رسم خرائط الدوائر بمساعدة Channelrhodopsin (CRACM) هو تقنية دقيقة لرسم الخرائط الوظيفية للإسقاطات العصبية بعيدة المدى بين مجموعات الخلايا العصبية المحددة تشريحياو/ أو وراثيا. هنا ، ونحن نصف كيفية استخدام CRACM لرسم خريطة وصلات جذع الدماغ السمعية ، بما في ذلك استخدام أوبسين أحمر التحول ، ChrimsonR.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طويلة المدى Channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر من الخلايا العصبية الدنيا Colliculus مع الأزرق والأحمر تحول Channelrhodopsins
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عند التحقيق في الدوائر العصبية ، فإن القيد القياسي لنهج المشبك في المختبر هو أن المحاور من مصادر متعددة غالبًا ما تكون مختلطة ، مما يجعل من الصعب عزل المدخلات من المصادر الفردية مع التحفيز الكهربائي. ومع ذلك، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدائرة (CRACM)، يمكن الآن التغلب على هذا القيد. هنا، نبلغ عن طريقة لاستخدام CRACM لرسم خريطة المدخلات التصاعدية من نواة جذع الدماغ السمعي السفلي والمدخلات الجماعية إلى فئة محددة من الخلايا العصبية في الكوليكولوس السفلي (IC)، نواة الدماغ المتوسط للنظام السمعي. في IC ، تكون المحاور المحورية المحلية والمندوبية والصاعدة والتنازلية متشابكة بشكل كبير وبالتالي لا يمكن تمييزها مع التحفيز الكهربائي. عن طريق حقن بناء الفيروسية لدفع التعبير عن channelrhodopsin في نواة presynaptic، تليها تسجيل المشبك التصحيح لتوصيف وجود وعلم وظائف الأعضاء من المدخلات متشابك عبر channelrhodopsin، والإسقاطات من مصدر معين يمكن تعيين إلى مجموعة محددة من الخلايا العصبية IC مع دقة نوع الخلية محددة. نظهر أن هذا النهج يعمل مع كل من كرونوس، قناة زرقاء تنشيط الضوء، وChrimsonR، قناة حمراء تحول. على النقيض من التقارير السابقة من الدماغ الأمامي، نجد أن يتم الاتجار بقوة ChrimsonR أسفل محاور عصبية الخلايا العصبية الرئيسية نواة القوقعة الظهرية، مشيرا إلى أن ChrimsonR قد تكون أداة مفيدة لتجارب CRACM في جذع الدماغ. يتضمن البروتوكول المعروض هنا وصفًا تفصيليًا لجراحة حقن الفيروسات داخل الجمجمة ، بما في ذلك إحداثيات stereotaxic لاستهداف الحقن إلى نواة القوقعة الهروية وIC للفئران ، وكيفية الجمع بين تسجيل المشبك المشبك في الخلايا الكاملة مع تنشيط channelrhodopsin للتحقيق في التوقعات بعيدة المدى للخلايا العصبية IC. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصًا لتوصيف المدخلات السمعية للIC ، إلا أنه يمكن تكييفه بسهولة للتحقيق في الإسقاطات الأخرى طويلة المدى في جذع الدماغ السمعي وما بعده.
المقدمة
اتصالات متشابك ة حاسمة لوظيفة الدائرة العصبية، ولكن طوبولوجيا دقيقة وعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي داخل الدوائر العصبية غالبا ما يكون من الصعب التحقيق تجريبيا. وذلك لأن التحفيز الكهربائي ، الأداة التقليدية للفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية ، ينشط بشكل عشوائي محاور عصبية بالقرب من موقع التحفيز ، وفي معظم مناطق الدماغ ، تتشابك المحاور من مصادر مختلفة (محلية ، تصاعدية ، و / أو تنازلية). ومع ذلك ، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر (CRACM)1،2، يمكن الآن التغلب على هذا القيد3. Channelrhodopsin (ChR2) هو ضوء تنشيط, قناة أيون انتقائية الميشن وجدت أصلا في الأخضر الغا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الحصول على موافقة لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية واستخدامها والالتزام بإرشادات المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذا البروتوكول من قبل جامعة ميشيغان IACUC وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. الاستعدادات لعملية جراحية
- إجراء العمليات الجراحية في ظروف معقمة. الأوتوكلاف/ تعقيم جميع أدوات ومواد الجراحة قبل الجراحة. ارتداء ثوب الجراحة وقناع للجراحة.
- قم بتعقيم منطقة الجراحة (رش ومسح أسفل مع الإيثانول 70٪)، ووضع الستائر منشفة معقمة لتغطية منطقة الجراحة.
- إعداد قفص الانتعاش. إزالة الفراش قفص للحد من خ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عبرنا فئران VIP-IRES-Cre(Viptm1 (cre)Zjh/J) وAi14 Cre-reporter الفئران (B6). Cg-Gt (ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) لتوليد نسل F1 الذي تعبر فيه الخلايا العصبية VIP عن tdTomato البروتين الفلوري. تم استخدام نسل F1 من أي من الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين يوم ما بعد الولادة (P) 21 إلى P70. وقد استخدم ما مجموعه 22 من الحيوانات في هذه الدراسة.
حقن Stereotaxic من AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد وجدنا أن CRACM هو تقنية قوية لتحديد ووصف المدخلات متشابك المدى الطويل إلى الخلايا العصبية في IC الماوس. بعد البروتوكول المفصل هنا ، حققنا نقل قوي للخلايا العصبية في DCN و IC بالإضافة إلى الاتجار المحوري الموثوق به من Chronos و ChrimsonR إلى المحطات المتشابكة في IC. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا أن هذه التقنية تمكن من قياس وتحليل الأحداث postynaptic ، بما في ذلك سعة PSP ، والعرض النصفي ، ووقت الاضمحلال ، وعلم الأدوية المستقبل. تشير تجربتنا إلى أن هذا النهج يمكن تكييفه بسهولة لإجراء تجارب رسم خرائط الدوائر الوظيفية في جميع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل زمالة دويتشه فورشونججماينشافت للأبحاث (GO 3060/1-1، رقم المشروع 401540516، إلى DG) والمعاهد الوطنية للصحة منحة R56 DC016880 (MTR).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 الفئران المراسلة (B6. CG-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) مخزون | مختبر جاكسون | # 007914 | |
| العنبر (590 نانومتر) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| أزرق (470 نانومتر) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (كاربروفين) هنري | شاين لصحة | 59149 | |
| دروموند جلاس الشعيرات الدموية | شركة دروموند العلمية | 3-000-203-G / X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode Beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 متري) خيوط نايلون | Ethicon | الصيدلية | |
| مجهر المرحلة الثابتة | أي | حامل | |
| رأس تخدير بالغاز | ديفيد كوبف الأدوات | 933-B | |
| أدوات الجراحة العامة | أدوات العلوم الدقيقة | N / A | |
| مقص الأليفة الذهبي A5 | Oster | 078005-010-003 | |
| وسادة تسخين | بناء مخصص | N / A | |
| غرفة الحث المقنعين مع نظام الفراغ | باترسون Scientific | 78917760 | |
| معقم الخرز الساخن Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| محلول اليود 10٪ | صيدلية | MedChoice المحلية | |
| مبخر الأيزوفلوران | باترسون ساينتفيك | 07-8703592 | |
| هلام ليدوكاين الموضعي 2٪ | صيدلية | أكورن | |
| مثقاب محرك صغير 1050 | هنري شاين لقم ثقب المحرك | ||
| هنري شاين لقم الثقب بمحرك صغير 0.5 مم | أدوات العلوم الدقيقة | 19007-05 | |
| Micromanipulator الآلية | MP-285 / R | ||
| مرهم العيون الدموع الاصطناعية | الصيدلية | المحلية Akorn | |
| P-1000 مجتذب القطب الكهربائي | Sutter Instrument | P-1000 | |
| مكبر للصوت المشبك التصحيح بما في ذلك برنامج الحصول على البيانات | أي | آلة تخدير محمولة | |
| باترسون Scientific | 07-8914724 | ||
| إطار القصي للحيوانات | الصغيرة David Kopf Instruments | 930-B | |
| المواد الكيميائية القياسية | البائعين المحليين | N / A | |
| حلول | |||
| ستائر المناشف المعقمة | Dynarex | 4410 | |
| قلم التحديد الجراحي | أدوات العلوم الدقيقة | 18000-30 | |
| تحكم في درجة الحرارة | بناء مخصص | N / A | |
| Vibratome | أي | فئران N / A | |
| VIP-IRES-CRE (Viptm1 (cre) Zjh / J) | مختبر جاكسون | # 010908 | |
| حمام مائي | أي | غير متاح |
المراجع
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
