Summary
Este protocolo descreve os passos críticos necessários para estabelecer e cultivar culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de tecido humano ou ovino. Também é apresentado um método para subculindo células endoteliais córneas em biomateriais membranrosas.
Abstract
As culturas de células endoteliais da córnea tendem a se submeter à transição epitelial-mesenquimal (EMT) após a perda do contato celular-célula. O EMT é deletério para as células, pois reduz sua capacidade de formar uma camada madura e funcional. Aqui, apresentamos um método para estabelecer e subculir culturas de células endoteliais de córnea humanas e ovelhas que minimizam a perda do contato celular-célula. Explantas de endotelio córnea/membrana descemet são retiradas de córneas doadoras e colocadas na cultura tecidual em condições que permitem que as células migrem coletivamente para a superfície cultural. Uma vez estabelecida uma cultura, as explantas são transferidas para placas novas para iniciar novas culturas. Dispase II é usado para levantar suavemente aglomerados de células das placas de cultura do tecido para subculturing. Culturas de células endoteliais da córnea que foram estabelecidas usando este protocolo são adequadas para transferência para membranas biomateriais para produzir camadas celulares projetadas por tecido para transplante em ensaios em animais. Um dispositivo personalizado para suportar membranas biomateriais durante a cultura tecidual é descrito e um exemplo de um enxerto projetado por tecido composto por uma camada de células endoteliais da córnea e uma camada de células estrôquias córneas em ambos os lados de uma membrana do tipo I de colágeno é apresentada.
Introduction
A córnea é um tecido transparente que está situado na frente do olho. É composto por três camadas principais: uma camada epitelial na superfície externa, uma camada de estroma médio e uma camada interna chamada endotelio córnea. O endotelio córnea é uma monocamada de células que fica em uma membrana do porão chamada membrana de Descemet e mantém a transparência da córnea regulando a quantidade de fluido que entra no estrume do humor aquoso subjacente. Muito fluido dentro do estrume causa inchaço na córnea, opacidade e perda de visão. O endotelo é, portanto, vital para manter a visão.
O endotelo córnea pode se tornar disfuncional por uma série de razões, incluindo envelhecimento, doença e lesão, e o único tratamento atual é a cirurgia de transplante. Durante esta cirurgia, o endotelo e a membrana de Descemet são removidos da córnea do paciente e substituídos por um enxerto de endotelio e a membrana de Descemet obtida de uma córnea doadora. Muitos enxertos de endotelio também contêm uma fina camada de tecido estrônio para ajudar no manuseio e afixação à córneahospedeira 1.
Em todo o mundo, a demanda por tecido doador de córnea para cirurgias de transplante é maior do que a quantidade que pode ser fornecida pelos bancos oculares2. Por isso, houve um impulso para desenvolver transplantes de endotelio de córnea projetados por tecido que poderiam ser usados para aliviar essa carência3. A lógica para isso baseia-se no fato de que, atualmente, o endotelo de uma córnea individual só pode ser transferido para um único paciente, no entanto, se as células endoteliais da córnea foram expandidas e cultivadas pela primeira vez em andaimes biomateriais na cultura tecidual, elas poderiam ser usadas para tratar vários pacientes.
Os principais desafios que precisam ser enfrentados antes que transplantes de endotelio de córnea projetados por tecido se tornem uma opção viável para os cirurgiões incluem: (1) estabelecer técnicas para expandir células endoteliais da córnea de alta qualidade e para a produção de maduros e camadas funcionais de células endoteliais in vitro, e (2) estabelecendo técnicas para o cultivo das células em andaimes biomateriais para produzir enxertos projetados por tecido que são iguais, ou melhores do que, os enxertos derivados da córnea doador que são usados atualmente.
As células endoteliais da córnea têm um potencial proliferativo muito baixo in vivo, mas podem ser estimuladas a dividir in vitro4. No entanto, eles têm uma forte tendência a se submeter à transição epitelial in vitro para messínquimal (EMT), que reduz sua capacidade de formar uma camada endólial madura e funcional. Os gatilhos conhecidos para EMT em células endoteliais da córnea incluem exposição a certos fatores de crescimento e perda do contato celular-célula5. É, portanto, quase inevitável que as culturas de células endoteliais da córnea que são enzimáticamente dissociadas durante a subcultura sofrerão mudanças associadas à EMT. Aqui, apresentamos um método de cultura celular para células endoteliais de córneas humanas ou ovelhas que foi projetada para minimizar a interrupção dos contatos entre células durante estágios de isolamento, expansão e subcultura, para reduzir o potencial para a EMT. Além disso, demonstramos como enxertos projetados por tecido que se assemelham ao endotelo derivado de córnea/enxertos de tecido estrônico da Descemet podem ser produzidos pelo cultivo de camadas de células cultivadas em ambos os lados de uma membrana biomaterial em um dispositivo de montagem personalizado.
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Protocol
Córneas humanas com consentimento de doadores para pesquisa foram obtidas do Queensland Eye Bank e usadas com aprovação ética do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Do Sul e do Serviço de Saúde do Metro South (HREC/07/QPAH/048). Córneas de ovelhas foram obtidas de animais eutanizados no Herston Medical Research Facility da Universidade de Queensland um acordo de compartilhamento de tecidos.
1. Preparação de ferramentas de dissecção
- Esterilizar dois pares de fórceps de relojoeiro número 4, encharcando-os em uma solução de 70% de etanol por 5 min ou autoclaving-los.
2. Preparação de placas culturais de cultura média e tecidual
- Prepare 100 mL de meio cultural contendo Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% de soro bovino fetal e 100 U/mL Pen/Estrep. Este meio cultural é adequado para culturas de células endoteliais de ovelha, no entanto, para culturas de células endoteliais da córnea humana, o meio deve ser complementado com extrato pituitário bovino de 50 μg/mL, 0,08% de sulfato de condroitina, cloreto de cálcio de 200 μg/mL e 0,3 mM L-ascorbicácido 2-fosfato. O meio de cultura pode ser armazenado no escuro a 4 °C por duas semanas.
- Cubra os poços de uma placa de cultura de tecido de 6 poços com fator de apego usando as instruções do fabricante e, em seguida, adicione 1 mL de cultura média a cada poço revestido. Prepare um bem para cada córnea.
3. Dissecação explantária e procedimento de cultura celular
- Coloque a córnea, o lado endotelio para cima, em uma placa de Petri estéril no palco de um microscópio dissecando. Ajuste a iluminação para que a superfície da córnea seja bem iluminada com contraste suficiente para destacar a camada endotelial. Ajuste o zoom para que a borda e algum endotelo da córnea central esteja em vista.
- Use fórceps esterilizados para levantar e rasgar suavemente a membrana de Descemet longe do estroma subjacente (Figura 1). A membrana se desprenderá do estroma como uma tira que imediatamente se enrola. Coloque a tira em um poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços que foi revestida com Fator de Apego e contém 1 mL de meio cultural. A tampa da placa de cultura do tecido deve ser mantida em todos os momentos, exceto quando as explantas estão sendo adicionadas a ela, para reduzir o risco de contaminação.
- Remova as tiras da membrana de Descemet da periferia extrema do endotelo primeiro e depois das regiões centrais mais tarde. Coloque todas as tiras de uma córnea em um único poço dentro da placa de 6 poços.
- Incubar as explants em uma incubadora de cultura celular umidificada fixada em 5% CO2 e 37 °C. Deixe a cultura intacta por 2 dias para permitir que as explants se instalem e se afiem à superfície da placa. Normalmente, até um terço das explantas não se prendem à placa.
- Remova o meio e qualquer explants não anexada da cultura após 4 dias e adicione suavemente 2 mL de cultura fresca meio tomando cuidado para não perturbar as explantas anexadas. O meio cultural deve ser alterado duas vezes por semana.
4. Produção contínua de células endoteliais da córnea pela cultura explante em série
NOTA: Explantas podem ser transferidas para placas de cultura de tecido fresco após 10 dias para estabelecer culturas celulares endoteliais endoteliais adicionais.
- Coloque a cultura explante no palco de um microscópio dissecando e ajuste a iluminação e o zoom para que as explantas sejam visíveis.
- Usando fórceps esterilizados, retire suavemente cada explanta de sua placa de cultura e transfira-a para um poço fresco de uma placa de cultura de tecido de 6 poços que foi revestida com Fator de Apego e contém 1 mL de meio cultural.
- Permita que as explants se instalem na superfície de sua nova placa por 4 dias antes de substituir o meio cultural por 2 mL de meio de cultura fresca. Mudar o meio cultural mudou duas vezes por semana.
5. Células endoteliais de córnea em tampas de vidro para análises de imunofluorescência
NOTA: Culturas celulares destinadas a serem analisadas usando imunofluorescência devem ser estabelecidas em tampas de vidro que podem ser montadas em slides de microscópio de vidro após o procedimento de coloração.
- Esterilizar um pacote de tampas redondas de vidro de 13 mm de diâmetro em um autoclave ou encharcando 70% de etanol por 15 min seguido por três enxágues em sorofia tampão de fosfato (PBS).
- Coloque os coverslips individuais nos poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços, cubra-os com Fator de Apego e, em seguida, adicione 0,5 mL de cultura média a cada poço.
- Usando fórceps esterilizados remover explantas de suas placas de cultura de tecido e transferi-las para poços contendo tampas. Deixe as explants se instalarem nos deslizamentos de cobertura por 4 dias antes de mudar o meio.
- Após o período de incubação necessário, fixe e colora as culturas de deslizamento de cobertura dentro de seus poços culturais. Monte os deslizamentos de cobertura manchados em slides de microscópio de vidro para análise um microscópio de fluorescência.
6. Subcultura de células endoteliais da córnea usando Dispase II
NOTA: Grandes células fibrobésticas podem ser removidas seletivamente de culturas explantais em placas de 6 poços antes de subculmar usando este procedimento. Se todas as células forem subcultivadas, não realize etapas de 6,2 a 6,4. O objetivo deste procedimento é transferir as células para placas frescas, mantendo seus contatos celular-celular o máximo possível. As células devem ser manuseadas suavemente. Os poços completamente confluentes devem ser repassagems a uma proporção de 1:2, enquanto os poços subconfluentes devem ser passagens a uma proporção de 1:1 ou menos.
- Retire o meio da cultura e enxágue brevemente com DPBS.
- Adicione 1 mL de Versene. Incubar a temperatura ambiente de 30 s.
- Remova o Versene e adicione 1 mL de TrypLE. Incubar a 37 °C na incubadora de cultura tecidual por 3 min.
- Observe a cultura usando um microscópio de contraste de fase. Toque delicadamente na cultura para desalojar células do prato. Assim que as grandes células fibroblásticas se desprendem da placa remova-as e o TrypLE usando uma pipeta de 1 mL. Lave o trypLE residual das células restantes enxaguando duas vezes com 2 mL de DPBS.
- Adicione 1 mL de 1 mg/mL Dispase II à cultura e incubar na incubadora de cultura tecidual por 1 a 2h ou até que todas as células tenham se destacado da placa. As células devem gradualmente flutuar para longe da placa em aglomerados.
- Colete as células usando uma pipeta de 1 mL e transfira para 20 mL de DPBS em um tubo de centrífuga de 50 mL. Centrífuga por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
- Remova o supernatant e resuspenda suavemente a pelota celular por trituração com uma pipeta de 1 mL em 1 mL de meio cultural. Transfira a suspensão celular para um ou dois poços de uma placa de 6 poços, para passagem a uma razão de 1:1 ou 1:2, respectivamente.
- Cubra o meio em cada poço para fazer 2 mL e coloque as culturas na incubadora de cultura tecidual. Substitua o médio por 2 mL de meio fresco duas vezes por semana.
7. Crescimento de camadas de células endoteliais da córnea em membranas biomateriais
NOTA: O procedimento a seguir descreve as etapas envolvidas na montagem de um biomaterial membranme em um dispositivo de montagem feito medida — chamado de câmara micro-Boyden — para cultura celular. Consulte nossa recente publicação6 para obter mais informações sobre o dispositivo e para obter detalhes de compra.
- Monte a câmara superior da câmara micro-Boyden colocando um O-ring vermelho em seu centro.
- Use um trephine de 18 mm de diâmetro para socar um disco de uma folha biomaterial em uma placa de corte de politetrafluoroethtileno (PTFE). Coloque este disco sobre o anel Vermelho O na câmara superior da câmara micro-Boyden.
- Dane-se a câmara inferior na câmara superior, protegendo o disco biomaterial no meio.
- Mergulhe a câmara de microboyden montada em 70% de etanol por 1h para esterilizá-la.
- Mergulhe completamente a câmara de micro-Boyden montada em HBSS estéril por 10 min para remover o etanol. Repita este passo de lavagem duas vezes. Realize uma etapa final de lavagem por 10 min em meio de cultura não suplementar.
- Transfira a câmara micro-Boyden esterilizada para o meio de cultura no poço de uma placa de 6 poços garantindo que a câmara superior seja superior. Ajuste o nível de meio cultural para que ele entre em contato com a superfície inferior da membrana biomaterial, mas não flua para a câmara superior.
- Prepare uma suspensão das células endoteliais da córnea usando o procedimento descrito na seção 6. A densidade celular suficiente na suspensão deve ser alcançada para permitir uma densidade de semeades de pelo menos 100.000 células por cm2 na membrana na câmara micro-Boyden. A área de superfície da cultura dentro da câmara micro-Boyden é de 0,5 cm2 e pode conter um volume de 100 μL. Portanto, deve ser preparada uma suspensão contendo 500.000 células/mL.
- Pipette 100 μL de suspensão celular (50.000 células) na membrana na câmara micro-Boyden. Incubar na incubadora de cultura tecidual por 4 h antes de cobrir o meio para submergir completamente a câmara. Incubar a cultura pelo período de tempo necessário, substituindo o médium duas vezes por semana.
NOTA: Uma vez que as células endoteliais da córnea se apegam à superfície superior da membrana biomaterial, a câmara micro-Boyden pode ser virada dentro da cultura bem para que a câmara inferior seja superior. Mais células podem então ser adicionadas à câmara para iniciar culturas celulares na outra superfície da membrana. Por exemplo, as células estromal córnea podem ser prontamente aplicadas à superfície alternativa, imitando assim a localização relativa dos tipos de células córneas como visto dentro da córnea posterior.
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Representative Results
O método para isolar e expandir células endoteliais córneas de córneas humanas ou ovelhas é resumido na Figura 1 e Figura 2. A maioria das explantas derivadas das córneas de 1 a 2 anos de idade doadores ou doadores humanos com menos de 30 anos de idade se ligarão às placas de cultura do tecido revestido do Fator anexo dentro de uma semana, no entanto, não é incomum descobrir que até um terço das explantas não se apegam dentro deste período. Essas explantas 'flutuantes' podem ser removidas das culturas. Explants de doadores humanos com mais de 30 anos são menos propensos a se anexar à placa e também menos propensas a produzir culturas celulares. Imagens representativas das culturas de células endoteliais da córnea geradas a partir de ovelhas e explantas humanas são mostradas na Figura 3 e Figura 4. As células que emergem das explantas geralmente permanecem em contato entre si enquanto migram para a placa. Esse tipo de migração é conhecida como migração de células coletivas, e é uma característica das células epiteliais7. Por 2 semanas de cultura, manchas de pequenas células bem embaladas terão se formado imediatamente ao lado de muitas das explantas de ovelhas e córneas humanas8. Essas manchas de células não exibem características morfológicas da EMT e se expandem lentamente ao longo do tempo. Células maiores com formas fibrobésticas mais irregulares podem ser encontradas fora dessas manchas. Uma vez estabelecidas as culturas, as explantas podem ser removidas usando fórceps e colocadas em placas frescas para estabelecer novas culturas.
Células pequenas e bem embaladas dentro das culturas de células endoteliais da córnea são muito resistentes à digestão com o TrypLE, enquanto as células fibrobésticas maiores são mais sensíveis a ela. Essa diferença na resistência do TrypLE pode ser explorada para remover seletivamente grandes células das culturas antes de transferir as células menores para novas placas. Imagens representativas das culturas de células endoteliais da córnea humana durante todo o processo de subculação usando TrypLE e Dispase II são mostradas na Figura 4.
As análises de imunofluorescência podem ser realizadas em culturas de células endoteliais da córnea para localizar proteínas específicas nas células. Um exemplo disso é apresentado na Figura 5. Explantas de ovelhas e córneas humanas foram colocadas em revestimentos de vidro revestidos por Fator anexo em placas de 24 poços e cultivadas por 4 semanas. As explantas foram removidas e, em seguida, as culturas foram analisadas usando imunofluorescência para a presença de ZO-1, uma proteína de junção apertada, e N-cadherin, uma proteína de junção de adeptos, de acordo com nosso protocolo publicado9. Os mesmos anti-ZO-1 e anti-n-cadherin foram usados para células ovelhas e humanas, e os resultados mostraram que ambas as proteínas foram detectadas nas membranas plasmáticas de células de ambas as espécies. Zo-1 normalmente está presente como uma banda distinta na fronteira celular, mas se torna fraco ou ausente nas células submetidas à EMT. Portanto, a robusta expressão ZO-1 nessas culturas indicou que as células não haviam sido submetidas à EMT.
Nossas câmaras micro-Boyden personalizadas foram projetadas para suspender uma membrana biomaterial dentro do poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços(Figura 6). O procedimento para montagem de uma membrana biomaterial em uma câmara micro-Boyden é mostrado na Figura 7. O desenho da câmara micro-Boyden permite que ambos os lados da membrana suspensas dentro dela sejam usados como superfícies da cultura celular simultaneamente. Para demonstrar isso, as células estrumes de ovelhas derivadas do tecido estrôquico córnea foram semeadas a uma densidade de 100.000 células/cm2 para um lado de uma membrana tipo I de colágeno e, em seguida, 24 h depois a câmara foi virada e células endoteliais de córnea de ovelha foram semeadas para o outro lado da membrana em uma densidade de 400.000 células/cm2. As camadas celulares projetadas por tecido foram cultivadas por 4 semanas, depois fixadas com formalina tampão 10% neutra e manchadas usando phalloidin a mina de rhodamina e corantes nucleares hoechst 33342. Eles foram então examinados e fotografados usando um microscópio confocal (Figura 8). Uma visão transversal da construção celular projetada por tecido revelou uma única camada de células endoteliais córneas em uma superfície da membrana colágeno e uma cultura multicamadas de células estéreis córneas na outra superfície.
Figura 1: Técnica para obtenção de explantas de membrana de endotelio/Descemet a partir de córneas frescas. (A)A córnea é colocada lado a lado endotelio em uma placa de Petri um microscópio dissecando. (B) Close-up view da área indicada por um retângulo vermelho em (A). Os fórceps do relojoeiro são usados para retirar suavemente a membrana de Descemet do estroma subjacente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Procedimento para estabelecer e expandir culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de membrana endotelio/Descemet. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Imagens representativas de contraste de fase das culturas celulares endoteliais durante o estabelecimento inicial de explantas de endotelio de ovelha córnea/membrana de Descemet. (A)Uma ovelha endotelio/membrana descemet explante após 3 dias na cultura. As células endoteliais da córnea começaram a migrar para a placa. (B)Uma cultura explante ovelha após 1 semana. A explanta é cercada por uma folha de células confluentes. (C)Uma cultura explante ovelha após 2 semanas. Células pequenas circundam a explanta, enquanto células maiores estão localizadas mais longe. (D)Uma cultura explante ovelha após 6 semanas. Uma região de pequenas células bem embaladas é vista ao lado de uma região de células maiores. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Isolamento de pequenas e bem embaladas células endoteliais córneas humanas para subculturas. (A)A cultura explantária de membrana de córnea humana/Descemet após 7 semanas. Muitas células pequenas e bem embaladas estão presentes ao lado da explanta. (B) Regiões de pequenas células bem embaladas desenvolvem-se em culturas explantais humanas de forma semelhante à observada nas culturas explanteoo. (C) Uma cultura explante humana após a remoção da explanta e após 20 min de exposição ao TrypLE. Células pequenas e bem embaladas mantiveram seu apego à placa, enquanto as células maiores flutuaram para longe. (D)Uma cultura celular endotelial de córnea humana após 1h em Dispase II. A maioria das células se desvinculou da placa como aglomerados flutuantes livres. (E)Uma subcultura celular endotelial humana após 1 dia. As células migraram para fora de aglomerados celulares que estavam isolados da cultura original explant. (F)Uma subcultura celular endotelial humana após 12 dias. As células formaram um monocamada confluente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Localização de proteínas ZO-1 e N-cadherin nas membranas de ovelhas e células endoteliais de córnea humana por imunofluorescência de rotulagem dupla. As culturas explantárias de membrana de ovelhas e córneas humanas foram estabelecidas em revestimentos de vidro revestidos por Fator de Apego e analisados após 4 semanas. Tanto zo-1 (mancha verde) quanto n-cadherin (mancha vermelha) foram detectados nas membranas de ovelhas (A e B) e células endoteliais de córnea humanas(D e E). A análise das imagens mescladas revelou que as duas proteínas eram altamente co-localizadas dentro das culturas (C e F). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Diagrama de uma câmara micro-Boyden mostrada em seção transversal. Nossa câmara micro-Boyden feita medida consiste em uma câmara superior, uma câmara inferior e um anel O. Pode ser usado para suspender qualquer tipo de material membraniano dentro de uma cultura tecidual bem. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 7: O procedimento para montagem de uma membrana biomaterial em uma câmara micro-Boyden para cultura tecidual. (A)O equipamento necessário para este procedimento inclui uma placa de corte de politetrafluoetileno, um par de fórceps, uma trefina de 18 mm de diâmetro, uma câmara micro-Boyden feita medida e uma membrana biomaterial. (B)Use o trephine para socar um disco da membrana biomaterial. (C) Coloque o o-ring na câmara superior do dispositivo de montagem e, em seguida, coloque o disco biomaterial sobre ele. (D) Parafuso a câmara inferior na câmara superior do dispositivo de montagem. (E)A câmara micro-Boyden montada está pronta para ser esterilizada com 70% de etanol. (F) Mergulhe a câmara de microboyden esterilizada no meio de cultura tecidual no poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 8: Células endoteliais e estrôquias de ovelhas em lados opostos de uma membrana do tipo I de colágeno. As células foram manchadas com rodamina de faloide para visualizar actin (vermelho) e Hoechst para visualizar núcleos (azul). A membrana do tipo colágeno I não foi manchada e, portanto, não é visível nessas imagens que foram coletadas usando microscopia confocal. (A)Uma baixa ampliação, vista transversal da construção de tecido. Uma fina camada de actin representando uma cultura celular endotelial córnea é visível na superfície superior da membrana, e uma camada mais espessa de actin representando uma cultura celular estrôtera está presente na superfície inferior da membrana. Núcleos azuis não são mostrados nesta imagem. (B) En face view da camada de célula endotelial córnea mostrando tanto a tona quanto a coloração de núcleos. (C) En face view da camada de células estromal córnea mostrando tanto atonina quanto a coloração de núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Um desafio técnico significativo associado ao estabelecimento e à expansão das células endoteliais da córnea humana está impedindo que a EMT ocorra nas culturas. A EMT pode ser acionada em células endoteliais da córnea por perda de contato celular-célula, mas a maioria dos protocolos de cultura celular para essas células envolvem dissociação enzimática a células únicas durante o isolamento e subcultura10. Aqui apresentamos um protocolo alternativo de cultura celular para células endoteliais da córnea que minimiza o risco de as células perderem contato entre si durante as fases de isolamento e subcultura.
Nosso método para estabelecer culturas de células endoteliais da córnea envolve colocar explantas de membrana de endotelio/Descemet de córneas doadoras em placas de cultura tecidual em condições que permitem que as células migrem coletivamente das membranas e para as placas. Para que isso seja bem sucedido, a explanta deve formar um apego apertado à placa de cultura do tecido, e isso é melhor alcançado por não perturbar a placa por vários dias após a configuração das culturas. Outro fator crítico no estabelecimento bem sucedido de culturas de células endoteliais da córnea dos seres humanos é a idade do doador. Taxas de sucesso mais altas tendem a ser alcançadas a partir de doadores com menos de 30 anos de idade.
A desvantagem de usar o método de cultura explante para estabelecer culturas de células endoteliais córneas é o período relativamente longo que existe entre a criação das culturas e a obtenção de um grande número de células. Os chamados métodos de "peel-and-digest" envolvem a retirada do endotelio das córneas doadoras e digeri-lo com enzimas para liberar as células para a cultura11. Esses tipos de métodos produziriam culturas contendo mais células inicialmente do que aquelas estabelecidas a partir de explantas.
Nosso método de cultura explante para células endoteliais da córnea produz culturas que contêm células muito pequenas, compactas e maduras de alta qualidade. No entanto, as culturas também contêm células maiores e menos ideais em direção à periferia da placa. As células maiores podem ser removidas por digestão com o TrypLE e descartadas se desejarem, mas isso reduz o número de células disponíveis para subcultura. No entanto, explantas que iniciaram com sucesso culturas celulares primárias são quase sempre capazes de iniciar novas culturas celulares, e essa capacidade pode ser explorada para obter um grande número de células de alta qualidade.
Nosso método de subcultura para células endoteliais da córnea envolve o uso de Dispase II para levantar suavemente aglomerados celulares da placa de cultura do tecido para transferência para placas frescas, e embora este método seja projetado para minimizar a possibilidade de EMT ocorrer em passagens células, deve-se notar que não reduz o risco a zero.
Tem sido o objetivo de muitos grupos desenvolver camadas de células endoteliais projetadas por tecido para fins de transplante. Muitos materiais diferentes foram experimentados como portadores para as células e uma variedade de métodos diferentes têm sido usados para conter o material de se mover na placa de cultura durante a cultura celular. A maioria dos métodos envolve ancorar o material na superfície da placa de cultura do tecido de alguma forma, restringindo o crescimento celular apenas à superfície superior da membrana. Embora esses métodos pudessem ser usados para produzir camadas únicas de endotelio córnea projetado por tecido que seriam equivalentes aos enxertos de membrana/endotelio/descemet (enxertos DMEK), eles não poderiam ser usados para produzir equivalentes projetados por tecido dos enxertos de membrana/estrônosima do endotelio/estromano (enxertos DSEK ou DSAEK) que são mais comumente usados pelos cirurgiões atualmente. Desenvolvemos, portanto, um dispositivo de montagem de membrana chamado uma câmara micro-Boyden que permite que as células sejam cultivadas simultaneamente em ambas as superfícies de uma membrana biomaterial suspensa, e o usamos para produzir enxertos projetados por tecido que consistem em células endoteliais da córnea e células estrôquias córneas em superfícies opostas de membranas do tipo Colágeno I. Estes enxertos de duas camadas projetadas por tecido poderiam potencialmente ser usados para substituir enxertos derivados de córnea doador de endotelo e tecido estrônio em ambos os lados da membrana de Descemet (enxertos DSEK ou DSAEK).
Em resumo, os métodos apresentados neste artigo são projetados para aqueles que desejam obter células endoteliais endoteliais primárias de alta qualidade para uso em estudos de engenharia de tecidos. Métodos de cultura suaves são descritos que são projetados para reduzir o risco das células submetidas ao EMT e um método para o cultivo das células em membranas biomateriais suspensas é apresentado. Esperamos que esses métodos possam ajudar outros em direção aos seus objetivos de produzir transplantes de endotelio projetados por tecidos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Obrigado a Noémie Gallorini por sua ajuda durante a preparação da Figura 7. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do projeto concedida à DH pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (Project Grant 1099922), e por fundos suplementares recebidos da Fundação Queensland Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
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- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S.
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K.
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
