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Medicine

Intubazione orotrachea ripetuta nei topi

doi: 10.3791/60844 Published: March 27, 2020

Summary

L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo raffinato di intubazione del topo di laboratorio. Il metodo non è invasivo e, quindi, ideale per studi che richiedono il monitoraggio seriale della funzione respiratoria e/o l'instillazione di trattamenti nel polmone.

Abstract

La letteratura descrive diversi metodi per l'intubazione del topo che richiedono la visualizzazione della glottide attraverso la cavità orale o l'incisione nel collo ventrale per la conferma diretta del posizionamento della cannula nella trachea. La difficoltà relativa o il trauma tissutale indotto al soggetto da tali procedure può essere un ostacolo alla capacità di un ricercatore di eseguire studi longitudinali. Questo articolo illustra una tecnica in cui la manipolazione fisica del topo dopo l'uso di un depilatorio per rimuovere i capelli dal collo ventrale consente la visualizzazione transcutanea della trachea per l'intubazione orotracheale indipendentemente dal grado di pelle Pigmentazione. Questo metodo è innocuo per il soggetto e facilmente raggiungibile con una comprensione limitata dell'anatomia murina. Questo approccio raffinato facilita l'intubazione ripetuta, che può essere necessaria per monitorare la progressione della malattia o l'instillazione dei trattamenti. L'utilizzo di questo metodo può comportare una riduzione del numero di animali e abilità tecniche necessarie per misurare la funzione polmonare nei modelli murini delle malattie respiratorie.

Introduction

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Il topo di laboratorio è un modello animale comune per le malattie respiratorie umane. Così, ci sono diversi metodi pubblicati per l'intubazione del topo allo scopo sia di instillazione dei trattamenti e misurazione della meccanica respiratoria. La maggior parte delle procedure descritte richiede la visualizzazione della glottide attraverso la cavità orale con attrezzature specializzate come un largoscopio o una fonte di luce in fibraottica 1,2,3,4,5,6,7. Tuttavia, questo può essere difficile quando è necessaria una cannula relativamente grande, in quanto può oscurare la visione del ricercatore. Limjunyawong et al.8 hanno affrontato questa preoccupazione con un metodo di intubazione in cui una piccola incisione cutanea viene fatta lungo la linea mediana del collo ventrale che consente la visualizzazione della trachea. Dopo la procedura, l'incisione è chiusa con adesivo tissutale.

Per gli studi che richiedono frequenti intubazioni ripetute, incisione e chiusura successive di questo sito richiede il debridement dei margini della pelle e il trauma tissutale al collo ventrale. Lo scopo dell'approccio di visualizzazione tracheale transcutanea all'intubazione orale è quello di fornire una tecnica raffinata e non invasiva specificamente adatta per ripetuti studi di intubazione, nonché singoli eventi di intubazione nei topi.

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Protocol

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Tutte le attività animali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University e sono state condotte in strutture accreditate da AAALAC.

1. Preparazione della procedura

  1. Costruire la piattaforma di intubazione. Per ottenere la pendenza della piattaforma appropriata, utilizzare un legante a 3 anelli da 3 pollici (7,6 cm). Piegare a metà una lunghezza di 15-20 cm di seta 3-0 o altro materiale filettatura e aderire alle estremità del filo nella parte superiore della piattaforma inclinata con nastro adesivo per creare un loop di sospensione (Figura 1).
  2. Selezionare una cannula della dimensione e della lunghezza appropriate.
    NOT: Per un topo lungo 20-30 g, può essere utilizzato un catetere lungo 2,5,3,8 cm fino a 18 G. Per questo studio, sono stati utilizzati 18 topi c57BL/6 di 18 settimane di sesso femminile e c57BL/6 di 10 settimane (n - 3 di ogni ceppo). Una tènte di catetere bianco opaco fornisce la migliore visualizzazione transcutanea.
  3. Tagliare uno smusso sulla punta distale del catetere e lisciare la superficie di taglio con carta abrasiva per creare una punta di smusso arrotondata. Creare delicatamente una leggera piegatura nella cannula a circa 1 cm dalla sveva (Figura 2).
    NOT: Per ogni mouse deve essere utilizzato un nuovo catetere.
  4. Anestesizzare il topo con ketamina (5,4 mg/g di peso corporeo) e xylazina (16 g/g di peso corporeo) somministrata intraperitonealmente.  Applicare unguento oftalimico sterile agli occhi.
    NOT: Una corretta profondità anestetica si ottiene con la mancanza di risposta del mouse a un pizzico fermo.
  5. Sospendere il mouse in una posizione supina sulla piattaforma di intubazione agganciando gli incisivi superiori intorno al filo di seta nella parte superiore della superficie angolata (Figura 3). Una volta che il mouse è posizionato esattamente nella recumbency dorsale, afferrare delicatamente la base della coda e ritrarre la coda verso il tavolo. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla base della coda per fissare il mouse.
  6. Applicare la crema depilatoria (Tabella dei Materiali) alla regione cervicale ventrale per 30-45 s quindi rimuovere tutta la crema depilatoria dalla regione cervicale utilizzando una garza secca. Ripetere il processo di applicazione, se necessario. Sciacquare accuratamente la pelle con acqua salina o distillata per rimuovere eventuali residui e asciugare.

2. Procedura di intubazione

  1. Utilizzare pinze dritte e piatte nella mano non dominante per ritrarre delicatamente la lingua in modo che apra sufficientemente la bocca per l'introduzione della cannula.
    NOT: Le pinze dei denti del ratto non devono essere utilizzate in quanto questo danneggerà la lingua.
  2. Con la mano dominante, far avanzare la cannula in bocca in modo che l'estremità che è distale alla leggera curva è contro il tetto della bocca del soggetto.
  3. Rilasciare la lingua e far scorrere il bordo piatto delle pinze chiuse caudalmente lungo il collo ventrale fino a raggiungere il manubrio. Questo movimento sposta lateralmente le ghiandole salivari e appiattisce il muscolo che copre la trachea. La trachea appare transcutaneamente come una linea bianca (Figura 3A). Se necessario, ruotare le pinze in direzione craniodorsale mantenendo la tensione sulla pelle in direzione caudale per causare le ghiandole salivari spostate lateralmente al picco. Questa manovra crea più contrasto intorno alla trachea (Figura 3B).
    NOT: Evitare la forza eccessiva sul collo ventrale in quanto può collassare la trachea e compromettere la respirazione.
  4. Avanzare la cannula mentre contemporaneamente fornire la punta distale della cannula ventralmente per supinazione della mano dominante con flessione simultanea del polso.
  5. Il corretto posizionamento della cannula è indicato dalla visualizzazione della cannula opaca nella trachea (Figura 4B,D). Se la cannula è stata avanzata oltre il livello di origine del muscolo masseter e la visualizzazione della cannula nella trachea non è stata confermata, ritrarre la cannula e ritentare la manovra.
  6. Confermare il corretto posizionamento della cannula collegando una lampadina di gonfiaggio polmonare alla cannula e osservando l'espansione toracica con la depressione simultanea del dispositivo.
  7. Senza spostare la cannula, sganciare con cura gli incisivi del mouse dalla piattaforma di intubazione. Spostare il mouse su una piattaforma orizzontale (Table of Materials) e inserire la cannula nell'adattatore sul ventilatore. Dopo la profonda inflazione, ventilare il topo per 60 s quindi misurare la resistenza respiratoria.

3. Recupero

  1. Una volta completata la procedura, spostare il mouse su una piattaforma riscaldata. Fornire una stimolazione costante tramite punta leggera o pizzichi della coda per incoraggiare la respirazione spontanea.
  2. L'estubazione può verificarsi quando il mouse inizia a masticare. Afferrare la cannula a livello del mozzo e tirare delicatamente il tubo cranialmente e lontano dal mouse fino a quando la cannula è completamente rimosso dalla bocca del soggetto.
    NOT: È preferibile fornire supporto alle vie aeree con la cannula rigida il più a lungo possibile durante il processo di recupero.
  3. Una volta estratto, trasferire il mouse in una gabbia di recupero pulita con supporto termico. Monitorare continuamente il mouse fino a quando non è completamente ambulatoriale, e il recupero è completo.

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Representative Results

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Monitoraggio seriale della funzione polmonare di base
Diciotto-settimana-vecchia femmina BALB/c e 10-settimana-vecchio C57BL/6 topi (n - 3 di ogni ceppo) sono stati intubati utilizzando il metodo descritto il giorno 0, 3, 10 e 17. A seguito di intubazione ogni giorno, il soggetto è stato collegato ad un ventilatore meccanico fornito con ossigeno al 100% (Tabella dei materiali). La resistenza respiratoria (Rrs) è stata misurata utilizzando la tecnica di oscillazione forzata per 60 s a seguito di un'inflazione profonda a 25 cm H2O tenuta per 5 s. Nessun errore software associato a questa trattenuta prolungata insieme ai valori Rrs all'interno della portata fisiologica forniscono ulteriore supporto per il corretto posizionamento della cannula. I dati non hanno rivelato differenze significative tra le Rr misurate osservate tra i punti temporali all'interno di ogniceppo( Figura 5 ). Si presume che l'assenza di un aumento di Rrs nel tempo indica mancanza di infiammazione associata a traumi nel sistema respiratorio in quattro punti temporali consecutivi.

Analisi statistica
Le statistiche descrittive (errore medio e standard) sono state calcolate utilizzando un software di analisi statistica (Tabella dei materiali). Il metodo Kolmogorov-Smirnov è stato utilizzato per verificare la distribuzione dei dati gaussiani. Le analisi statistiche dei set di dati sono state effettuate da ANOVA non accoppiato, con un post-test di confronto multiplo Post hoc Tukey-Kramer. Tutti i dati sono presentati come media : SEM. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Figure 1
Figura 1: Piattaforma di intubazione. La piattaforma di intubazione è costituita da un legante a tre anelli con un anello di filo di seta aderito alla parte superiore del legante per creare un ciclo di sospensione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: preparazione Cannula. (A)Vista laterale della cannula preparata. Si noti l'angolo delicato creato circa 1 cm dalla svela arrotondata all'estremità distale del catetere e l'orientamento dell'angolo cannula in relazione alla svela. (B) Vista Dorsoventrale della cannula preparata. Notare lo spigolo arrotondato e levigato dello smusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: visualizzazione tracheale. (A) Le pinze sono poste sul collo ventrale e la pelle viene delicatamente ritratta caudalmente per spostare lateralmente le ghiandole salivari e forniscono la visualizzazione della trachea come una struttura bianca sulla linea mediana ventrale (freccia nera). (B) Rotazione craniodorsale delle pinze sul collo ventrale crea una sporgenza delle ghiandole salivari. La trachea è visualizzata come la struttura lineare bianca sulla linea mediana ventrale tra le ghiandole salivari (freccia nera). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Posizionamento corretto della cannula. (A) C57BL/6 mouse posizionato sulla piattaforma di intubazione con la cannula introdotta nella cavità orale prossimale. (B) C57BL/6 mouse con la cannula correttamente posizionata nella trachea. Si noti che la cannula può essere facilmente visualizzata come la struttura bianca all'interno della trachea (freccia bianca). (C) Mouse BALB/c posizionato sul tabellone di intubazione con la cannula introdotta nella cavità orale prossimale. (D) Mouse BALB/c con la cannula correttamente posizionata nella trachea. La cannula bianca può essere facilmente visualizzata all'interno della trachea (freccia nera). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Misurazione seriale della resistenza. Nessuna differenza significativa di Rr misurati osservati tra i punti temporali all'interno di ogni ceppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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L'intubazione mediante la tecnica di visualizzazione tracheale transcutanea offre un approccio raffinato al metodo standard di incisione cutanea. Con particolare attenzione a diversi passaggi chiave, l'intubazione può essere facilmente e rapidamente raggiunta. L'animale deve essere posizionato esattamente in recumbency dorsale sulla piattaforma di intubazione con il mouse fissato in delicata retrazione. Questo estenderà l'animale in allineamento verticale e corretto posizionamento per l'intubazione. Inoltre, la crema depilatoria non deve rimanere a contatto con la pelle dell'animale per più di 30-45 s e deve essere accuratamente sciacquata per rimuovere tutti i residui. Il contatto esteso della pelle con la crema depilatoria causerà dolore inutile per l'animale e ulcerazioni possono ostacolare la vista della trachea9. E 'imperativo utilizzare il movimento del polso corretto come la mano dominante introduce il catetere nella glottide. Il polso dominante dovrebbe flettersi mentre la mano si muove in un movimento di supinazione. È anche fondamentale monitorare attentamente il soggetto mentre il bordo piatto delle pinze viene premuto sul collo ventrale per visualizzare la trachea. La pressione delle pinze occluderà la trachea e causerà l'ipossia se mantenuta per una durata prolungata. Se il paziente appare cianotico, lasciare una breve pausa per le membrane del muco per tornare a un colore rosa e per la respirazione di stabilizzarsi prima di ripetere i tentativi.

Per eseguire questa tecnica non era necessaria un'ampia esperienza di intubazione del topo. Le complicanze più comuni negli individui inesperti includono trauma laringea lealogico e infiammazione delle vie aeree superiori a causa di più tentativi di intubazione. Un attento monitoraggio è necessario durante il recupero di questi pazienti in quanto può essere indicato un intervento medico con anti-infiammatori non steroidei. Ripetuti tentativi di intubazione non riusciti possono provocare traumi tissutali e infiammazione della cavità orale distale, che potrebbe provocare rumore respiratorio superiore, dispnea, ipossiemia, recupero prolungato, incapacità di eseguire intubazione ripetuta o morte.

Sono consigliate diverse modifiche nel caso in cui l'intubazione non abbia esito positivo. In primo luogo, assicurarsi che lo smusso della cannula sia liscio, arrotondato e tagliato alla lunghezza appropriata per le dimensioni dell'animale. Il bordo dello smusso può essere levigato utilizzando carta abrasiva per ridurre al minimo il trauma tissutale e facilitare l'intubazione7. Inoltre, verificare che la cannula presenti una leggera curva di circa 15 gradi a un terzo di distanza dallo svelamento e che la punta della cannula sia svelata ad un angolo di 45 gradi, come descritto in Brown et al.6. Controllare sempre che il catetere sia nell'orientamento corretto prima e durante l'esecuzione di questa procedura.

Per questo studio, i topi sono stati intubati per ripetuti test della funzione polmonare utilizzando un sistema di ventilazione meccanico per registrare le misurazioni della funzione polmonare. Un grande, 18 G cannula è stato utilizzato per creare una tenuta stretta. Per eseguire studi ripetuti di funzione polmonare su topi con un diametro tracheale più piccolo a causa dell'età o del ceppo, può essere difficile posizionare una cannula più grande. Se una cannula più piccola viene eletta per l'uso, assicurarsi che un sigillo adeguato possa ancora essere raggiunto, e che la resistenza della cannula non sia superiore alla resistenza delle vie aeree del soggetto del test10. Una perturbazione profonda dell'inflazione di successo è un'adeguata conferma di un sigillo appropriato. Si noti che tale sigillo non è necessario se si desidera solo l'installazione di trattamenti nel polmone.

Anche se il metodo descritto ha apportato modifiche che prevengono danni ai tessuti esterni, il limite superiore della frequenza di intubazione è ancora una funzione di trauma cumulativo alla glottide e alla trachea a causa dell'eccessiva introduzione della cannula. Il monitoraggio simultaneo di un gruppo di controllo per aumenti significativi della resistenza delle vie aeree durante uno studio è raccomandato poiché il trauma tissutale è accompagnato da infiammazione che si tradurrà in una diminuzione del diametro luminoso della trachea. Nell'attuale studio non sono stati osservati aumenti significativi della resistenza delle vie aeree nel corso di ripetute procedure di intubazione. I topi sono rimasti clinicamente normali per la durata dello studio e la necroscopia lorda delle strutture delle vie aeree superiori era insignificante alla conclusione dello studio in tutti gli animali.

In sintesi, la tecnica di intubazione descritta offre un metodo non invasivo per posizionare cannule endotracheali con attrezzature minime tra cui una superficie inclinata, pinze, una cannula polipropilene e forniture depilatorie. Questo metodo raffinato consente ripetuti eventi di intubazione senza trauma tissutale ricorrente e dolore associato a un sito di incisione cutanea sul collo ventrale o una procedura di tracheotomia. Inoltre, questo metodo riduce il numero di topi necessari in quanto singoli topi possono essere ripetutamente intubati nel corso di uno studio. Elimina inoltre la necessità di dispositivi di ritenuta per intubazione appositamente progettati, mirini o apparecchiature di traslazione per la visualizzazione delle vie aeree. In questo studio sono stati utilizzati ceppi BALB/c e C57BL/6 per dimostrare il successo della tecnica nei ceppi pigmentati sia in luce che in animali di dimensioni relativamente giovani e di piccole dimensioni (topi di 10-20 settimane). Questa tecnica raffinata è adatta per l'instillazione intratracheale singola o ripetuta di composti, lavaggio bronchoalveolare, imaging o test della funzione polmonare. Questo metodo minimamente invasivo e versatile può essere implementato praticamente per qualsiasi procedura che richieda l'accesso al tratto respiratorio inferiore.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph e Lindsey Ferguson per la loro assistenza tecnica e il Laboratorio universitario Animal Resources per il loro supporto alla cura degli animali. Questo lavoro è finanziato da NIH T35OD010977 e R01-HL102469.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet Fisher Scientific #14-841-14 Cannula for intubation
70% ethanol, 10 L Fisher Scientific 25467025 Cleaning cannula
Abrasive paper (sandpaper) Porter-Cable 74001201 Cannula preparation
AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) Akorn Animal Health NDC# 59399-111-50 Anesthesia
Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) Fisher Scientific 15966 Restraint on intubation platform
Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) Henry Schein Item #1007842 Intubation platform
Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP Mouse thermoregulation and recovery
Deltaphase Operating Board Braintree Scientific 39OP Mouse recovery (prior to extubation)
Distilled water ThermoFisher 15230253 Cleaning mouse following depilation
Eye Scissors, angled, sharp/sharp Harvard Apparatus 72-8437 Cannula preparation
FlexiVent (FX Module 2) Scireq N/A Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure)
Gauze sponges Fisher scientific 13-761-52 Hair removal
Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders Staples 24690CT Intubation platform
Instat Software Graphpad N/A Statistical analysis software
Insulin syringe (0.5 cc, U100) Fisher Scientific 329461 Anesthesia administration
Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) Llyod Laoratories List No. 4871 Anesthesia
Lung inflation bulb Harvard Apparatus 72-9083 Confirm cannula placement
Micro Forceps, Curved, Smooth Harvard Apparatus 72-0445 Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization
Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle Church & Dwight 42010440 Hair removal
Sterile saline (0.9%), 10 mL Fisher Scientific NC9054335 Anesthesia, cleaning skin following hair removal

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References

  1. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41, (1), 128-135 (2007).
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  3. Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3, (2), 363-369 (2015).
  4. Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88, (2), 179 (1999).
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  8. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
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Intubazione orotrachea ripetuta nei topi
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Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. Repeated Orotracheal Intubation in Mice. J. Vis. Exp. (157), e60844, doi:10.3791/60844 (2020).More

Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. Repeated Orotracheal Intubation in Mice. J. Vis. Exp. (157), e60844, doi:10.3791/60844 (2020).

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