Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Долгосрочный Channelrhodopsin-помощь цепи Картирование Нижнего Колликулнейроннейроны с синим и красным сдвинутым Channelrhodopsins

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760
Automatic Translation
1, 1
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Summary

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) является точным методом для функционального картирования проекций нейронов дальнего радиуса действия между анатомически и/или генетически идентифицированными группами нейронов. Здесь мы описываем, как использовать CRACM для картирования слуховых соединений ствола мозга, включая использование красного сдвига опсина, ChrimsonR.

Abstract

При исследовании нейронных цепей, стандартное ограничение подхода зажима зажима in vitro что аксоны от множественных источников часто смешаны, делая его трудным изолировать входы от индивидуальных источников с электрической стимуляцией. Однако, с помощью каналаrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM), это ограничение теперь может быть преодолено. Здесь мы сообщаем о методе использования CRACM для картирования восходящих входов от нижних слуховых ядер ствола мозга и коммистуральных входов к идентифицированному классу нейронов в нижнем колликуле (IC), ядре среднего мозга слуховой системы. В IC, местные, комиссионерские, восходящие и нисходящие аксоны сильно переплетены и поэтому неотличимы с электрической стимуляцией. Путем впрыскивания вирусной конструкции для того чтобы управлять выражением channelrhodopsin в presynaptic ядре, последовано заработка зажима зажима для того чтобы охарактеризовать присутсвие и физиологию channelrhodopsin-выражая синаптические входы, прогнозы от специфического источника к определенной популяции нейронов IC можно отображать с точностью типа клетки. Мы показываем, что этот подход работает как с Chronos, синий свет активированный каналrhodopsin, и ChrimsonR, красный сдвиг channelrhodopsin. В отличие от предыдущих докладов с передних мозгов, мы находим, что ChrimsonR надежно проданы вниз аксоны дорсального кохлеарного ядра основных нейронов, указывая, что ChrimsonR может быть полезным инструментом для экспериментов CRACM в стволе мозга. Представленный здесь протокол включает в себя подробные описания хирургии инъекций внутричерепного вируса, включая стереотаксические координаты для таргетинга инъекций в рстное кохлеарное ядро и IC мышей, а также как комбинировать запись зажима цельного клеточного зажима с активацией channelrhodopsin для исследования дальних проекций на IC нейронов. Хотя этот протокол адаптирован для характеристики слуховых входов в IC, он может быть легко адаптирован для изучения других долгосрочных прогнозов в слуховом стволе мозга и за его пределами.

Introduction

Синаптические связи имеют решающее значение для нейронной цепи функции, но точная топология и физиология синапсов в нейронных цепей часто трудно зондировать экспериментально. Это потому, что электрическая стимуляция, традиционный инструмент клеточной электрофизиологии, без разбора активирует аксоны вблизи места стимуляции, и в большинстве областей мозга, аксоны из различных источников (местные, восходящие, и / или нисходящие) переплетаются. Однако, с помощью channelrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM)1,2, это ограничение теперь можно преодолеть3. Channelrhodopsin (ChR2) является свет активирован, катиционно-селективный ионный канал, первоначально найденный в зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 может быть активирован синим светом длины волны около 450-490 нм, деполяризовать клетку через приток катиона. ChR2 был впервые описан и выражен в ооцитах Xenopus Нагелем и коллегами4. Вскоре после этого, Бойден и его коллеги5 выразили ChR2 в нейронах млекопитающих и показали, что они могут использовать световые импульсы, чтобы надежно контролировать пики на миллисекундный тайм-масштаб, вызывая потенциалдействия 10 мс после активации ChR2 с синим светом. Оптогенетические каналы с еще более быстрой кинетикой были найдены в последнее время (например, Chronos6).

Основной подход к эксперименту CRACM заключается в том, чтобы трансфектировать популяцию пресинаптических нейронов с рекомбинантным адено-ассоциированным вирусом (RAAV), который несет генетическую информацию для канала. Трансфекция нейронов с РААВ приводит к выражению закодированного каналародопсин. Как правило, channelrhodopsin помечены флуоресцентным белком, как GFP (Зеленый флуоресцентный белок) или tdTomato (красный флуоресцентный белок), так что трансфекция нейронов в целевой области может быть легко подтверждена с флуоресценции изображений. Поскольку RAAVs не патогенные, имеют низкий воспалительный потенциал и длительное выражениегена7,8, они стали стандартной техникой для доставки channelrhodopsins к нейронам. Если после трансфекции пресинаптической популяции нейронов активация канала через вспышки света вызывает постсинаптические потенциалы или токи в целевых нейронах, это свидетельствует о аксональной связи от трансинфицированного ядра к записанной клетке. Потому что разорванные аксоны в экспериментах ломтик мозга могут быть обусловлены выпустить нейромедиатор через активации channelrhodopsin, ядра, которые лежат за пределами острого ломтика, но отправить аксоны в постсинаптической области мозга могут быть определены с CRACM. Сила этого метода заключается в том, что связь и физиология выявленных синаптических входов дальнего радиуса действия могут быть непосредственно исследованы.

В дополнение к channelrhodopsins, которые возбудимы синим светом, следователи недавно определили несколько красных сдвига channelrhodopsins9,10, в том числе Chrimson и его быстрее аналог ChrimsonR, оба из которых возбуждены с красным светом 6. Красный сдвиг opsins представляют интерес, потому что красный свет проникает ткани лучше, чем синий свет, и красный свет может иметь более низкую цитотоксичность, чем синий свет10,11,12. Красно-сдвигаемые каналродопсины также открывают возможность двухцветных экспериментов CRACM, где сближение аксонов из разных ядер на одном и том же нейроне может быть проверено в одном эксперименте6,13,14. Тем не менее, текущие красно-сдвигаемые опсины часто демонстрируют нежелательные перекрестные активации с синим светом15,16,17, что затрудняет два цветных эксперимента. Кроме того, некоторые сообщения показали, что ChrimsonR подвергается ограниченной аксональной торговли, что может сделать его сложным использовать ChrimsonR для экспериментов CRACM16,17.

Почти все восходящие проекции из нижних слуховых ядер ствола сходятся в нижнем колликуле (IC), центре среднего мозга центрального слухового пути. Это включает в себя прогнозы из кохлеарного ядра (CN)18,19, большинство из превосходного оливари комплекса (SOC)20, и дорсальный (DNLL) и вентрал (VNLL) ядра бокового лемниска21. Кроме того, большая нисходящая проекция от слуховой коры заканчивается в IC18,19,20,21,22,и IC нейроны сами синапсы широко в пределах местных и контралатеральных долей IC23. Смешение аксонов из многих источников затрудняет зондирование IC схем с помощью электрической стимуляции24. В результате, даже несмотря на то, что нейроны в IC выполняют вычисления, важные для локализации звука и идентификации речевых и других коммуникационных звуков25,26,организация нейронных цепей в ИК в значительной степени неизвестна. Недавно мы определили VIP нейронов в качестве первого молекулярно идентифицируемого класса нейронов в IC27. VIP нейроны являются глутаматергических нейронов стеллата, которые проектируют на несколько дальних целей, в том числе слуховой таламус и превосходный колликул. Теперь мы можем определить источники и функции локальных и дальних входов в VIP-нейроны и определить, как эти соединения цепи способствуют обработке звука.

Протокол, представленный здесь, с учетом расследования синаптических входов в VIP-нейронов в IC мышей, в частности, от контралатерального IC и DCN (Рисунок 1). Протокол может быть легко адаптирован к различным источникам ввода, другой тип нейронов или другой области мозга в целом. Мы также показываем, что ChrimsonR является эффективным красным сдвигом channelrhodopsin для дальнего диапазона отображения в слуховом стволе мозга. Тем не менее, мы демонстрируем, что ChrimsonR сильно активируется синим светом, даже при низкой интенсивности, и, таким образом, чтобы объединить ChrimsonR с Chronos в двухцветных экспериментах CRACM, тщательный контроль должен быть использован для предотвращения перекрестной активации ChrimsonR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Получить одобрение от местного Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и придерживаться руководящих принципов NIH для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры в этом протоколе были одобрены IACUC Мичиганского университета и были в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Хирургические препараты

  1. Выполняйте операции в асептических условиях. Автоклав/стерилизовать все хирургические инструменты и материалы перед операцией. Носите хирургическое платье и маску для операции.
  2. Обезвитрить область хирургии (распылить и протрите вниз с 70% этанола), и место стерильные шторы полотенце для покрытия области хирургии.
  3. Подготовьте клетку восстановления. Удалите постельные принадлежности клетки, чтобы ограничить риск удушья. Положите грелку под клетку. Обеспечить источник пищи и воды.
  4. Потяните стеклянный капилляр для наноинжектора на выдвижной пипетке. Интенсивная жара нагревающей нити во время процесса вытягивания будет стерилизовать стеклянный капилляр. Отрежьте или оторвите кончик, чтобы получить отверстие примерно 5 мкм в диаметре.
  5. Освоить капиллярный наконечник примерно на 30 градусов, чтобы улучшить проникновение тканей и уменьшить засорение. Заполните капилляр минеральным маслом и вставьте в нанолитровый инжектор.
  6. Получить аликвот желаемого каналаrhodopsin-кодирования РААВ и разбавить до желаемого титра с помощью стерильных PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что серотип 1 rAAVs хорошо работать для трансфекции слуховых ядер ствола мозга. В частности, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (синий свет активированный каналродопсин) и rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (красно-сдвинчатый каналродопсин), которые доступны из общедоступных репозиториев и ядер, последовательно дают высокие уровни экспрессии и хорошей дальней аксональной торговли channelrhodopsins, необходимых для экспериментов CRACM.
  7. Следуйте инжекторам инструкции перед заполнением капилляра с 1-3 Л RAAV в стерильных PBS.

2. Хирургия

  1. Положите животное в индукционную камеру и вызвать анестезию с 3% изофлуран в кислороде, поставляемом через калиброванный испаритель изофлуран. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока дыхание не станет глубоким и медленным и не будет рефлекса, около 3-5 мин.
  2. Перенесите животное в стереотаксию. Защищайте голову животного, положив рот на бар с неба с газовой анестезией маски и позиционирование неперфорирующих ушных прутьев в обоих ушных каналов.
  3. Вставьте ректальный зонд температуры и включите гомеостатический контроллер температуры.
  4. Нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз.
  5. Администрирование упреждающего анальгетика (например, подкожная инъекция 5 мг/кг карпрофена).
  6. Отрегулируйте изолюран до 1-2,5%, в зависимости от глубины анестезируемого состояния. Мониторинг температуры, дыхания и цвета слизистых оболочек не реже чем каждые 15 минут во время процедуры.
  7. Бритье кожи головы с электрическими клиперами. Асептически подготовить кожу головы с тремя чередующимися мазками повидон-йода и 70% этанола.
  8. Сделайте разрез в коже головы вдоль средней линии, начиная между ушами и продолжая рострал к глазам, подвергая лямбда и bregma швы. Нажмите кожу в сторону и удалить периостеум из открытых костей, если это необходимо.
  9. Отметьте шов лямбда стерильным хирургическим маркером, поместите кончик наноинжектора так, чтобы он просто касался лямбды, и обнуляет координаты микроманипулятора. Используйте наконечник наноинжектора и микроманипулятор для измерения разницы в высоте между швами лямбда и брегма. Отрегулируйте высоту бар неба, чтобы принести lambda и bregma в пределах 100 мкм разница в высоте.
  10. Карта места инъекции с помощью наконечника наноинжектор и микроманипулятор координации системы и пометить сайт с стерильным хирургическим маркером. Для введения IC или DCN из P21-P30 мышей, использовать координаты относительно шва лямбда, как показано в таблице 1. Обратите внимание, что глубина в наших координатах измеряется с поверхности черепа на лямбде.
  11. Используйте микромоторную дрель со стерильной буровой заусенкой 0,5 мм для выполнения краниотомии над местом инъекции.
  12. Для обеспечения широкого трансфекции нейронов в ядре мишени, сделать инъекции на различных глубинах в ткани(Таблица 1, координаты), а в случае больших областей мозга, как IC, сделать инъекции в течение двух или более проникновений в различных X и Y координаты(Таблица 1, Право IC проникновения 1 и право IC проникновения 2).
  13. Выполняйте инъекции. Для инъекций IC, депозит 20 нл вируса в интервалах 250 мкм вдоль оси (глубина инъекций) между 2250 мкм и 1750 мкм глубины. Для инъекций DCN, депозит 20 нл вируса на глубине 4750 мкм и 4,550 мкм, соответственно.
  14. После впрыска в каждой координате, подождите 2-3 минуты, прежде чем перейти инжектор к следующему координату. Это позволит вирусу рассеяться вдали от места инъекции, уменьшая вероятность того, что вирус будет всасываться в инъекционный тракт, когда наноинжектор будет перемещен.
  15. После последней инъекции в проникновении, подождите 3-5 минут, прежде чем вытягивать наноинжектор из мозга.
  16. Когда наноинжектор удаляется из мозга между проникновением и между животными, выбрасывайте небольшой объем вируса из кончика, чтобы проверить, что кончик не засорен.
  17. После инъекций используйте стерильные PBS, чтобы промокнуть края головы, а затем осторожно переместить кожу обратно к средней линии. Закройте рану простыми прерванными швами, используя 6-0 (0,7 метрических) нейлоновые швы.
  18. Нанесите 0,5-1 мл 2% лидокаина гель на рану.
  19. Удалить ушные прутья и температурный зонд, выключить изолюран, удалить мышь из бара неба и перенести его в клетку восстановления.
  20. Внимательно следите за восстановлением. Как только животное полностью проснется, перемещаясь и не показывая никаких признаков боли или бедствия, перенесите его обратно в клетку и верните клетку в вивариум.
  21. Если операции будут выполнены на нескольких животных в один день, использовать горячий стерилизатор бисера для дезинфекции инструментов хирургии и буровой заусенцы до следующей операции.

3. Хирургическое наблюдение

  1. Проверяйте животных ежедневно на наличие замыкания ран, инфекции или признаков боли или бедствия в течение следующих 10 дней, придерживаясь руководящих принципов по уходу за животными в учреждении.
  2. Подождите 3-4 недели, прежде чем использовать животных в экспериментах, чтобы обеспечить оптимальное выражение каналодопсинов.

4. Подготовка ломтика мозга и подтверждение цели инъекций

  1. Для CRACM используйте остро подготовленные кусочки мозга от трансинфицированных животных в стандартных экспериментах по электрофизиологии in vitro, описанных здесь лишь кратко (см. Гойер и др. 2019 для более подробного описания27).
  2. Подготовка искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащей (в ММ): 125 NaCl, 12,5 D-глюкозы, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,252PO4, 1.5 CaCl2, 1 MgSO4. Пузырь ACSF до рН 7,4 с 5% CO2 в 95% O2.
  3. Выполните все следующие шаги, в том числе в пробирке электрофизиологии, в ближней темноте или красный свет, чтобы ограничить активацию channelrhodopsins.
  4. Глубоко обезвитрить мышь с изофлуран и обезглавить его быстро. Вскрыть мозг быстро в 34 градусов по Цельсию ACSF.
  5. Вырезать корональные ломтики (200-250 мкм), содержащий IC в 34 c ACSF с вибрирующим микротомом и инкубировать ломтики при 34 градусов по Цельсию в течение 30 минут в камере проведения заполнены acSF пузырились с 5% CO2 в 95% O2. После инкубации храните ломтики при комнатной температуре до использования для записи.
  6. Если целью инъекции не был IC, вырежьте дополнительные корональные ломтики впрыскиваемых областей мозга и проверьте трансфекцию ядра мишени под флуоресцентным микроскопом. Если нет трансфекции в ядре мишени или дополнительного трансфекции в различных областях мозга, не продолжайте эксперимент.

5. В пробирке Запись и CRACM Эксперимент

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптической стимуляции Chronos и ChrimsonR, мы используем светодиоды в сочетании с эпифлюоресценции порт микроскопа. Тем не менее, лазеры могут быть использованы вместо светодиодов. При использовании лазеров, получить предварительное одобрение от институциональных должностных лиц безопасности и следовать соответствующим руководящим принципам для безопасного использования лазера.

  1. Вытяните электроды из боросиликатного стекла до сопротивления 3,5-4,5 МЗ. Электродное внутреннее решение должно содержать (в ММ): 115 K-глюконат, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 фосфокреатин, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, дополненный 0.1% биоцитином (w/v), рН скорректированный до 7.3 с KOH и osmolality до 290 mOsm/kg с сахарозой.
  2. Для записи используйте стандартные методы зажима патча. Поместите срез в камеру звукозаписи под фиксированным сценическим вертикальном микроскопом и непрерывно нанизать с ACSF на 2 мл/ мин. Проведение записей вблизи физиологической температуры (34-36 градусов по Цельсию).
  3. Патч нейронов под визуальным контролем с помощью подходящего усилителя патч зажим. Правильно для устойчивости серии, емки пипетки и потенциала жидкого соединения.
  4. Во время целых записей ячейки активируйте Chronos, доставляя краткие импульсы (1-5 мс) 470 нм света или ChrimsonR с помощью кратких импульсов 580 нм света через коммерчески доступные светодиоды. Определите порог активации опсина и используйте минимальный протокол стимуляции для выяснения постсинаптических потенциалов. В целом, используйте кратчайшую продолжительность стимула, который вызывает PSP, и установить оптическую мощность до 120% от пороговой мощности, необходимой для получения PSPs.
  5. Чтобы подтвердить, что зарегистрированные изменения в мембранном потенциале действительно синаптические входы в нейрон, стандартные антагонисты для возбуждающие / ингибиторные постсинаптические рецепторы могут быть вымыты в ходе эксперимента. Для исследования различных рецепторов вклад ас-ПСП (например, NMDA против рецепторов АМРА), подходящие антагонисты рецепторов могут быть промывают дюйма Для каждого антагониста рецепторов, эффекты препарата должны обратить вспять после вымывания.
  6. Используйте задержку, дрожь и надежность PSPs, чтобы подтвердить, что свет активированный синаптических входов происходят от прямой, оптической активации синапсов на записанном нейроне, в отличие от активации каналродопсин-выражения синапсов на промежуточных нейрон, который синапсирует на записанном нейроне. В целом, низкая задержка (злот;2 мс), низкая испуг (зlt;1 мс стандартное отклонение в задержке) и высокая надежность (0,50%) указать прямую синаптической связи от каналаrhodopsin выражения пресинаптический нейрон в записанный нейрон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы пересекли VIP-IRES-Cre мышей(Viptm1 (cre) JH/J) и Ai14 Cre-репортер мышей (B6. Cg-Gt (ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) для генерации потомства F1, в котором VIP нейроны выражают флуоресцентный белок tdTomato. F1 потомство обоих полов были использованы, в возрасте послеродового дня (P) 21 до P70. В общей сложности 22 животных были использованы в этом исследовании.

Стереотаксическая инъекция AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH в правый IC ИЗВИЯ-Cre x Ai14 мышей с помощью координат, показанных в таблице 1, привел к сильному экспрессии Chronos-EGFP в правом IC(рисунок 2A). Визуальный осмотр флуоресценции Chronos-EGFP показал, что большая часть соматы, помеченной в правом IC, находилась в центральном ядре IC (ICc), но помеченные как соматы иногда также присутствовали в коре в области вдовчения IC (ICd), а иногда и в боковой коре IC (IClc). Таргетинг и степень трансфекции должны быть проверены для каждого животного, используемого в эксперименте, так как выражение каналродопсинов в нецелевых регионах может привести к ложным срабатываниям. Для достижения более широкого или более ограниченного выражения Chronos количество отложенного вируса, а также стереотаксические координаты могут быть легко скорректированы для достижения желаемого результата.

Стереотаксическая инъекция AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH в DCN (см. координаты в таблице 1) из VIP-IRES-Cre x Ai14 мышей привело к сильной трансфекции нейронов DCN (Рисунок 2B). Для подтверждения селективного трансфекции ДКН, ствол мозга каждого животного должен быть нарезан, чтобы убедиться, что выражение EGFP присутствует и ограничивается DCN. Если нет трансфекции или если есть значительное выражение EGFP в слуховом нерве или VCN, записи не должны быть выполнены. Используя координаты, указанные в таблице 1 с общим объемом инъекций 40 nL, выражение Chronos-EGFP будет ограничено DCN в большинстве случаев. Аксоны с маркировкой EGFP присутствовали в левом (контралатеральном) ICc через 3 недели после инъекции как для участков инъекции IC и DCN(рисунок 2Справа, 2B справа).

Чтобы проверить дальнюю торговлю ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH был введен в правый DCN из VIP-IRES-Cre x Ai14 мышей, используя те же координаты, что и при инъекциях Chronos. ChrimsonR инъекции привели к сильной экспрессии в DCN, с tdTomato флуоресценции видны в клетках и волокнах(Рисунок 3A). В contralateral ICc, волокна сильно помечены tdTomato были хорошо видны после 3 недель, демонстрируя возможность долгосрочного оборота ChrimsonR-tdTomato конструкции при введении в слуховых ядрах ствола мозга (Рисунок 3B). Оптическая активация ChrimsonR вызвала EPSPs в IC VIP нейронов(рисунок 3C), указывая, что ChrimsonR является полезным инструментом для долгосрочных экспериментов CRACM, когда экспериментальные параметры требуют использования красного света вместо синего света. Тем не менее, мы обнаружили, что ChrimsonR был легко активирован с синим светом, показывая тот же порог для активации синего света, как Chronos (Рисунок 4). Чувствительность ChrimsonR к синего света означает, что необходимо проявлять особую осторожность, чтобы различать входы, трансфицируемые ChrimsonR или Chronos в одном животном13.

При таргетинге записей на VIP-нейроны в контралатеральном (левом) МЦК после инъекций в правый IC, вспышки синего света вызывают возбуждающие постсинаптические потенциалы (EPSPs) или ингибирующие постсинаптические потенциалы (IPSPs). Это подтверждает комиссионерские прогнозы ДЛЯ VIP нейронов. Для отдельного анализа commissural EPSP и IPSPs мы использовали антагонистов рецепторов для блокирования IPSp во время записей EPSP, и наоборот. Представитель EPSPs и IPSPs, записанные в ходе экспериментов CRACM, показаны на рисунке 5. IPSPs наблюдались в 6 из 12 проверенных ICc VIP нейронов. IPSPs были небольшими (1,53 мВ и 0,96 мВ) и имели умеренную кинетику. 10 - 90% время роста IPSPs были 7,8 мс и 2,1 мс, полуширины были 15,1 мс и 6,8 мс, и время распада константы были 32,4 мс и 17,0 мс(Рисунок 5A, слева). IPSPs были опосредованы рецепторами ГАМКА, так как они были заблокированы 5 мкм габазин, антагонист рецепторов ГАМКА (рисунок 5A, право; n No 6). EPSPs наблюдались в 11 из 27 протестированных VIP-нейронов ICC. EPSPs были также небольшими (1,52 мВ и 1,08 мВ) и имели умеренную кинетику. 10 - 90% время роста EPSPs были 8,3 мс и 4,3 мс, полуширины были 19,6 мс и 7,6 мс, и время распада константы были 43,5 мс и 16,8 мс(Рисунок 5B "Контроль"). EPSPs были опосредованы рецепторами AMPA и NMDA. Применение 50 мкм D-AP5, антагониста рецепторов NMDA, снижение полуширины EPSP (14,3 мс и 4,7 мс, р 0,006) и тенденции к сокращению времени подъема (6,3 мс и 1,6 мс, р 0,09), время распада постоянной (30,6 мс и 7,3 мс, р 0,06), и EPSP амплитуда (1,38 - 0,33 мв., р.10; ANOVA для повторных измерений с Tukey после специального теста). Применение 10 ММ НБЗХ, антагониста рецепторов АМРА, заблокировало оставшуюся часть EPSP(рисунок 5B «AP5 и НБЗХ»).

Записи VIP нейронов в левом ICC после инъекций DCN показали EPSPs вызванные синими вспышками света, подтверждающие синаптические входы из DCN в VIP нейронов в IC. DCN CRACM эксперименты были проведены с ГАМК и глицинергических блокаторов в ванне, чтобы блокировать спонтанные IPSPs. Мы обнаружили, что 2-5 мс импульсы синего света вызвали EPSPs в 19 из 25 нейронов испытания. Световые EPSPs имели умеренные амплитуда (2,85 мВ 2,98 мВ) и относительно медленное время подъема (4,2 мс и 1,3 мс), полуширины (20,6 мс и 14,4 мс) и константы времени распада (22,0 м.6 мв.) (n 6 мв.) (n q 6 мс, данные не показаны).

Все PSPs, вызванные активацией Chronos или ChrimsonR, были вызваны все или ни одним способом и не масштабировали их амплитуду с увеличением оптической мощности (данные не показаны). Тем не менее, этот результат зависит от количества и физиологии транс-инфицированных синапсов, обеспечивающих вход в определенный нейрон и, следовательно, может варьироваться в зависимости от конкретной комбинации аксональной проекции и типа нейронов исследуются.

Figure 1
Рисунок 1: места впрыска RAAV и экспериментальная установка. (A) Сайт инъекций и экспериментальная установка для исследования коммиссионных прогнозов. Слева: конструкция RAAV (например, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) вводится в правый IC, а целевые записи выполняются в контралатеральном IC. Справа: Во время записи зажима патча, Chronos-транс-транс-инфицированных волокон возбуждаются с синим светом, чтобы вызвать postsynaptic потенциалов. (B) Место инъекций и экспериментальная установка для исследования дальних проекций от DCN до IC. Слева: Конструкция ChrimsonR вводится в правый DCN, а целевые записи выполняются в контралатеральном IC. Справа: Во время записи зажима патча, ChrimsonR-транс-транс-инфицированных волокон возбуждаются с красным светом для записи ChrimsonR вызвал postsynaptic потенциалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Выражение Chronos-EGFP после инъекций в IC и DCN. (A)Слева: Изображение корональной IC ломтик показаны tdTomato помечены VIP нейронов по всей IC (магента) и Chronos-EGFP выражение в сомата локализованы в местах инъекций в правой IC (зеленый). Справа: Изображение более высокого увеличения, показывающее записанный VIP нейрон (бело-зеленый) в противолатеральном IC к месту инъекции. Зеленая пунктта Chronos-EGFP, выражающая прогнозы от контралатерального IC. (B) Изображение коронарного мозга ломтик показаны Chronos-EGFP выражение в DCN после rAAV-Chronos-EGFP инъекции. Слева: Изображение DCN, показывающее трансинфицированные DCN и EGFP-положительные волокна, попадающие в дорсальную акустическую стрию. Середина: Высшее увеличение изображения, показывающего Хронос-трансинфицированных клеточных тел в DCN. Справа: Выражение Chronos-EGFP в волокнах и терминалах в контралатеральном IC из дальней проекции DCN-IC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: ChrimsonR-tdTomato выражение в DCN и DCN прогнозы IC. (A) Изображение коронарного ствола мозга ломтик из мыши, в котором право DCN был введен с rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Слева: Изображение экспрессии ChrimsonR в правом DCN. Справа: Высшее увеличение изображения правого DCN показывает сильную трансфекцию нейронов с ChrimsonR. (B) Высокое увеличение изображения ChrimsonR-транс-транс-трансаконов DCN в IC. (C) Оптогенетически вызвалep EPSPs, записанные из VIP-нейрона в IC контралатеральной для rAAV-ChrimsonR вводили DCN. Исходные следы показаны в светло-серый цвет и средний EPSP в красном цвете. Оранжевый ящик указывает время 590 нм световой импульс. Шкала баров 20 мс/0,5 мВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Активация ChrimsonR низким уровнем синего света. (A) Активация Chronos в комиссионерских проекциях импульсами синего света 470 нм. Вверху: Оригинальные следы (светло-серый) и средний (циан) IPSPs, управляемых Chronos, вызываемые при оптической мощности чуть выше порога для активации Chronos (шкала баров показывает 20 м/0,5 мВ). Внизу: Связь между оптической мощностью на уровне 470 нм и вероятностью наблюдения хронос-вызванного PSP. (B) Активация ChrimsonR с 470 нм синий свет. Вверху: Оригинальные следы (светло-серый) и средний (красный) из ChrimsonR-управляемых EPSPs, вызванные с 470 нм синий свет при той же оптической мощности, используемой в A, верхний (шкала баров показывают 20 мс / 0,5 мВ). Внизу: Связь между оптической мощностью на уровне 470 нм и вероятностью наблюдения за PSP, управляемым ChrimsonR. Обратите внимание, что порог активации синего света ChrimsonR PSPs был идентичен порогу для получения Chronos PSPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Характеристика свето-вызванных PSPs от commissural синапсов на VIP нейронов. Правый IC был введен с rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH и записи были сделаны из VIP нейронов в контралатеральном ICc. (A) Оптогенетически вызываемые IPSPs были вызваны 2-5 мс синий свет вспышки (слева), в то время как EPSPs были заблокированы 10 ММ НБЗХ и 50 мкм D-AP5. IPSPs были отменены габазин (справа). (B) Оптогенетически вызываемых EPSPs были вызваны 2-5 мс синий свет вспышки (слева), в то время как IPSPs были заблокированы с 1 ММ стрихнин и 5 ММ габазин. Вымойка в 50 мкм D-AP5 значительно сократила полуширину и время распада постоянной свето-вызванных EPSPs (средний). Умывка в 10 км НБЗХ отменила оставшийся EPSP (справа). Исходные следы в A и B показаны в светло-серый цвет, а средние значения от до 50 отдельных следов показаны черным цветом. От Гойера и др., 2019. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

X (боковой) Y (каудаль) ( глубина)
Право проникновения IC 1 1000 мкм -900 мкм 2250-1500 мкм
(250 мкм шагом)
Право проникновения IC 2 1250 мкм -900 мкм 2,250-1750 мкм
(250 мкм шагом)
Право DCN 2155 мкм -1325 мкм 4750 мкм, 4550 мкм

Таблица 1: Стереотаксические координаты для инъекций RAAV в IC и DCN. Все координаты относительно лямбды в мкм. Координаты измеряются из торцевой поверхности черепа в лямбда.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы обнаружили, что CRACM является мощным методом для выявления и характеристики синаптических входов дальнего радиуса действия в нейроны мыши IC. Следуя описанному здесь протоколу, мы добились надежной трансфекции нейронов в DCN и IC, а также надежной аксональной торговли Chronos и ChrimsonR синаптическими терминалами в Ic. Кроме того, мы продемонстрировали, что этот метод позволяет измерения и анализа постсинаптических событий, в том числе PSP амплитуда, полуширина, время распада, и рецептор фармакологии. Наш опыт показывает, что этот подход может быть легко адаптирован для выполнения функциональных экспериментов картирования схем ы на протяжении всего слухового ствола мозга и за его пределами.

В целом, специфика картографической оптогенетической цепи обеспечивает явное преимущество перед электрической стимуляцией аксонов. Вирусные трансфекты обеспечивают способность пространственно и молекулярно ограничивать экспрессию каналодопсинов целевой популяции пресинаптических нейронов. В отличие от этого, электрическая стимуляция не может различать аксоны, происходящие из различных пресинаптических ядер, когда эти аксоны переплетаются, как это имеет место в большинстве областей мозга. Электрическая стимуляция может также инициировать как ортодромные и антидромные шипы, дальнейшее осложняет вопросы, когда дистальная стимуляция сайт содержит аксоны, происходящие из нейронов, расположенных вблизи места записи.

Для обеспечения стабильного выражения и хорошей аксональной торговли channelrhodopsin, выбор правильного вирусного вектора и серотипа имеет первостепенное значение. Мы обнаружили, что стабильное выражение Chronos в нейронах IC было достигнуто с серотипом 1 RAAV, включая Chronos или ChrimsonR конструкцию в сочетании с суркового гепатита посттрансктионный регулятивный элемент (WPRE) и гормон роста крупного рогатого скота (BGH) полиаденилационный сигнал. серотип rAAV 5 не производил функциональных опсинов в IC, но был функциональным в DCN (данные не показаны). Столь же важна и тщательная проверка координат инъекций для каждого эксперимента и обеспечение того, чтобы экспрессия опсина ограничивалась целевой областью мозга. Значимая идентификация входных данных возможна только в том случае, если выражение опсина тщательно проверяется и документируется для каждого эксперимента.

Конструкция rAAV1.ChrimsonR, используемая в вышеупомянутом протоколе, дала стабильную экспрессию и хорошую аксональную торговлю белком, даже в дальних проекциях от DCN до IC (Рисунок 3). Это делает ChrimsonR подходящим опсином для (дальнего) отображения цепи. Красный сдвинутый опсин, как ChrimsonR может быть полезным, если экспериментальные параметры требуют проникновения света глубоко в ткани, но экспериментатор должен знать, что все имеющиеся в настоящее время красные сдвиги opsins показать некоторые кросс-активации с синим светом. Хотя некоторые исследования утверждают, что ChrimsonR и Chronos могут быть отдельно активированы6,14,16, наши данные свидетельствуют о том, что большую осторожность должны быть приняты с этим подходом. В недавнем отчете подробно описаны дополнительные методы, которые следует использовать при попытке отделить красно-сдвинутые опсины от Chronos13. Поэтому при использовании ChrimsonR и Chronos в двух цветных экспериментах CRACM необходимо проводить тщательно разработанные контрольные эксперименты, чтобы обеспечить четкое разделение синей и красно-сдвинутого активации опсина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft научно-исследовательской стипендии (GO 3060/1-1, проект номер 401540516, в ГД) и Национальные институты здравоохранения грант R56 DC016880 (MTR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).

Tags

Нейронаука Выпуск 156 Каналродопсин-помощь схемы картирования оптогенетика Chronos ChrimsonR нижний колликул слуховой ствол мозга
Долгосрочный Channelrhodopsin-помощь цепи Картирование Нижнего Колликулнейроннейроны с синим и красным сдвинутым Channelrhodopsins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range … More

Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter