COEDTAF-RO ROCHE
Conical tube 15 mL FroggaBio TB15-500
Conical tube 50 mL FroggaBio TB50-500
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112
Disposable Cuvette, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-127
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) Bio-Rad 1658000
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) Thermo Scientific 728211
Fluorometer (Qubit 3.0) Thermo Fisher Scientific Q33216
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water Biotium 41003
High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Incubator (shaking) VWR 1570-ZZMFG
Incubator (Water bath shaking) New Brunswick G76D
LB media VWR 90000-808
Magnetic stand (DynaMag) Fisher Scientific 12321D
Microcentrifuge (refrigerated) Eppendorf 5415R
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) Illumina MS-102-3001
Mixer mill Retsch MM400
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size Thermo Scientific 73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7370S
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads Machery-Nagel 744970.5
Normal mouse serum AbCam ab188776
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Pipette controller FroggaBio MP001
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2542
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody Sigma-Aldrich F7425
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) ThermoFisher Scientific EN0531
Rotating wheel Crystal Technologies & Industries TR 01A
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) Eppendorf 22363344
Serological pipette 25 mL FroggaBio 94024
Spectrophotometer Montreal Biotech Inc. Libra S22
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. 630-0418
Tryptone media VWR 90000-286
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) Sonics & Materials, Inc. VC300
Vacuum equipment (Vacufuge plus) Eppendorf 022820001
Water bath 1 (Lab-line aquabath) Thermo Scientific 18000-1
Water bath 2 (Precision) Thermo Scientific 51221044

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References

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जेनेटिक्स इश्यू 155 क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन सीआईपी-सीक्यू नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग बायोफिल्म बैक्टीरिया साल्मोनेला
क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और हाई-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का उपयोग करके <em>साल्मोनेला</em> बायोफिल्म में सीएसजीडी नियामक लक्ष्यों की खोज
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Palmer, M. B., Wang, Y., White, A.… More

Palmer, M. B., Wang, Y., White, A. P. Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (155), e60736, doi:10.3791/60736 (2020).

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