Summary
Denne protokollen presenterer en robust, reproduserbar modell av vaskularisert kompositt allotransplant (VCA) rettet mot samtidig studie av immunologi og funksjonell utvinning. Tiden investert i omhyggelig teknikk i en høyre midten av låret baklem ortotopisk transplantasjon med håndsydd vaskulære anastomoser og neural coaptation gir evnen til å studere funksjonell utvinning.
Abstract
Lemtransplantasjon spesielt og vaskularisert kompositt allotransplant (VCA) generelt har bredt terapeutisk løfte som har blitt stymied av gjeldende begrensninger i immunsuppresjon og funksjonell nevromotorisk utvinning. Mange dyremodeller er utviklet for å studere unike egenskaper ved VCA, men her presenterer vi en robust reproduserbar modell av ortotopisk bakbenstransplantasjon hos rotter designet for å samtidig undersøke begge aspektene av gjeldende VCA-begrensning: immunsuppresjonsstrategier og funksjonell nevromotorisk gjenoppretting. Kjernen i modellen hviler en forpliktelse til grundige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker som håndsydd vaskulære anastomoser og håndsydd nevrale coaptation av lårnerven og isjiasnerven. Denne tilnærmingen gir holdbare lemrekonstruksjoner som gjør det mulig for lengre levende dyr som er i stand til rehabilitering, gjenopptakelse av daglige aktiviteter og funksjonell testing. Med kortvarig behandling av konvensjonelle immunsuppressive midler overlevde allotransplantede dyr opptil 70 dager etter transplantasjon, og isotransplanterte dyr gir langvarige kontroller utover 200 dager etter operativt. Bevis på nevrologisk funksjonell gjenoppretting er tilstede innen 30 dager etter operativt. Denne modellen gir ikke bare en nyttig plattform for avhør immunologiske spørsmål som er unike for VCA og nerveregenerering, men gir også mulighet for in vivo-testing av nye terapeutiske strategier spesielt skreddersydd for VCA.
Introduction
Lemtransplantasjon under den bredere kategorien av vaskularisert kompositt allotransplant (VCA) eller komposittvev allotransplant (CTA) har ennå ikke oppfylt sitt terapeutiske løfte. Siden de første vellykkede menneskelige håndtransplantasjoner i Lyon, Frankrike og Louisville, Kentucky i 1998 og 1999, over 100 øvre ekstremiteter transplantasjoner har blitt utført over hele verden i nøye utvalgtepasienter 1. Større anvendelighet har blitt hindret av betydelig immunsuppresjon og begrenset funksjonell nevromotorisk gjenoppretting. Nåværende immunsuppresjonsstrategier resulterer i 85% forekomst av akutt avvisning i møte med 77% forekomst av opportunistisk infeksjon2. På den annen side oppstår funksjonell gjenoppretting etter håndtransplantasjon; gjennomsnittlig funksjonshemming av arm skulder og hånd (DASH) score forbedre fra 71 til 43, men at funksjonsnivået kan fortsatt kvalifisere som enfunksjonshemming 2. Gitt nonlife redde natur lem transplantasjon, gjeldende teknikker må raffineres i dyremodeller for å ta neste skritt i VCA.
Siden den første rottemodellen av lemtransplantasjon i 19783,har mange innovative dyremodeller blitt utviklet for å fremme feltet VCA4, som omfatter vaskulære mansjett anastomoser for å minimere operativ tid5,6, heteroto osteomyokutane transplantasjoner for å minimere fysiologisk fornærmelse mot mottakerdyret7,8,9,,10,,11og nye immunologiske tilnærminger7,12,13,14. Rottemodellen av ortotopiske høyre bakben midt på lårtransplantasjonen som presenteres her, understreker omhyggelige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker som håndsydd vaskulære anastomoser og nevrale coaptation som en forhåndsinvestering i en robust, reproduserbar modellplattform for samtidig å undersøke begge aspektene av gjeldende VCA-begrensning: immunsuppresjonsstrategier og funksjonell nevromotorisk gjenoppretting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health (NIH) og ble godkjent av Northwestern University Animal Care and Use Committee. De spesifikke prosedyrene ble utført under protokollen IS00001663.
MERK: To rotter ble brukt, Lewis rotter og August Copenhagen x Irish (ACI) rotter. Dyr ble delt inn i tre behandlingsgrupper: allotransplant uten immunundertrykkelse (ACI til Lewis), allotransplant med konvensjonell immunsuppresjon (ACI til Lewis), og isotransplant (Lewis til Lewis eller ACI til ACI). Lewis er en innavlet stamme, mens ACI rotter representerer en utavlet vill-type, derfor denne kombinasjonen ble valgt til å modellere verre-case avvisning svar. Konvensjonell immunsuppresjon ble administrert subkutant enten som rapamycin 1 mg/kg fra postoperativ dag (POD) minus 1 til POD 28 eller som FK506 3 mg/kg fra POD 0 til POD 14, og deretter en gang i uken deretter. Både hann- og hunnrotter var kvalifiserte mottakere fra 8 til 16 uker, og veide mellom 250 og 400 gram på operasjonstiden.
1. Donor høyre baklem høst
- Indusere generell anestesi med 5% isofluran i rent oksygen gjennom en fordamper med et passende scavenging system.
- Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi med tåklemme, og bruk deretter hårklippere til å trimme pelsen av høyre bakben og høyre lyskekirurgisk sted
- Nedtiter isofluranen gjennom en gnagernesekegle til 2-2,5%.
- Plasser rotteliggende med spredte lemmer tapet ut til sidene på et operasjonsbrett med en varmepute under. Desinfiser den hårløse huden med 70% rubbing alkohol og beskytt det kirurgiske feltet med steril gasbind.
- Ved hjelp av et passende mikrokirurgisk mikroskop, begynner mikrokirurgiske instrumenter, og med lett tilgang til bipolar og monopolær elektrocautery, disseksjonen.
- Bruk saks for å lage en omkrets hud / subkutan vev snitt rundt høyre bakre klob. Start i inngangspressen medially på omtrent samme nivå som inngangsleddet og utvide dorsal-lateralt for å fullføre circumferential snitt.
- Etter å ha utsatt muskellaget rett under snittet, dissekere og cauterize overfladiske epigastriske kar som fører fra muskellaget til proksimal hud / subkutan klaff nettopp opprettet.
- Reflektere proksimal klaff overmedisinsk til inngangsleddbåndet og den distale huden / subkutan klaff inferolateralt til kneet.
- Bruk en trådtraktor eller rullet gasbind for å eksponere feltet.
- Vær oppmerksom på at rottaottens inngangsanatomi ligner på mennesker; fra lateral til mediale ligger nerven, arterien og venen.
- Disseker ut lårnerven, del den skarpt på inngangsleddet, proksimalt til bifurcation hvis mulig. Trekk tilbake den delte nerven dårligere, hold den trygt ute av veien, dekket under fuktig gasbind.
- Snu oppmerksomheten til lårarterien og venen, bruk 4 cm 7-0 silkebånd for å trekke fartøyene atraumatisk tilbake i stedet for å håndtere dem direkte.
- Ligate alle grener av lårbensfartøyene som de oppstår med 7-0 silkebånd; dele grenene mellom båndene. For svært små grener kan bipolar cautery brukes i stedet for bånd.
MERK: Arterielle og venøse grener som krever divisjon inkluderer overfladisk circumflex iliac og muskelkarene. Den overfladiske circumflex iliac er vanligvis størst og ser ut til å dykke dypt som ville profunda femoral hos mennesker, men profunda er fraværende i rotte15. Mer distale grener av lårkar som den høyeste genicular og saphenous grenen krever vanligvis ikke divisjon. - Injisere 500 internasjonale enheter heparin gjennom penisvenen hos en mannlig rottedonor. Bruk den overfladiske epigastriske venen hvis donorrotten er kvinne.
- La heparin sirkulere systematisk i 2 min før du fortsetter med de neste trinnene.
- Ligate lårarterien med 7-0 silkebånd så proksimalt til inngangsleddet som mulig og dele mellom båndene.
- I likhet med arterien, ligate og dele lårvenen.
- Reflektere både arterie og vene dårligere, trygt ut av veien, dekket under fuktig gasbind sammen med lårnerven dekket tidligere. Dissekere ventral muskelgrupper, ta vare på å cauterize noen synlig fartøy som oppstår. Oppmerksomhet til hemostase her vil minimere mottakerens blodtap etter reperfusjon.
- Dypt til ventrale muskelgrupper, identifisere og skarpt dele isjiasnerven proksimal til sine grener. Tre isjiagrener er vanligvis synlige: tibial, peroneal og sural. Alle tre skal alle bevares i donorlemmen. En fjerde kutan gren er vanligvis ikke sett i denne disseksjon15,16.
- Fullfør dele de resterende ventral og dorsal muskelgrupper på midten av låret nivå med omhyggelig hemostase. Det kan være nødvendig å trekke lemmen medially for å fullføre dele musklene.
- Transponer lårbenet ved midtakselen ved hjelp av en håndholdt trådløs roterende sag.
- Etter å ha fjernet lemgraften fra donoren, kutt de silkebundet endene fra podesiden femoralarterien og venestubbene, og dermed åpner karene igjen.
- Sett inn et 24-gauge angiocatheter i graftarteriestubben og skyll transplantatet med 250 internasjonale enheter heparin fortynnet i 5 ml iskald normal saltvann, og se den strømme ut klart gjennom den åpne venen.
- Skyll transplantatet langsomt i rundt 3 min. Overflødig kraftig spyling kan skade endotelet.
- Legg transplantatet i en kjølt saltvannsrett nestet i en isbøtte til transplantasjon.
- Euthanize donor rotte med bilateral thoracotomi.
- Rengjør alle kirurgiske instrumenter på riktig måte.
2. Mottaker innfødt høyre baklem amputasjon
- Induser anestesi med isofluran på 5%, bekreft dybde, trim pelsen, plasser dyret og desinfiser huden med alkohol som beskrevet for donorrotte.
- Nedtitret isofluran til 2-2,5 % og injiser subkutan preoperativ analgesi med buprenorfin 1,2 mg/kg, og preoperativ profylakse med enrofloksacin 7,5 mg/kg.
- Samme som for donor, lage et omkrets snitt i inngangspressen, reflektere hudklaffer som sikrer hemostase, og dissekere ut lårnerven, arterien og venen, ligating de samme grenskarene som ovenfor.
- Del lårnerven mer distalt enn for donoren, men proksimalt til bifurcation hvis mulig.
- Dissekere ut lårarterien og venen med nok plass til å klemme hver for seg på nivået av inngangsleddet. Klem venen og arterien med mikrokirurgiske bulldogklemmer. Når det er klemt, del hvert fartøy skarpt med saks.
- Del ventrale og dorsale muskler i låret på midten av lårnivå med omhyggelig hemostase, og trekk lemmen medially etter behov.
- Identifiser og del isjiasnervene proksimale til sine grenspunkter som ovenfor.
- Transekte lårbenet på midtakselen ved hjelp av sagen.
- Fjern mottakerens høyre høyre bakben og kast riktig.
- Nedtrituer isofluranen til 1-1,5% gjennom nesekjeglen.
3. Donor til mottaker lem implantasjon
- Bruk den håndholdte motorsagen til å barbere av eventuelle uregelmessigheter fra både donor- og mottakers lårender.
- Bruk sagen, klipp av navenden på en 18-gauge nål, som vil bli lårbenet intramedullær stang.
- Før du manipulerer beinet, påfør en liten mengde beinvoks til mottakeren kuttet enden av lårbenet for å redusere margblødning under reaming prosessen.
- Coapt donor og mottaker lårben ved hjelp av 18-gauge nålen som en intramedullær stang. Noen kraft er nødvendig, men ikke ream enten bein så langt som å bryte cortex.
- Etter behov, fjern nålen og trim den til en passende lengde slik at begge beinene passer jevnt over nålen uten nål som vises mellom beinet.
- Plasser en liten støtte som en pute av gasbind eller en liten stein eller modellering leire under donor lem for å holde den av spenning.
- Reapproximate ventral muskelgrupper med åtte til ti enkle avbrutt 5-0 polyglactin suturer slik at graftet ikke roterer rundt lårbenet nålen. Dette gir lemstabiliteten for anastomosene.
- Vanne regelmessig transplantatet og det kirurgiske feltet med iskald saltvann for bedre visualisering og for å redusere varm iskemisk reperfusjonsskade.
- Juster donor og mottaker femoral arterier og anastomose dem til ende for ende mote ved hjelp av enkel avbrutt 10-0 nylon sutur, unngår både spenning og looping. Arterien krever i gjennomsnitt seks suturer.
- I likhet med arterien, anastomose donor og mottaker lårårer til slutt mote. Venen krever seks til åtte suturer.
MERK: Sjenerøs kaldvanning, atraumatisk fartøyhåndteringsteknikk og å la lange haler tjene som oppholdssuturer for fartøyuttrekking er viktige verktøy for effektive mikrokirurgiske anastomoser. - Legg en liten mengde hemostatisk cellulosepulver rundt begge anastomoser, og fjern deretter de proksimale mikrokirurgiske bulldogklemmene på venen og arterien.
- Inspiser begge anastomosene for god patency og flyt. Bruk bomullspinner til å forsiktig prod venen og sikre god hemostase av begge anastomoser. Hold trykket over blødningssteder og plasser mer hemostatisk cellulosepulver om nødvendig. En annen sutur kan plasseres gjennom et blødende hull med fare for "back-walling" nålen bare som en siste utvei.
- Når begge anastomoser er bekreftet tilfredsstillende, trim eventuelle gjenværende lange opphold sutur haler kort for å matche de andre.
- Plasser rotten til venstre lateral decubitusposisjon, bruk liberal elektrocautery for å oppnå omhyggelig hemostase av eventuell reperfusjonsmuskelblødning.
- Slå oppmerksomhet til nerve anastomoser når muskel hemostase er sikret. Trim tilbake eventuelle nervekuttender som ser fillete ut.
- Reapproximate dorsal muskelgrupper under isjiasnerve med enkle avbrutt 5-0 polyglactin suturer.
- Reapproximate isjiasnerven. Åtte til ti 10-0 nylon neural enkle avbrutt suturer vil vanligvis være nok.
- Reapproximate minner dorsal muskelgrupper og deretter lukke dorsal huden med 4-0 polyglactin kontinuerlig sutur.
- Plasser rotten tilbake til liggende stilling og høstproksiner lårnerven. To til tre 10-0 nylon neural enkle avbrutt suturer vil vanligvis være nok.
- Lukk ventral hud med 4-0 polyglactin kontinuerlig sutur. Unngå overflødig suturhale, som kan være irriterende for rotten når den er våken.
4. Postoperativ behandling
- Gjenopprett dyr i burene sine med en varmepute under buret og klar tilgang til mat og vann, og overvåking for tidlige komplikasjoner daglig den første uken.
- Gi postoperativ analgesi subkutan meloksikam 1 mg/kg daglig injeksjon gjennom POD 2. Gi postoperativ antibiotikaprofylakse fortynne enrofloxacin spray. Gi disincentive for autotomi (selvlemlestelse) med Bitter Safe Mist sprayet to ganger daglig til transplantatet gjennom POD 7.
- Opprettholde transplanterte rotter i bur med andre rotter, for å stimulere tilbake til daglige aktiviteter og rehabilitere det transplanterte lemmet.
5. Postoperativ sensasjonstesting
- Påfør Hargreaves testing av termisk sensasjon protokoll, også beskrevet andresteder 17,18.
- Plasser rotten i testbeholderen og la den akklimatisere seg i 20 minutter. Apparatets glass er bekreftet rent, og varmekilden bekreftet å jobbe med utprøverens finger.
- Før testing må du kontrollere at rotten er våken og den testede poten er plassert over den infrarøde bevegelsesdetektoren.
- Overføre termisk energi på intensitetsnivå 90. Tidsforsinkelse i dyret som beveger poten bort fra varmekilden registreres. Hvis det ikke oppstår noen bevegelse innen 20 sekunder, avbrytes testen for å forhindre skade.
- Få fem studier per testet lem, unntatt den høyeste og laveste verdien før beregning av gjennomsnittlig tilbaketrekking ventetid for hvert dyr.
6. Etteroperativ motortesting
- Ved hjelp av en ganganalyse tredemølle og integrert programvareanalyseplattform, velg kandidater for tredemølletesting ved fire til seks uker etter operasjonen.
- Trim alle rotte tånegler en eller to dager før testing.
- Akklimatisere dyr til testrommet i en time før testing, og la det være ett minutt med pre-test klapping for å roe angst.
- Plassere rotten inne i tredemøllen, kjøre tredemøllen på forsøk på å øke hastigheten, fra 10 cm / s, til 14 cm / s, til målet 18 cm / s. Hvis rotten er tilbakeholden og ikke kan coaxed å gå, avbryte testingen den dagen for å unngå negativ kondisjonering. La høye utøvere gå opp til 24 cm/ s.
- Skyll tredemølleapparatet med 70% etanol mellom testede dyr.
- Gangart parametere er utgang fra analyseplattformens proprietære programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse og gjenoppretting avhenger av omhyggelig kirurgisk teknikk. Oppmerksomhet til vaskulære anastomoser og nevrale anastomoser, samt beinsyaptasjonen som beskrevet ovenfor, er avgjørende for å maksimere suksessen til denne modellen. Operativ design og representative anastomotiske resultater er vist i figur 1.
Samlet dødelighet var avhengig av immunsuppresjonsstrategi, med de fleste isotransplanterte dyr som oppnår studieendepunktet på 100-200 postoperative dager sett i figur 2. Når ut av det akutte postoperative vinduet, behandlet allotransplanterte dyr kunne oppleve overlevelse opp til 58 postoperative dager. Isografterte rotter levde på ubestemt tid i løpet av studien mens allograft transplanterte rotter hadde variabel dødelighet fra rapamycin og FK506. Ut av behandlingene fk506 fremmet den lengste levedyktigheten (dag 57), mens rapamycin var nest best (dag 20) over ubehandlet kontroll (dag 10).
Sensorisk og motorgjenvinning kan vises i figur 3. Dyr ble vist å ha gjenvunnet sensorisk nervefunksjon av den transplanterte poten ved hjelp av Hargreaves-apparatet innen dag 30. Dyr viste betydelig bedring med fire uker etter operasjonen (Aii). Dyr viste markerte forbedringer i motorfunksjonen til det transplanterte lemmet ved hjelp av en ganganalyse tredemølle og integrert programvareanalyseplattform. Eksempel gangart parameter basert på bestemte lemmer er vist (Bii) og en sciatic function index (SFI) er også presentert (Biii).
Figur 1: Operativ design er avbildet i tegneserieformat. (A)Rotten er vist med (B) høyre bakben tverrsnitt som viser (i) lårbunten (nerve, arterie og vene) (ii) isjiasnerven, og (iii) benet. (C) Representative mikrografer fra driftsmikroskopet (donor til venstre og mottaker til høyre) ble tatt av (i) isjiasnerveanotomosen (ii) lårnervenarterien og veneanotomoser (vist fra topp til bunn), og (iii) den 18-gauge nålen intramedullær stang-femur bein coaptation. Legg merke til donorstrukturene til venstre i hvert bilde. Legg også merke til at lårbenet er vist før full sammenkoblelse når begge beinene er imot og nålen er skjult i. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosent overlevelse av dyr som presentert dager etter operasjonen (POD). Grupper som vises inkluderer isograft, allografts uten behandling, rapamycin og FK506 immunsuppressive legemidler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sensorisk nervegjenoppretting er demonstrert i (A) Hargreaves testing transplanterte dyr hver på seks postoperative tidspunkter og i (B) fortsatt skutt av tredemølle testing ved hjelp av DigiGait. (i) Representative bilder vises med (ii) respektive potedata. Respektive fargekodede bilder av poter er også i 0,025 ms rammer. Digigate-modeller (iii) vises også. Betydning ble bestemt ved hjelp av en enveis ANOVA med en Bonferronis flere sammenligningstest og SEM, hvor n= 7 og p< 0,05. Disse spesielle DigiGait-dataene ble tatt fra et isogendyr testet på postoperativ dag 28. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lemtransplantasjon, under den bredere kategorien av vaskularisert komponent allotransplantasjon (VCA), har allment anvendelig terapeutisk løfte som ennå ikke oppfylt. De viktigste veisperringene ligger i uløste immunologiske problemer som er unike for VCA og nevromotoriske utvinningsteknikker som brukes for tiden. Utvikling av nye teknikker vil avhenge av dyremodellering som er fleksibel, robust og reproduserbar.
Mange dyremodeller er etablert i VCA, hver med spesifikke fordeler4. Ikke-menneskelige primatmodeller tilbyr attraktiv oversettelsesevne til menneskelige pasienter, men har blitt hindret av kostnadsbekymringer og giftige nivåer av immunsuppresjon kreves4. Hundemodeller har blitt sett på som en fordel for spesifikke likheter av muskelstruktur som mennesker, samt et mer erfarent immunsystem19,20. Svin modeller tilbyr fordelene med en stor dyremodell der immunsystemet blir stadig mer godt studert21,22. Mus modell systemer presentere de mest avanserte teknikker for å studere immunologi, men til tross for viktige fremskritt i håndjern vaskulær mikrokirurgisk anastomose23,mus lem transplantasjon forblir teknisk utfordrende og har noen begrensninger i funksjonell utvinningvurdering 5,24,25,26.
Rottemodeller i VCA har blitt benyttet siden 19783,og gir en moden plattform for å undersøke både immunologiske og nevromotoriske hypoteser6,,9,,13,,14,,17,,27,,28,,38. Modellen her kombinerer fordelene med hindlimb ortopikisk tilnærming, sutur anastomose, nerve re-tilnærming, og potensial for ganganalyse. Hindlimb ortopisk i motsetning til forbentransplantasjon er mindre av en heftelse til rotte under gjenopprettingsprosessen og gir mulighet for fortsatt normal grooming og fôring atferd post operativt. Sutur anastomose selv om møysommelig kan potensielt tilby mindre teknisk forvirrende for langsiktige studier. Nerve re-tilnærming gjør det mulig for fremtidig undersøkelse17,,18 og gangart analyse. Denne protokollen er avhengig av omhyggelige, tidstestede mikrokirurgiske teknikker godt beskrevet andresteder 29, som krever konstant oppmerksomhet for å unngå de umiddelbare fallgruvene for bedøvelse overdose, anastomotisk svikt, anastomotisk trombose, og overdreven kirurgisk blodtap. Selv om flere mikrokirurger kan forbedre arbeidsflyten, har vi beskrevet en metode der en enkelt driftsmikrokirurg kan oppnå tilstrekkelig eksperimentell utgang.
Autotomi eller selvlemlestelse har vært et fenomen som er nevnt i flere mikrokirurgiske modeller, og det har blitt hypotetisk å inverset korrelere med nerveheling30,31. Autotomi ble generelt kontrollert i denne modellen, muligens relatert omhyggelig nevrale anastomotisk teknikk. Autotomi også redusert lenger inn i læringskurven. Bitter Safe Mist var et verdifullt supplement til å kontrollere dette fenomenet.
Ganganalyse hos rotter har blitt studert for flere modeller av skade32,33,34, mest relevant for isjiasnerveskade35,36. Rotter selv når ikke lem transplantasjon mottakere er kjent for å være heterogene for ganganalyse, og etterforskere fortsatt debattere hvilke analyseparametere beskrive utvinning37. I denne modellen har vi beskrevet flere metoder for å få de beste dataene fra transplanterte mottakere som er villige og i stand til å gå. Forhåndsvalg av tilstrekkelige turgåere var ikke prediktivt for postoperativt samarbeid. Selv om dyr er i stand til å flytte om sine boliger så snart som flere timer etter operasjonen, er de ikke klare for tredemøllebmbulation før minst fire til seks uker etter operasjonen.
En protokolls evne til å måle nervegjenoppretting i VCA er avhengig av sin strategi for rehabilitering. Denne protokollen fremmer eksplisitt transplantasjonsmottakere som samhandler med andre rotter som induktor til funksjon. Denne strategien er oppmerksom på viktigheten av modellering rehabilitering, men er likevel enkel, økonomisk, og er i stor grad standard. Fremtidige strategier kan omfatte mer aktiv rehabilitering som tredemølletrening.
De immunologiske teknikkene som gjelder for denne modellen er utenfor omfanget av denne diskusjonen, men spesielt å sammenligne isotransplant versus allotransplanteed dyr gir en nyttig kontroll for å skille allograft immunologiske fenomener og avvisning fra iskemisk reperfusjonsskade, betennelse, revascularization og postkirurgiske infeksjonsprosesser som ligger i selve transplantasjonsoperasjonen. Isotransplanter gir en lignende kontroll for nervefunksjonsstudier av samme grunn.
Ved hjelp av denne plattformen kan etterforskerne være i stand til å fremme både VCA immunologi og nevromotorisk utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Frankel Foundation og Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operation RESTORE). Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medicial Sciences of the National Institutes of Health under Award Number T32GM008152. Dette arbeidet ble støttet av Northwestern University Microsurgery Core og Behavioral Phenotyping Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
