Summary
Detta protokoll presenterar en robust, reproducerbara modell av vascularized komposit allotransplant (VCA) inriktad mot samtidig studie av immunologi och funktionella återvinning. Tiden investerat i noggrann teknik i en rätt mitten av låret hind lem orthotopic transplantation med hand sydda vaskulär anastomoss och neurala coaptation ger förmåga att studera funktionella återhämtning.
Abstract
Lem transplantation i synnerhet och vascularized sammansatta allotransplant (VCA) i allmänhet har breda terapeutiska löfte som har varit stymied av nuvarande begränsningar i immunsuppression och funktionella neuromotor återvinning. Många djurmodeller har utvecklats för att studera unika funktioner i VCA, men här presenterar vi en robust reproducerbar modell av orthotopic hind limb transplantation i råttor som syftar till att samtidigt undersöka båda aspekterna av nuvarande VCA begränsning: immunosuppression strategier och funktionell neuromotor återhämtning. Kärnan i modellen vilar ett engagemang för noggranna, tidstestade mikrokirurgiska tekniker som handsydda vaskulära anastomoser och handsydda neurala coaptation av lårbensnerven och den sciatic nerven. Detta tillvägagångssätt ger hållbara lem rekonstruktioner som möjliggör längre livslängd djur som kan rehabilitering, återupptagande av dagliga aktiviteter, och funktionella tester. Med kortvarig behandling av konventionella immunsuppressiva medel överlevde allotransplanted djur upp till 70 dagar efter transplantation, och isotransplanted djur ger långlivade kontroller utöver 200 dagar post-operatively. Bevis på neurologiska funktionella återhämtning är närvarande med 30 dagar post operativt. Denna modell ger inte bara en användbar plattform för att förhöra immunologiska frågor som är unika för VCA och nervregenerering, men möjliggör också in vivo-testning av nya terapeutiska strategier som är särskilt skräddarsydda för VCA.
Introduction
Lem transplantation under den bredare kategorin vascularized-komposit allotransplant (VCA) eller sammansatt vävnad allotransplant (CTA) har ännu inte uppfyllt sitt terapeutiska löfte. Sedan den första framgångsrika mänskliga hand transplantationer i Lyon, Frankrike och Louisville, Kentucky 1998 och 1999, över 100 övre änden transplantationer har utförts över hela världen i noggrant utvalda patienter1. Bredare tillämplighet har stymied av betydande immunsuppression och begränsad funktionella neuromotor återvinning. Nuvarande immunsuppressionsstrategier resulterar i 85% incidens av akut avstötning inför 77% incidens av opportunistisk infektion2. Å andra sidan sker funktionell återhämtning efter handtransplantation; menar Funktionshinder av Arm Shoulder och Hand (DASH) poäng förbättras från 71 till 43, men att nivån på funktionen kan fortfarande kvalificera sig som ett funktionshinder2. Med tanke på nonlife spara karaktär lem transplantation, måste nuvarande tekniker förfinas i djurmodeller för att ta nästa steg i VCA.
Sedan den första råtta modell av lem transplantation i 19783, många innovativa djurmodeller har utvecklats för att föra området VCA4, införlivar vaskulär manschettskyddad anastomoser för att minimera operativ tid5,6, heterotopic osteomyocutaneous transplantationer för att minimera physiologic förolämpning till mottagaren djuret7,8,9,10,11, och nya immunologiska metoder7,12,13,14.10 Råttan modell av orthotopic rätt bakbenen mitten av låret transplantation presenteras här betonar noggranna, tidsprövade microsurgical tekniker såsom hand sydda vaskulär anastomoss och neurala coaptation som en upfront investering i en robust, reproducerbara modell plattform för att samtidigt undersöka båda aspekterna av nuvarande VCA begränsning: immunsuppression strategier och funktionella neuromotor återvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health (NIH) och godkändes av Northwestern University Animal Care and Use Committee. De specifika procedurerna utfördes enligt protokollet IS00001663.
OBS: Två stammar av råttor användes, Lewis råttor och augusti Köpenhamn x irländska (ACI) råttor. Djur delades in i tre behandlingsgrupper: allotransplant utan immunsupprbildning (ACI till Lewis), allotransplant med konventionell immunsupprbildning (ACI till Lewis) och isotransplant (Lewis till Lewis eller ACI till ACI). Lewis är en inavlad stam, medan ACI råttor representerar en ut-uppfödda vild-typ, därför denna kombination valdes för att modellera sämre fall avslag svar. Konventionella immunosuppression administrerades subkutant antingen som rapamycin 1 mg/kg från post-operativ dag (POD) minus 1 till POD 28 eller som FK506 3 mg/kg från POD 0 till POD 14, och sedan en gång i veckan därefter. Både han- och honråttor var berättigade mottagare från 8 till 16 veckor gamla, som vägde mellan 250 och 400 gram vid tidpunkten för operationen.
1. Givare rätt bakben skörd
- Inducera narkos med 5% isofluran i rent syre genom en spridare med ett lämpligt rensningssystem.
- Bekräfta tillräckligt djup anestesi med tå nypa, och sedan använda hårklippningsmaskiner för att trimma pälsen bort av den högra bakbenen och höger ljumske kirurgisk plats
- Ned-titrera isofluranen genom en gnagare näsa kon till 2-2,5%.
- Placera råttan supine med spridda lemmar tejpade ut på sidorna på en operationsbräda med en värmedyna under. Desinficera den hårlösa huden med 70% gnidningsalkohol och skydda operationsfältet med steril gasbinda.
- Med hjälp av en lämplig mikrokirurgiska mikroskop, mikroskopiska instrument, och med enkel tillgång till bipolär och monopolär elektrocautery, börja dissekering.
- Använd sax för att göra en omständlig hud/subkutan vävnadssnitt runt den högra bakkvisten. Börja i inguinal veck medialt på ungefär samma nivå som inguinal ligament och förlänga dorsala-lateralt att slutföra det omkretsande snittet.
- Efter att ha exponerat det muskulösa lagret direkt under snittet, dissekera och cauterize de ytliga epigastriska kärl som leder från muskulös skikt till den proximala huden/subkutan lock just skapat.
- Reflektera proximala lock superomedially till inguinally ligament och den distala huden/subkutan lock inferolaterally till knäet.
- Använd en tråd upprullningsdon eller rullade gasväv för att hjälpa exponera fältet.
- Observera att råttans inguinal anatomi liknar människor; från lateral till mediala ligga nerven, artär, och ven.
- Dissekera ut lårbensnerven, dela den skarpt vid inguinal ligament, proximala till bifurkation om möjligt. Dra tillbaka den delade nerven underlägset, hålla den säkert ur vägen, täckt under fuktig gasväv.
- Vrida uppmärksamheten till lårbensartären och venen, använd 4 cm 7-0 silkeband för att atraumatically dra tillbaka kärlen istället för att hantera dem direkt.
- Ligate alla grenar av lårbenskärlen som de uppstår med 7-0 sidenband; dela grenarna mellan banden. För mycket små grenar får bipolär cautery användas i stället för slipsar.
OBS: Arteriella och venösa grenar som kräver indelning omfattar den ytliga cirkumflex iliaca och de muskulösa kärlen. Den ytliga cirkumflex iliaca är oftast största och verkar dyka djupt som skulle profunda femorala hos människor, men profunda är frånvarande iråttan 15. Mer distala grenar av lårbenskärlen som den högsta genicular och den saphenous grenen kräver vanligtvis inte uppdelning. - Systemiskt injicera 500 internationella enheter heparin genom penisvenen i en hanråttrånare. Använd den ytliga epigastriska venen om donatorråttan är hona.
- Låt heparin cirkulera systemiskt i 2 min innan du fortsätter med nästa steg.
- Ligate lårbensartären med 7-0 sidenband så proximala till inguinal ligament som möjligt och dela mellan banden.
- Liknar artären, ligate och dela lårbensvenen.
- Reflektera både artär och ven inferiorly, säkert ur vägen, täckt under fuktig gasväv tillsammans med lårbensnerven omfattas tidigare. Dissekera de ventrala muskelgrupperna, var noga med att kauterisera alla synliga kärl som uppstår. Uppmärksamhet på hemostas här kommer att minimera mottagaren blodförlust efter reperfusion.
- Djupt till den ventrala muskelgrupper, identifiera och kraftigt dela den sciatic nerv proximala till dess grenar. Tre sciatic grenar är oftast synliga: tibial, peroneal och sural. Alla tre ska alla bevaras i donatorlemmen. En fjärde testning gren är inte typiskt sett i denna dissekering15,16.
- Avsluta dela de återstående ventrala och dorsala muskelgrupper i mitten av låret nivå med minutiös hemostas. Det kan vara nödvändigt att dra tillbaka lem mediala att slutföra dela musklerna.
- Transect lårbenet vid midshaft med hjälp av en handhållen sladdlös rotersåg.
- Efter att ha tagit bort lemtransplantatet från givaren, skär silke bundna ändarna från transplantatet sidan femorala artär och ven stubbar, och därmed åter öppna kärlen.
- Sätt in en 24-gauge angiocatheter i transplantatartären stubbe och spola ympkvisten med 250 internationella enheter av heparin utspädd i 5 mL iskall normal saltlösning, titta på det rinner ut klart genom den öppnade venen.
- Spola långsamt ympkvisten i ca 3 min. Överflödig kraftfull spolning kan skada endotelet.
- Placera transplantatet i en kyld saltlösning skålen kapslade i en ishink tills transplantation.
- Avliva givaren råtta med bilaterala thoracotomy.
- Rengör alla kirurgiska instrument på lämpligt sätt.
2. Mottagare infödda höger bakben amputation
- Framkalla anestesi med isofluran vid 5%, bekräfta djup, trimma pälsen, placera djuret, och desinficera huden med alkohol enligt beskrivningen för donatorråttan.
- Nedtitrate isofluran till 2-2,5% och injicera subkutan preoperativ analgesi med buprenorfin 1,2 mg/kg, och preoperativ profylax med enrofloxacin 7,5 mg/kg.
- Samma som för givaren, gör en omstärklig snitt i inguinal veck, reflektera hud klaffar försäkra hemostas, och dissekera ut lårbensnerven, artär och ven, ligating samma gren fartyg som ovan.
- Dela lårbensnerven mer distally än för givaren, men proximally till bifurkation om möjligt.
- Dissekera ut lårbensartären och venen med tillräckligt med utrymme för att klämma varje separat på nivån för inguinal ligament. Kläm fast venen och artären med mikrokirurgiska bulldogklämmor. När fastklämd, dela varje kärl skarpt med sax.
- Dela ventrala och ryggmuskulaturen i låret på mitten av låret nivå med minutiös hemostas, indragning av lem medialt vid behov.
- Identifiera och dela upp de sciatic nerver proximala till deras gren punkter som ovan.
- Transect lårbenet vid midshaft med hjälp av sågen.
- Ta bort mottagaren infödda högra bakben och avyttra på lämpligt sätt.
- Nedtitrera isofluranen till 1-1,5% genom noskonen.
3. Givare till mottagare lem implantation
- Med hjälp av handhållen strömsåg, raka bort eventuella oegentligheter från både givare och mottagare lårben skurna ändar.
- Med hjälp av sågen, skär av navänden på en 18-gauge nål, som kommer att bli lårbenet intramedullär stav.
- Innan du manipulerar benet, applicera en liten mängd benvax till mottagaren skära slutet av lårbenet ben för att minska märg blödning under brotschning processen.
- Coapt givaren och mottagaren femorala ben med 18-gauge nål som en intramedullär stav. Viss kraft är nödvändig, men inte ream antingen ben så långt som att bryta cortex.
- Efter behov, ta bort nålen och trimma den till en lämplig längd så att båda benen passar smidigt över nålen utan nål som visar mellan benet.
- Placera ett litet stöd som en pad av gasväv eller en liten sten eller modellering lera under givaren lem för att hålla den utanför spänningen.
- Återproximera de ventrala muskelgrupperna med åtta till tio enkla avbrutna 5-0 polyglactin suturer så att transplantatet inte roterar runt lårbenet nålen. Detta ger lem stabilitet för anastomoses.
- Periodvis bevattna transplantatet och operationsfältet med iskall koksaltlösning för bättre visualisering och för att minska varm ischemisk reperfusionsskada.
- Anpassa givaren och mottagaren femorala artärer och anastomose dem i slutänden mode med hjälp av enkla avbrutna 10-0 nylon sutur, undvika både spänning och looping. Artären kräver i genomsnitt sex suturer.
- Liknar artären, anastomose givaren och mottagaren lårbensvener i till mode. Venen kräver sex till åtta suturer.
OBS: Generös kall saltlösning bevattning, atraumatiska fartyg hanteringsteknik, och lämnar långa svansar att fungera som vistelse suturer för kärlens upprullning är viktiga verktyg för effektiv mikrokirurgiska anastomoser. - Placera en liten mängd hemostatiska cellulosa pulver runt båda anastomoses, och sedan ta bort den proximala microsurgical bulldog klämmor på venen och artären.
- Inspektera båda anastomoses för god patency och flöde. Använd bomullspinnepinnar för att försiktigt prod venen och försäkra god hemostasis av båda anastomoses. Håll trycket över blödningsställen och placera mer hemostatisk cellulosa pulver om det behövs. En annan sutur kan placeras genom ett blödande hål med risk för "back-walling" nålen endast som en sista utväg.
- När båda anastomoses bekräftas tillfredsställande, trimma eventuella återstående lång vistelse sutur svansar kort för att matcha de andra.
- Placera om råttan till vänster laterala deubitus position, använd liberala elektrokauteri för att uppnå noggrann hemostasis av någon reperfusion muskel blödning.
- Vänd uppmärksamheten till nervanastomoser när muskel hemostas är säkrad. Trimma tillbaka alla nervskurna ändar som verkar trasiga.
- Omproximera de dorsala muskelgrupperna under ischiasnerven med enkla avbrutna 5-0 polyglactin suturer.
- Återproximera den sciatic nerven. Åtta till tio 10-0 nylon neurala enkla avbrutna suturer kommer oftast räcka.
- Återproximera de påminnande ryggmuskelgrupperna och stäng sedan dorsala huden med 4-0 polyglactin kontinuerlig sutur.
- Ompositionera råttan tillbaka till ryggposition och reapproximate lårbensnerven. Två till tre 10-0 nylon neurala enkla avbrutna suturer kommer oftast räcka.
- Stäng den ventrala huden med 4-0 polyglactin kontinuerlig sutur. Undvik överskott sutur svans, som kan vara irriterande att råttan en gång vaken.
4. Postoperativ vård
- Återvinna djur i sina burar med en värmedyna under buren och klar tillgång till mat och vatten, övervakning för tidiga komplikationer dagligen för den första veckan.
- Ge postoperativ analgesi med subkutan meloxikam 1 mg/kg daglig injektion genom POD 2. Ge postoperativ antibiotisk profylax späda enrofloxacin spray. Ge avskräckande för autotomi (självstympning) med Bitter Safe Mist sprutas två gånger dagligen till transplantatet genom POD 7.
- Underhåll transplanterade råttor i burar med andra råttor, för att stimulera återgång till dagliga aktiviteter och rehabilitera den transplanterade extremiteten.
5. Testning av känsel efter det operativa
- Tillämpa Hargreaves testning av termisk sensation protokoll, även beskrivs någon annanstans17,18.
- Placera råttan i testbehållaren och tillät den att acklimatisera sig i 20 minuter. Apparatglaset bekräftas rent, och värmekällan bekräftade att arbeta med utredarens finger.
- Innan testning, bekräfta att råttan är vaken och den testade tassen är placerad över den infraröda rörelsedetektorn.
- Överför värmeenergi på intensitetsnivå 90. Tidsfördröjning i djuret som flyttar sin tass bort från värmekällan registreras. Om ingen rörelse sker inom 20 sekunder avbryts testet för att förhindra skador.
- Få fem försök per testad lem, exklusive det högsta och lägsta värdet innan beräkna den genomsnittliga ånger latenstiden för varje djur.
6. Motorprovning efter agenten
- Med hjälp av en gång analys löpband och integrerad programvara analysplattform, välj kandidater för löpband testning på fyra till sex veckor efter operationen.
- Trimma alla råtttglar en eller två dagar före testning.
- Acklimatisera djur till testrummet i en timme före testning, och möjliggöra en minut av pre-test petting till lugn ångest.
- Placera råttan inuti löpbandet, kör löpbandet vid försök av ökande hastighet, från 10 cm/s, till 14 cm/s, till målet 18 cm/s. Om råttan är förtelig och inte kan lirka att gå, avbryta testningen den dagen för att undvika negativ konditionering. Låt högpresterande att gå upp till 24 cm/s.
- Skölj löpbandsapparaten med 70% etanol mellan testade djur.
- Gångparametrar är utdata från analysplattformens egenutvecklade programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överlevnad och återhämtning beror på noggrann kirurgisk teknik. Uppmärksamhet på de vaskulära anastomoserna och de neurala anastomoserna, samt benkoapteringen enligt ovan är avgörande för att maximera framgången för denna modell. Operativ design och representativa anastomotiska resultat visas i figur 1.
Den totala dödligheten var beroende av immunsuppressionsstrategi, där majoriteten av de isotransplanterade djuren uppnådde studieslutpunkten på 100-200 postoperativa dagar enligt figur 2. Väl ut ur det akuta postoperativa fönstret kunde behandlade allotransplanterade djur uppleva överlevnad upp till 58 postoperativa dagar. Isografted råtta bodde idefinitely över jaga av studien, medan allograft transplanterade tjaller hade variabeln mortalitet från rapamycin och FK506. Ut ur behandlingarna FK506 främjade den längsta livskraften (dag 57), medan rapamycin var näst bäst (dag 20) över den obehandlade kontrollen (dag 10).
Sensorisk och motorisk återhämtning kan visas i figur 3. Djur visade sig ha återhämtat sensorisk nerv funktion av den transplanterade tassen med Hargreaves apparaten vid dag 30. Djur uppvisade betydande återhämtning med fyra veckor efter operationen (Aii). Djur visade markanta förbättringar i motorisk funktion av den transplanterade extremiteten med hjälp av en gånganalys löpband och integrerad programvara analysplattform. Exempel gångparameter baserad på specifika lemmar visas (Bii) och en Sciatic Function Index (SFI) presenteras också (Biii).
Bild 1: Operativ design avbildas i tecknad format. (A) Råttan visas med (B) höger bakben tvärsnitt föreställande (i) femorala bunt (nerv, artär, och ven) (ii) ischiasnerven, och (iii) benet. (C) Representativa mikrografer från driftmikroskopet (givaren vänster och mottagare höger) togs av (i) ischiasnerven anastomos (ii) den femorala nervartären, och åderanastomoser (visas uppifrån och ned), och (iii) 18-gauge nål intramedullär stav-lårbensskoth coaptation. Observera att givarstrukturerna visas till vänster i varje foto. Observera också lårbenet visas före full coaptation när båda benen är emot och nålen är dold inom. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Procent överlevnad av djur som presenteras dagar efter operationen (POD). Grupper som visas inkluderar isograft, allografts utan behandling, rapamycin, och FK506 immunsuppressiva läkemedel. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Sensorisk nerv återhämtning visas i (A) Hargreaves testa transplanterade djur vardera vid sex postoperativa tidpunkter och i (B) fortfarande skott av löpband testning med DigiGait. (i) Representativa bilder visas med (ii) respektive tassdata. Respektive färgkodade bilder av tassar finns också i 0,025 ms-ramar. Digigate modeller (iii) visas också. Signifikans fastställdes med hjälp av en enkelriktad ANOVA med ett Bonferronis multipla jämförelsetest och SEM, där n=7 och p< 0.05. Dessa särskilda DigiGait data togs från ett isogent djur testas på postoperativ dag 28. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lem transplantation, under den bredare kategorin vascularized komponent allotransplantation (VCA), har allmänt tillämpliga terapeutiska löfte ännu ouppfyllda. De viktigaste vägspärrarna ligger i olösta immunologiska frågor som är unika för VCA och neuromotoriska återhämtningstekniker som används för närvarande. Utveckling av nya tekniker kommer att bero på djur modellering som är flexibel, robust och reproducerbar.
Många djurmodeller har fastställts i VCA, var och en med specifika fördelar4. Icke-mänskliga primatmodeller erbjuder attraktiv översättningsförmåga till mänskliga patienter, men har hämmats av kostnadsbekymren och toxiska nivåer av immunosuppression krävs4. Hund-modeller har setts som fördelaktigt för specifika likheter med muskulös struktur som människor samt en mer erfaren immunförsvar19,20. Porcine modeller erbjuder fördelarna med en stor djurmodell där immunsystemet är allt väl studerat21,22. Mus modellsystem presentera de mest avancerade tekniker för att studera immunologi, men trots viktiga framsteg i manschetten vaschetten kärl mikrokirurgiska anastomos23, mus lem transplantation förblir tekniskt utmanande och har vissa begränsningar i funktionella återhämtning bedömning5,24,25,26.
Råtta modeller i VCA har utnyttjats sedan 19783, ger en mogen plattform för att undersöka både immunologiska och neuromotoriska hypoteser6,9,13,14,17,27,28,38. Modellen kombinerar här fördelarna med hindlimb orthotopic tillvägagångssätt, sutur anastomos, nerv re-approximation, och potential för gånganalys. Hindlimb orthotopic i motsats till forelimb transplantation är mindre av en belastning på råttan under återhämtningsprocessen och möjliggör fortsatt normala grooming och utfodring beteenden post operativt. Suture anastomos även om mödosamt kan potentiellt erbjuda mindre tekniska confounding för långsiktiga studier. Nerv re-approximation möjliggör framtida undersökning17,18 och gånganalys. Detta protokoll bygger på noggranna, tidstestade mikrokirurgiska tekniker välbeskrivna någonannanstans 29, kräver ständig uppmärksamhet för att undvika de omedelbara fallgropar bedövningsmedel överdos, anastomotic misslyckande, anastomotic trombos, och överdriven kirurgisk blodförlust. Även om flera mikrokirurger kan förbättra arbetsflödet, har vi beskrivit en metod med vilken en enda drifts microsurgeon kan uppnå tillräcklig experimentell output.
Autotomy eller självstympning har varit ett fenomen som noterats i flera mikrokirurgiska modeller, och det har varit en hypotes att omvänt korreleramed nervläkning 30,31. Autotomy var övergripande kontrolleras i denna modell, eventuellt relaterade noggranna neurala anastomotic teknik. Autotomi minskade också längre in i inlärningskurvan. Bitter Safe Mist var ett värdefullt komplement till att kontrollera detta fenomen.
Gånganalys hos råttor har studerats för flera modeller av skada32,33,34, mest relevant för sciatic nervskada35,36. Råttor även när inte lem transplantation mottagare är kända för att vara heterogena ämnen för gånganalys, och utredare fortfarande debatt vilka analysparametrar beskriva återhämtning37. I denna modell har vi beskrivit flera metoder för att få de bästa uppgifterna från transplanterade mottagare som är villiga och kapabla att gå. Preselection av adekvata vandrare var inte förutsägande av postoperativt samarbete. Även om djur kan röra sig om sitt boende så snart som flera timmar efter operationen, de är inte redo för löpband ambulation förrän minst fyra till sex veckor efter operationen.
Ett protokoll förmåga att mäta nerv återhämtning i VCA är beroende av sin strategi för rehabilitering. Detta protokoll främjar uttryckligen transplantation mottagare interagerar med andra råttor som incitament för att fungera. Denna strategi är medveten om vikten av modellering rehabilitering, men är enkel, ekonomisk, och är till stor del standard. Framtida strategier kan omfatta mer aktiv rehabilitering såsom löpband utbildning.
De immunologiska tekniker som gäller för denna modell är utanför ramen för denna diskussion, men i synnerhet, jämföra isotransplanta kontra allotransplanted djur ger en användbar kontroll för att skilja allograft immunologiska fenomen och avstötning från den ischemiska reperfusion skada, inflammation, revascularization och post-surgical infektion processer inneboende i transplantationen kirurgi själv. Isotransplants ger en liknande kontroll för nervfunktionsstudier av samma anledning.
Med hjälp av denna plattform, utredare kan kunna främja både VCA immunologi och neuromotor återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Frankel Foundation och Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operation RESTORE). Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av National Institute of General Medicial Sciences av National Institutes of Health under Award Number T32GM008152. Detta arbete stöddes av Northwestern University Microsurgery Core och Behavioral Phenotyping Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
