Summary
Этот протокол представляет собой надежную, воспроизводимую модель васкуляризированного композитного аллотрансплантататата (VCA), направленную на одновременное изучение иммунологии и функционального восстановления. Время, вложенное в дотошную технику в правой задней конечности задняя ортопедическая трансплантация с сшитыми сосудистой анастомозой и нервной коапптации дает возможность изучения функционального восстановления.
Abstract
Пересадка конечностей, в частности, и васкуляризированные композитные аллотрансплантации (VCA) в целом имеют широкие терапевтические перспективы, которые были загнаны в тупик нынешних ограничений в иммуносупрессии и функционального нейромоторного восстановления. Многие модели животных были разработаны для изучения уникальных особенностей VCA, но здесь мы представляем надежную воспроизводимую модель ортопедической пересадки задних конечностей у крыс, предназначенных для одновременного исследования обоих аспектов текущего ограничения VCA: стратегии иммуносупрессии и функционального нейромоторного восстановления. В основе модели лежит приверженность тщательной, проверенной временем микрохирургических методов, таких как сшитые вручную сосудистые анастомозы и сшитые вручную нейронные коапптации бедренного нерва и седалищного нерва. Такой подход дает прочные реконструкции конечностей, которые позволяют дольше жить животных, способных реабилитации, возобновление повседневной деятельности, и функциональное тестирование. При кратковременном лечении обычных иммуносупрессивных средств, аллотрансплантированные животные выжили до 70 дней после трансплантации, и изотрансплантированные животные обеспечивают длительный контроль за 200 дней после оперативного. Доказательства неврологического функционального восстановления присутствуют через 30 дней после оперативного. Эта модель не только предоставляет полезную платформу для допроса иммунологических вопросов, уникальных для VCA и регенерации нервов, но и позволяет in vivo тестирования новых терапевтических стратегий, специально предназначенных для VCA.
Introduction
Пересадка конечностей в более широкой категории васкуляризированного композитного аллотрансплантатата (VCA) или композитного аллотрансплантатата (CTA) до сих пор не выполнила свои терапевтические перспективы. С момента первой успешной пересадки рук человека в Лионе, Франция и Луисвилле, штат Кентукки в 1998 и 1999 годах, более 100 верхних конечностей трансплантации были выполнены во всем мире в тщательно отобранных пациентов1. Более широкая применимость была загнана в тупик из-за существенного иммуносупрессии и ограниченного функционального нейромотора восстановления. Текущие стратегии иммуносупрессии приводят к 85% заболеваемости острым отторжением в лице 77% заболеваемости оппортунистической инфекцией2. С другой стороны, происходит функциональное восстановление после пересадки руки; средний инвалидность руки плеча и руки (DASH) оценки улучшить от 71 до 43, но этот уровень функции все еще может квалифицироваться как инвалидность2. Учитывая нежизне сохранение природы пересадки конечностей, современные методы должны быть уточнены в животных моделях, чтобы сделать следующий шаг в VCA.
С первой крысиной модели пересадки конечностей в 19783, многие инновационные модели животных были разработаны для продвижения области VCA4, включая сосудистые наручники анастомозы, чтобы свести к минимуму оперативное время5,6, гетеро утопические остеомиоккутанные трансплантации, чтобы свести к минимуму физиологическое оскорбление реципиента животных7,8,9,10,11, и новые иммунологические подходы7,12,13,14. Крыса модель ортотопных правой задней конечности середине бедра трансплантации представлены здесь подчеркивает тщательно, проверенные временем микрохирургические методы, такие как руки сшиты сосудистые анастомозы и нервной коапптации в качестве авансового инвестирования в надежной, воспроизводимой модели платформы одновременно исследовать оба аспекта текущего ограничения VCA: стратегии иммунодепрессиции и функционального нейромоторного восстановления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (NIH) и были одобрены Северо-Западным университетом по уходу и использованию животных. Конкретные процедуры выполнялись в соответствии с протоколом IS00001663.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два штамма крыс были использованы, Льюис крыс и август Копенгаген х ирландский (ACI) крыс. Звери были разделены на три группы лечения: аллотрансплант без подавления иммунитета (ACI Льюис), аллотрансплант с обычным подавлением иммунной системы (ACI к Льюису), и изотрансплант (Льюис Льюис или ACI к ACI). Льюис является инбредным штаммом, в то время как крысы ACI представляют собой выведенный дикий тип, поэтому эта комбинация была выбрана для моделирования хуже случае отказ ответ. Обычный иммуносупрессионный вводили подкожно либо как рапамицин 1 мг/кг от послеоперационного дня (POD) минус 1 до POD 28 или как FK506 3 мг/кг от POD 0 до POD 14, а затем один раз в неделю после этого. Как мужчины, так и самки крыс имели право получателей от 8 до 16 недель, весом от 250 до 400 граммов на момент операции.
1. Донор правой задней конечности урожая
- Индуцировать общую анестезию с 5% изофлуран в чистом кислороде через испаритель с соответствующей системой очистки.
- Подтвердите адекватную глубину анестезии с ног щепотку, а затем использовать ножницы для волос, чтобы обрезать мех от правой задней конечности и правой пах хирургического сайта
- Вниз-титра изофлурана через конус носа грызунов до 2-2,5%.
- Позиция крысы на спине с распространением конечностей лентой в стороны на операционной доске с грелкой под ним. Дезинфицировать лысую кожу 70% спиртом и защитить хирургическое поле стерильной марлей.
- Используя соответствующий микрохирургический микроскоп, микрохирургические инструменты, и с легким доступом к биполярной и монополярной электрокаутерии, начать вскрытие.
- Используйте ножницы, чтобы сделать окружной кожи / подкожной ткани разрез вокруг правой задней. Начните с паховой складки medially примерно на том же уровне, как паховая связка и продлить спинной-поздней для завершения окружного разреза.
- Вскрыв мышечного слоя непосредственно под разрезом, вскрыть и прижигать поверхностные эпигастральные сосуды, которые ведут от мышечного слоя к проксимальной кожи / подкожный лоскут только что созданный.
- Отражение проксимального лоскута сверхсолодово к паховой связки и дистальной кожи / подкожный лоскут inferolaterally к колену.
- Используйте провод втягиватель или проката марли, чтобы помочь разоблачить поле.
- Обратите внимание, что паховая анатомия крысы похожа на человека; от боковой до медиальной лежат нерв, артерии и вены.
- Вскрыть бедренный нерв, резко разделить его на паховой связки, проксимальной к бифуркации, если это возможно. Втягивайе разделенный нерв неполноценно, сохраняя его безопасно в сторону, покрытые под влажной марлей.
- Обращая внимание на бедренную артерию и вену, используйте 4 см 7-0 шелковых связей, чтобы атрауматически втягивать сосуды вместо того, чтобы обращаться с ними напрямую.
- Ligate все ветви бедренных сосудов, как они возникают с 7-0 шелковых связей; разделить ветви между узами. Для очень небольших ветвей, биполярное прижигания могут быть использованы вместо связей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Артериальные и венозные ветви, которые требуют деления включают поверхностные кругосветные подвздошные и мышечные сосуды. Поверхностный окружной подвздошный, как правило, самый большой и, кажется, нырять глубоко, как бы промунда бедренной жизни у людей, но промунда отсутствует в крысы15. Более дистальные ветви бедренных сосудов, такие как высший геникулярный и saphenous ветви, как правило, не требуют разделения. - Системно впрыскивают 500 международных единиц гепарина через вену полового члена у мужского донора крысы. Используйте поверхностные эпигастрические вены, если донорская крыса самка.
- Разрешить гепарин циркулировать системно в течение 2 минут, прежде чем приступить к следующим шагам.
- Ligate бедренной артерии с 7-0 шелковых связей, как проксимальные к паховой связки, как это возможно и разделить между связями.
- Как и в артерии, ligate и разделить бедренную вену.
- Отражение как артерии и вены неполноценно, безопасно в сторону, покрытые под влажной марлей вместе с бедренным нервом покрыты ранее. Рассекайте группы мышц брюшной мышцы, заботясь о прижигать любой видимый сосуд, который возникает. Внимание к гемостазу здесь сведет к минимуму потерю крови реципиента после реперфузии.
- Глубоко к вентральной групп мышцы, определить и резко разделить седалищный нерв проксимальный его ветвей. Обычно видны три седалищные ветви: тибиальные, перонеальные и суровые. Все три должны быть сохранены в конечности донора. Четвертая кожная ветвь обычно не видна в этом вскрытии15,16.
- Закончить деление оставшихся вентраальных и спинных групп мышц на уровне среднего бедра с дотошным гемостазом. Это может быть необходимо втягивать конечности medially для полного деления мышц.
- Переток бедренной кости в середине валы с помощью ручной беспроводной вращающейся пилы.
- Сняв прививку конечностей у донора, срежьте шелковые связанные концы с прививочной стороны бедренной артерии и пней вены, тем самым вновь открыв сосуды.
- Вставьте 24-калиберный ангиокэтетер в пень трансплантата и промойте трансплантат с 250 международными единицами гепарина, разбавленного в 5 мл ледяного нормального солевого раствора, наблюдая, как он вытекает ясно через открытую вену.
- Медленно, осторожно промыть трансплантата в течение примерно 3 минут. Избыток силового промывки может повредить эндотелий.
- Поместите трансплантат в охлажденное солевое блюдо, вложенное в ведро со льдом до трансплантации.
- Euthanize крысы-донора с двусторонней торакотомии.
- Очистите все хирургические инструменты надлежащим образом.
2. Получатель родной правой ампутации задней конечности
- Индуцировать анестезию с изофлуран на 5%, подтвердить глубину, обрезать мех, положение животного, и дезинфицировать кожу с алкоголем, как описано для донорской крысы.
- Изофлуран до 2-2,5% и введение подкожной предоперационной анальгезии с бупренорфином 1,2 мг/кг, а также предоперационной профилактикой с энрофлоксацином 7,5 мг/кг.
- То же самое, что и для донора, сделать окружной разрез в паховой складке, отражают кожные лоскуты, обеспечивающие гемостаз, и вскрыть бедренный нерв, артерию и вену, перевязыв те же ветви сосудов, что и выше.
- Разделите бедренный нерв более distally чем для дарителя, но proximally к бифуркации if возможные.
- Вскрыть бедренной артерии и вены с достаточным пространством, чтобы зажать каждый отдельно на уровне паховой связки. Зажмите вену и артерию микрохирургическими зажимами бульдога. После зажима, разделить каждый сосуд резко ножницами.
- Разделите брюшной и спинной мышцы бедра в середине бедра уровне с тщательного гемостаза, втягивая конечности medially по мере необходимости.
- Определить и разделить седалищные нервы проксимальные их точки ветви, как указано выше.
- Перетектору бедренной кости в середине валы с помощью пилы.
- Удалите получателя родной правой задней конечности и распоряжаться соответствующим образом.
- Вниз-титра изофлурана до 1-1,5% через нос конуса.
3. Донор имплантации конечностей-реципиентов
- Используя ручную пилу питания, сбрить любые нарушения как от донора и реципиента бедренной кости вырезать концы.
- Используя пилу, отрежьте конец концентратора 18-калиберной иглы, которая станет бедренной костью интрамедуллярного стержня.
- Перед манипулированием кости, применять небольшое количество костного воска для получателя сократить конце бедренной кости, чтобы уменьшить кровотечение костного мозга во время процесса повторного ния.
- Coapt донора и реципиента бедренных костей с помощью 18-калиберной иглы в качестве интрамедуллярного стержня. Некоторая сила необходима, но не ream ни кости до тех пор, чтобы перелом коры.
- По мере необходимости, удалить иглу и обрезать его до соответствующей длины, так что обе кости плавно вписываются над иглой без иглы, показывая между костью.
- Поместите небольшую поддержку, такую как подушечка марли или небольшой камень или моделирование глины под донорской конечности, чтобы держать его от напряжения.
- Reapproximate группы мышц вентральной мышцы с 8 до 10 простых прерванных 5-0 полиглактиновых швов, так что трансплантат не вращается вокруг иглы бедренной кости. Это придает конечности стабильность анастомозы.
- Периодически орошать трансплантат и хирургическое поле с ледяной солевой раствор для лучшей визуализации и уменьшить теплую ишемическую травму реперфузии.
- Выровнять донора и реципиента бедренных артерий и anastomose их в конце до конца моды с помощью простых прерванных 10-0 нейлоновых швов, избегая как напряжения и петли. Артерия требует в среднем шесть швов.
- Как и в артерии, anastomose донора и реципиента бедренных вен в конце до конца моды. Вену требуется от шести до восьми швов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Великое холодное соленое орошение, атрауматический метод обработки судов, и оставляя длинные хвосты, чтобы служить в качестве шов пребывания для втягивания судна являются важными инструментами для эффективного микрохирургических анастомоз. - Поместите небольшое количество гемостатического порошка целлюлозы вокруг обоих анастомозов, а затем удалить проксимальные микрохирургические зажимы бульдога на вену и артерию.
- Осмотрите как анастомозы для хорошей проходимости и потока. Используйте ватные тампоны палочки, чтобы мягко подтолкнуть вены и обеспечить хороший гемостоз обоих анастомозов. Держите давление над кровотечением сайтов и место более гемостатической целлюлозы порошок, если это необходимо. Другой шов может быть помещен через отверстие кровотечения на риск "обратно стены" иглы только в крайнем случае.
- Когда оба анастомозы подтверждены удовлетворительным, обрезать любые оставшиеся длинные хвосты пребывания шов короткий, чтобы соответствовать другим.
- Перепоместите крысу в левое боковое положение декубита, используйте либеральную электрокаутерию для достижения тщательного гемостаза любого реперфузиого мышечного кровотечения.
- Обратить внимание на нерв анастомозы, как только мышечный гемостаз гарантировано. Обрезать обратно любые нервные концы, которые появляются оборванные.
- Reapproximate спинной группы мышц под седалищный нерв с простым прерван 5-0 полиглактин швы.
- Проницать седалищный нерв. Восемь до десяти 10-0 нейлоновых нейронных простых прерванных швов, как правило, достаточно.
- Проницайте напоминающие спинные группы мышц, а затем закройте спинную кожу 4-0 полиглактином непрерывным швом.
- Перепоместить крысу обратно в положение на спине и повторное повреждение бедренного нерва. Два-три 10-0 нейлоновых нейронных простых прерванных швов, как правило, достаточно.
- Закройте желудочковую кожу 4-0 полиглактином непрерывным швом. Избегайте избыточного хвоста шва, который может раздражать крысу после пробуждения.
4. Послеоперационный уход
- Восстановить животных в клетках с грелкой под клеткой и готовый доступ к пище и воде, мониторинг ранних осложнений ежедневно в течение первой недели.
- Обеспечить послеоперационную анальгезию с подкожным мелоксикам 1 мг/кг ежедневной инъекции через POD 2. Обеспечить послеоперационную антибиотикопрофилактицию разбавленного энрофлоксацина спрей. Обеспечить сдерживающий стимул для аутотомии (самоувечья) с Горьким Безопасный Туман распыляется два раза в день, чтобы трансплантат через POD 7.
- Поддерживайте пересаженных крыс в клетках с другими крысами, чтобы стимулировать возвращение к повседневной деятельности и реабилитировать пересаженных конечностей.
5. Послеоперационное тестирование сенсаций
- Применить Hargreaves тестирования тепловой протокол ощущения, также описано в другом месте17,18.
- Поместите крысу в испытательный контейнер и дать ей акклиматизироваться в течение 20 минут. Стекло аппарата подтверждено чистым, а источник тепла подтвердил, что работает с пальцем следователя.
- Перед тестированием подтвердите, что крыса не спит и проверенная лапа расположена над инфракрасным детектором движения.
- Передача тепловой энергии на уровне интенсивности 90. Зафиксирована задержка времени в том, чтобы животное отодвигает лапу от источника тепла. Если движение не происходит в течение 20 секунд, тест прерывается, чтобы предотвратить травму.
- Получить пять испытаний на испытания конечности, за исключением самого высокого и самого низкого значения, прежде чем вычислить среднее время задержки вывода для каждого животного.
6. Послеоперационное моторное тестирование
- Используя беговую дорожку для анализа походки и интегрированную платформу анализа программного обеспечения, выберите кандидатов для тестирования беговой дорожки в течение четырех-шести недель после операции.
- Обрезать все крысы ногти один или два дня до тестирования.
- Акклиматизировать животных в испытательный зал в течение одного часа перед тестированием, и позволяют в течение одной минуты предварительного испытания ласки, чтобы успокоить беспокойство.
- Размещая крысу внутри беговой дорожки, бегите на беговой дорожке при испытаниях увеличения скорости, от 10 см/с, до 14 см/с, к цели 18 см/с. Если крыса сдержана и не может быть уговорен ходить, прервать тестирование в тот день, чтобы избежать негативных кондиционирования. Разрешить высоким исполнителям ходить до 24 см / с.
- Промыть аппарат беговой дорожки с 70% этанола между проверенными животными.
- Параметры Gait — это выход из несвободных программ платформы анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выживание и восстановление зависят от тщательной хирургической техники. Внимание к сосудистым анастомозы и нервных анастомозов, а также костной коапптации, как описано выше, имеет решающее значение для максимизации успеха этой модели. Оперативный дизайн и репрезентативные анастомотические результаты показаны на рисунке 1.
Общая смертность зависела от стратегии иммуносупрессии, при этом большинство изотрансплантированных животных достигали конечной точки исследования 100-200 послеоперационных дней, как показано на рисунке 2. Выйдя из острого послеоперационного окна, обработанные аллотрансплантированные животные могли выжить до 58 послеоперационных дней. Isografted крысы жили на неопределенный срок в течение исследования в то время как аллотрансплантат пересаженных крыс были переменные смертности от рапамицина и FK506. Из лечения FK506 способствовали самой длинной жизнеспособности (день 57), в то время как рапамицин был вторым лучшим (день 20) над необработанным контроля (день 10).
Сенсорное и восстановление двигателя может быть показано на рисунке 3. Было показано, что животные восстановили функцию сенсорного нерва пересаженных лап с помощью аппарата Hargreaves к 30-му дню. Через четыре недели после операции животные показали значительное выздоровление (Aii). На животных были показаны заметные улучшения двигательной функции пересаженных конечностей с помощью беговой дорожки для анализа походки и интегрированной платформы анализа программного обеспечения. Пример походки параметр на основе конкретных конечностей показаны (Bii) и Исвашийский индекс функции (SFI) также представлены (Biii).
Рисунок 1: Оперативный дизайн изображен в формате мультфильма. (A) Крыса показана с (B) правая задняя нога поперечного сечения с изображением (i) бедренной кости (нерв, артерия и вена) (ii) седалищного нерва, и (iii) кости. (C) Представитель микрографы из операционного микроскопа (донор слева и реципиент справа) были приняты из (i) седалищного нерва анастомоз (ii) бедренной нервной артерии, и анастомозы вены (показано сверху вниз), и (iii) 18-калиберной иглы интрамедуллярной род-бедренной кости костных коапптации. Обратите внимание, что структуры доноров отображаются слева на каждой фотографии. Также обратите внимание, бедренная кость показана перед полной коапптации, когда обе кости против и игла скрыта внутри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Процент выживания животных, как представлены дней после операции (POD). Группы показано включают изотранс, аллотрансплантатов без лечения, рапамицин, и FK506 иммунодепрессантов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Восстановление сенсорного нерва демонстрируется в (A) Hargreaves тестирования пересаженных животных каждый в шести послеоперационных точек времени и в (B) еще выстрел беговой дорожке тестирования с использованием DigiGait. i) репрезентативные изображения отображаются с данными (ii) соответствующих лап. Соответствующие цветные изображения лап также находятся в кадрах 0,025 мс. Также показаны модели Digigate (iii). Значение было определено с помощью одностороннего ANOVA с многократным тестом сравнения Bonferroni и SEM, где nNo 7 и pq lt; 0.05. Эти данные DigiGait были взяты из изгенеического животного, протестированного в послеоперационный день 28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трансплантация конечностей, под более широкой категорией сосудистого компонента аллотрансплантации (VCA), широко применяется терапевтические перспективы до сих пор невыполненными. Основные препятствия лежат в нерешенных иммунологических вопросов, уникальных для VCA и нейромоторных методов восстановления, используемых в настоящее время. Разработка новых методов будет зависеть от моделирования животных, которое является гибким, надежным и воспроизводимым.
Многие модели животных были созданы в VCA, каждый с особыми преимуществами4. Нечеловеческие модели приматов предлагают привлекательную переводимость для пациентов, но были затруднены из-за проблем с расходами и токсичных уровней иммуносупрессии требуется4. Собака модели были замечены как выгодно для конкретных сходств мышечной структуры, как люди, а также более опытные иммунной системы19,20. Модели свинины предлагают преимущества большой модели животных, где иммунная система все более хорошо изучены21,22. Мыши модели системы представляют самые передовые методы для изучения иммунологии, но, несмотря на важные достижения в манжеты сосудистой микрохирургической анастомоз23, пересадка конечностей мыши остается технически сложной и имеет некоторые ограничения в функциональной оценки восстановления5,24,25,26.
Крыса модели в VCA были использованы с 19783, обеспечивая зрелые платформы для изучения иммунологических и нейромоторных гипотез6,9,13,14,17,27,28,38. Модель здесь сочетает в себе преимущества заднего ортотопного подхода, шов анастомоза, нерва повторного приближения, и потенциал для анализа походки. Hindlimb ортотопных в отличие от трансплантации передних конечностей меньше обременение крысы во время процесса восстановления и позволяет продолжать нормальный уход и кормления поведения после оперативно. Шов анастомоз, хотя кропотливый потенциально может предложить меньше технических путаницы для долгосрочных исследований. Нервное повторное приближение позволяет в будущем расследование17,18 и походка анализа. Этот протокол опирается на тщательные, проверенные временем микрохирургические методы хорошо описаны в другом месте29, требуя постоянного внимания, чтобы избежать непосредственных ловушек анестезии передозировки, анастомотическая недостаточность, анастомотический тромбоз, и чрезмерная хирургическая кровопотеря. Хотя несколько микрохирургов могут улучшить рабочий процесс, мы описали метод, с помощью которого один действующий микрохирург может достичь достаточного экспериментального результата.
Аутотомия или членовредительства было явление, отмеченное в нескольких микрохирургических моделей, и было высказано предположение, чтобы обратно коррелировать с нервным исцелением30,31. Аутотомия была в целом контролируется в этой модели, возможно, связанные дотошные нейронные анастомотические техники. Аутотомия также уменьшилась дальше в кривой обучения. Горький безопасный туман был ценным дополнением в борьбе с этим явлением.
Анализ gait в крысах был изучен для множественных моделей ушиба32,,33,,34, наиболее уместно для ушиба нерва седалищной35,,36. Крысы, даже если не конечности трансплантации получателей, как известно, неоднородные предметы для анализа походки, и следователи до сих пор спорят, какие параметры анализа описывают восстановление37. В этой модели мы описали несколько методов получения наилучших данных от пересаженных реципиентов, которые готовы и умеют ходить. Предварительный отбор адекватных ходоков не предвещал послеоперационного сотрудничества. Хотя животные могут передвигаться по месту их проживания, как только через несколько часов после операции, они не готовы к амбуляции беговой дорожки, по крайней мере, через четыре-шесть недель после операции.
Способность протокола измерять восстановление нервов в VCA зависит от его стратегии реабилитации. Этот протокол явно способствует трансплантации получателей взаимодействующих с другими крысами, как стимул к функции. Эта стратегия осознает важность моделирования реабилитации, но является простым, экономичным, и в значительной степени стандартным. Будущие стратегии могут включать более активную реабилитацию, такую как обучение беговой дорожке.
Иммунологические методы, применимые к этой модели, выходят за рамки этой дискуссии, но, в частности, сравнение изотрансплантата против аллотрансплантированных животных обеспечивает полезный контроль для дифференцирования иммунологических явлений аллотранспланта и отторжения от ишемической реперфузии, воспаления, реваскуляризации и послеоперационных процессов инфекции, присущих самой трансплантационной хирургии. Изотранспланты обеспечивают аналогичный контроль для исследования функции нерва по той же причине.
Используя эту платформу, исследователи могут быть в состоянии продвинуть как VCA иммунологии и нейромотор восстановления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Фондом Франкеля и Северо-Западной мемориальной больницей Маккормик Грант (Операция RESTORE). Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером T32GM008152. Эта работа была поддержана Северо-Западного университета микрохирургии ядро и поведенческие фенотипирования ядра.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al.
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
