Summary
Bu protokol, senkrotron tabanlı X-ışını absorpsiyon spektroskopisi deneyleri için biyolojik kriyoörnekler hazırlamak için ayrıntılı bir prosedür sunar. Numune hazırlama ve kriyoprezervasyonu optimize etmek için gereken tüm adımları, kanser ve fitoplankton hücreleri ile protokol örnekleri ile açıklıyoruz. Bu yöntem, evrensel bir numune kriyo-hazırlama standardı sağlar.
Abstract
X-ışını absorpsiyon spektroskopisi (XAS) ile elementlerin incelenmesi, metallerin biyolojik sistemlerdeki rolünü incelerken özellikle ilgi çekicidir. Numune hazırlama, özellikle biyolojik numuneler için önemli ve genellikle karmaşık bir prosedürdür. X-ışını türleştirme teknikleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, tekniğin kullanıcıları için henüz ayrıntılı bir protokol yayılmamıştır. Ayrıca, kimyasal durum modifikasyonu endişe vericidir ve hücrelerin veya dokuların kimyasal bütünlüğünün maksimum korunmasını sağlamak için biyolojik numuneleri neredeyse doğal hidratlanmış hallerinde analiz etmek için kriyo bazlı teknikler önerilir. Burada, kriyo-korunmuş örneklere dayanan bir hücresel hazırlama protokolü öneriyoruz. Kanser hücrelerinde selenyumun yüksek enerji çözünürlüklü floresan saptanan X-ışını absorpsiyon spektroskopisi çalışmasında ve fitoplanktonda demirin incelenmesinde gösterilmiştir. Bu protokol, diğer biyolojik örnekler ve ışınlama ile zarar görebilecek diğer X-ışını teknikleri ile birlikte kullanılabilir.
Introduction
Esansiyel veya toksik elementlerin hücresel biyotransformasyonlarının incelenmesi, yüksek hassasiyetli türleşme teknikleri gerektirir ve genellikle kimyasal türlerin modifikasyonuna eğilimli numune hazırlama adımlarını en aza indirmelidir.
Selenyum ve demir gibi fizyolojik elementlerin, karmaşık kimyaları, selenyum veya demir türlerinin çeşitli stabiliteleri ve ppm (mg / kg) veya hatta sub-ppm aralığındaki düşük konsantrasyonları nedeniyle türleşmesinin özellikle zor olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, bu elementlerin XAS tarafından türleşmesinin incelenmesi son derece zor olabilir. Senkrotron XAS ve özellikle çok düşük bir sinyal-arka plan oranı1'e izin veren yüksek enerji çözünürlüklü floresan algılanan XAS (HERFD-XAS), karmaşık biyolojik matrislerde yüksek oranda seyreltilmiş elementleri türleştirmek için senkrotron kaynaklarında mevcuttur 2,3. Geleneksel floresan-XAS ölçümleri, Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'ndeki (ESRF)4'teki CRG-FAME ışın hattında, enerji bant genişliği ~150–250 eV'ye sahip enerji çözümlü bir katı hal dedektörü (SSD) kullanılarak gerçekleştirilebilirken, HERFD-XAS ölçümleri ESRF2'deki CRG-FAME-UHD ışın hattında ~1–3 eV enerji bant genişliğine sahip bir kristal analizör spektrometresine (CAS) ihtiyaç duyar. . Floresan fotonlar, sırasıyla elektronik veya optik işlemlerle enerjilerine göre ayırt edilir.
Numune kriyo-preparatı, yapıları korumak ve bileşimsel kimyasal bütünlüğü korumak için gereklidir, böylece biyolojik doğal duruma yakın analizlere izin verir5. Ayrıca, sıvı helyum kriyojenik soğutma (LN2) kullanılarak 10 K'ya kadar düşük kriyojenik sıcaklıklarda yapılan analizler, radyasyon hasarının XAS için temel türleşmeyi yavaşlatmasına ve korumasına izin verir. Biyolojik örneklere uygulanan XAS teknikleri üzerine yapılan bazı incelemeler, kriyojenik koşullarda numune hazırlama ve analiz etme gerekliliğini bildirse de (örneğin, Sarret ve ark.6, Porcaro ve ark.7), hiçbiri ilgili ayrıntılı protokolü açıkça tanımlamamaktadır. Bu yayında, kriyojenik sıcaklıkta Se8 ve Fe9'un HERFD-XAS türleşmesi için kanser hücrelerinin ve plankton mikroorganizmalarının kriyo-hazırlanması için bir yöntem tanımlanmıştır.
Son teknoloji XAS spektroskopisi ölçümleri sırasında numune hazırlama ve çevre için iyi uygulama 1) bir kurulum gerektirir; 2) radyasyon hasarının etkilerini mümkün olduğunca sınırlayan bir analiz prosedürü; ve 3) X-ışını fotonlarının ışın boyutuna göre mümkün olduğunca homojen bir numune (veya model bileşik referansı). İlk madde, bir sıvı helyum kriyostat kullanarak, düşük bir sıcaklıkta elde etme işlemi gerçekleştirilerek dikkate alınır. İkinci madde, numunenin taze bir alanı üzerinde her bir kazanımın, kirişe göre hareket ettirilerek gerçekleştirilmesiyle ele alınır. Son olarak, üçüncü koşul göz önüne alındığında, gözeneklilikleri ve homojensizlikleri mümkün olduğunca sınırlamak ve X-ışını problu numune yüzeyindeki kiriş boyutuna göre pürüzlülüğü önlemek için numuneler (peletler) ve referanslar (tozlar) preslenmiş dökme peletlerde şartlandırılır. Protokolün tüm bu noktalarla nasıl başa çıktığını açıklıyoruz.
İnsan prostat hücre hattı PC-3 (yüksek metastatik potansiyel) ve yumurtalık hücre hattı OVCAR-3'ü (tüm yumurtalık kanseri vakalarının% 70'ini oluşturur) selenyum nanopartiküllerinin (Se-NP'ler) kanser hücrelerine yönelik antiproliferatif özellikleri araştırmak için kullandık ve fitoplanktonda demir tutumunu araştırmak için model bir tür olarak Phaeodactylum tricornutum diatom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Selenyum türleşmesi için insan PC-3 ve OVCAR-3 kanser hücresi peletlerinin hazırlanması
NOT: Aşağıdaki protokol Weekley et al.10'dan uyarlanmıştır. Tüm adımlar, aseptik teknikler kullanılarak, biyogüvenlik seviye 2 koşulları ve kısıtlamaları altında bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleştirilmelidir.
- Malassez hücre sayma odasını kullanarak hücreleri sayın. PC-3 hücre hattı için şişe başına 150.000-200.000 hücre ve OVCAR-3 hücre hattı için 300.000 hücre tohumlayın.
- T-75 şişelerindeki tohum hücreleri (üçlü olması için koşul başına üç şişe) laminer akış başlığının altındaki yeterli hücre kültürü ortamında (Tablo 1).
- Hücre kültürlerini 37 ° C'de bir inkübatörde ve% 80 birleşime ulaşana kadar% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde büyümeye bırakın. Genellikle, PC-3 prostat kanseri hücre hatları 24 saat sonra iki katına çıkarken, OVCAR-3 yumurtalık kanseri hücre hatları 72 saat sürer. Şişeler inkübatörde bırakılmalıdır.
- Bu arada, tedavi için kullanılan Se-NP'leri, sitotoksisite değerlendirmesi için MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromür) tarafından önceden belirlenmiş IC20'ye (% 20 hücre ölümü elde etmek için inhibitör konsantrasyon) karşılık gelen son bir konsantrasyona seyreltin. Bu konsantrasyonlar her Se-NP tipine özgüdür, ancak aynı zamanda çalışılan hücre hattına da özgüdür.
- Nanopartikül stok çözeltisini (2 mg / mL sığır serum albümini [BSA] veya kitosan kaplı Se-NP'ler) oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca bir ultrason su banyosuna yerleştirin.
- Çalışma konsantrasyonlarına ulaşmak için Se-NPs çözeltisini tam hücre kültürü ortamında seri seyreltmelerle seyreltin. Her seyreltme arasında, 1 dakika boyunca vorteks.
- Tedavi için seyreltilmiş selenyum tuzu ile selenyum pozitif kontrolü hazırlayın.
- 15 mL'lik bir polipropilen tüp içinde sulu bir sodyum selenit stok çözeltisi (1 mg / mL) hazırlayın. 1 mg sodyum selenit tozunu 1 mL ultra saf su ile karıştırın.
- 1 dakika boyunca stok çözeltisini vorteksleyin.
- Çalışma konsantrasyonlarına ulaşmak için sodyum selenit stok çözeltisini komple hücre kültürü ortamında seri seyreltmelerle seyreltin.
NOT: Çözeltiyi homojenize etmek için her seyreltmeden önce birkaç kez pipet çekmeyi unutmayın.
- Kanser hücrelerini selenyum tedavilerine maruz bırakın.
NOT: Protokolün bu kısmı, test edilen her nanopartikül (NP) için tekrarlanmalıdır. Burada, NP'ler iki tiptedir, BSA ve kitosan kaplı Se-NP'ler ve ayrıca kontroller. Sodyum selenit çözeltisi pozitif kontroldür ve hiçbir tedavi negatif kontrol değildir.- Laminer akış başlığındaki hücreleri içeren üç T-75 şişesini açın.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri 5 mL ısıtılmış (37 ° C) fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 kat hafifçe yıkayın.
- Nazikçe, şişenin alt tarafına ve doğrudan hücre tabakasına değil, 25 mL steril plastik pipetlerle donatılmış otomatik bir pipet kullanarak her şişeye 15 mL işlem ekleyin. Kapakları şişelerin üzerine yerleştirin. Kapakları sıkıca kapatmayın.
NOT: Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi, arıtma çözeltilerinin homojenize edilmesi için önceden yeniden askıya alınmış olması gerekir. - Üç şişeyi yatay olarak 37 ° C'de bir inkübatörde ve24 saat boyunca% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde bırakın.
- Hücre peletlerinin hazırlanması
- Hücreleri doğrudan T75 şişelerinde 5 mL ısıtılmış PBS (37 °C) ile 2 kat nazikçe yıkayın.
- 10 mL steril plastik pipetlerle donatılmış bir pipet çocuğu kullanarak T-75 şişesindeki hücre tabakasına 6 mL ısıtılmış hücre kültürü ortamı (37 °C) ekleyin.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri nazikçe kazıyarak toplayın. Şişe başına bir hücre kazıyıcı kullanın.
- Bir pipet boyu, 10 mL pipet kullanarak, sıvıyı aspire edin ve tüm hücreleri toplamak için şişe yüzeyindeki hücreyi/ortamı geri yıkayın. Hücreleri ayırmak ve bireyselleştirmek için bu adımı birkaç kez tekrarlayın. Hücreleri içeren ortamı 15 mL'lik bir polipropilen tüpte toplayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'de döndürün.
- Hücreleri 5 mL PBS'de yeniden askıya alarak durulayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'de döndürün. süpernatantı aspire edin ve tedavinin kalan tüm izlerinden kurtulmak için 1.6.5 ve 1.6.6 2x adımlarını tekrarlayın.
- Hücreleri 1 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 1.5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın. Son olarak, RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'de döndürün. Şekil 1 , süpernatanın santrifüj edilmesinden ve atılmasından sonra elde edilen hücre peletini temsil eder.
- 200 μL pipet kullanarak tüm PBS süpernatantını nazikçe çıkarın.
NOT: Hücre peletine dokunmamaya ve zarar vermemeye dikkat edin. İdeal olarak, pelet 3–6 mm çapında 2–3 mm yüksekliğinde veya kalınlığında olmalıdır. PC-3 hücre hattı için, tahlil için 9 x 10 6–10 x 106 hücre gereklidir. OVCAR-3 hücre hattı için 8 x 10 6–9 x 106 hücre gereklidir (Şekil 1). Bazı hücreler sonraki tampon durulama adımları sırasında muhtemelen kaybolacaktır. Hücre sayısı ne kadar yüksek olursa, pelet o kadar iyi olur.
- Hücre peletlerinin flaşla dondurulması
- Peletin sıvı azot (LN2) içinde bulunduğu 1,5 mL'lik tüpün alt kısmını hücre peleti seviyesine daldırın.
- Azot gazı gibi inert bir atmosferle tamamen temizlenmiş bir torpido gözünde, LN 2 soğutmalı bakır bloğun düz yüzeyindeki 1,5 mL tüpe hafifçe dokunarak hücre peletini toplayın (Şekil 2). Pelet daha sonra hücre kaybı olmadan toplanır.
NOT: LN 2 kullanımı için kriyoproteksiyon ekipmanı, laboratuvar önlüğü, kapalı ayakkabılar, kriyo-eldivenler ve yüz siperliği veya güvenlikgözlükleri kullanın. - Gerekirse, peletin çıkarılmasına yardımcı olmak için LN2 soğutmalı bir iğne kullanılabilir.
NOT: Elde edilen dondurulmuş hücre peleti parçalanabilir. Bu adımlar birkaç dakika içinde gerçekleştirilmeli ve araştırmacının el becerisine ve hızına güvenilmelidir. - Dondurulmuş pelet boyutları kriyostat numune tutucusuna uygun olmalıdır. Açıklanan ekipmanı kullanarak, hücre peleti yüksekliği 2 mm'den büyükse ve XAS için kullanılan numune tutucunun deliğinden biraz daha küçükse, numune doğrudan kullanılabilir. Değilse veya analiz için düz bir yüzey isteniyorsa, peleti donmuş halde tutan dökme silindirik bir pelet hazırlanmalıdır. Hücre peleti parçalanırsa, aşağıdaki adımlar inert bir atmosferle tamamen temizlenmiş bir torpido gözünde ideal olarak kullanılabilir.
- Dökme dondurulmuş silindirik peletlerin hazırlanması
- Numuneyle temas edecek manuel hidrolik presin tüm parçalarını LN2'ye daldırın (Şekil 3A; 3 veya 5 mm çapında pelet kalıpları, kalıp, piston/tel çekme).
- Hızla donan pelet parçalarını, uygun pelet kalıpları ile yüklenen kalıba aktarın (Şekil 3B).
- Hidrolik pres ile hızlı peletleme. 5 mm çapında bir pelet için 1,5 ton veya 3 mm çapında bir pelet için 0,5 ton kullanılması yeterlidir (Şekil 3C).
NOT: Hidrolik pres ile her pelet hazırlığından sonra, kalan don ve nemle ilgili herhangi bir sorunu önlemek için tüm malzemelerin çözülmesi ve azot gazı kullanılarak uygun şekilde kurutulması gerekir. - Dondurulmuş hücrelerin toplu peletini hızlı bir şekilde toplayın ve depolama için yeterli bir kriyotüp içine yerleştirin.
- Uzun süreli depolama için LN2 tankına geri saklayın.
- Kriyo-peletleri analiz için aktarın ve monte edin. LN 2 soğutmalı kriyotüpte depolanan pelet, sıvıN2'deki 77 K önceden soğutulmuş kriyostat numune tutucusunaaktarılır (Şekil 4, bir CRG-FAME-UHD ışın hattı için kullanıldığı gibi). Bu adım mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir, ancak birkaç dakika sürebilir. Daha sonra numune tutucuyu kriyostata aktarın ve tüm XAS analizi sırasında 10 K'da tutun.
NOT: 1.9.3 ve 1.9.6 adımları zordur, çünkü pistonu ve kalıbı tıkayacak herhangi bir donma oluşumunu önlemek için hızlı bir şekilde yapılması gerekir. Bir alternatif, bu adımları azot gazı ile tamamen temizlenmiş plastik bir çadır altında gerçekleştirmektir. LN2 soğutmalı bakır kütle, peletin donmuş halde tutulmasını sağlar.
2. Demir türleşmesi için plankton hücrelerinin hazırlanması
NOT: Bu protokol için kullanılan sentetik deniz suyu, ultra saf su deniz tuzları, morfolino propansülfonik asit, amonyum nitrat, sodyum nitrat, sodyum metasilikat pentahidrat, sodyum fosfat monobazik, vitamin stoğu, eser metal stoğu, antibiyotik stoğu ve pH = 7.9'da HEPES tamponu eklenerek hazırlanmıştır. Her bileşenin konsantrasyonları Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Kültürle ilgili ayrıntılar Sutak ve ark.11'de bulunabilir.
- Bir P. tricornutum diatom kültürünü 50 mL'lik bir polipropilen tüpte 1.100 x g'de 6 dakika boyunca santrifüj edin ve peleti taze ortama sahip bir şişeye aktarın.
- Kültürün sentetik deniz suyunda 24 saat boyunca bir büyüme odasında büyümesine izin verin.
- Plankton kültürünü 1.100 x g'de 6 dakika boyunca santrifüj edin ve peleti Fe-sitrat içeren taze ortama aktarın (son kültürde 1 μM). 72 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- Plankton hücrelerini hazırlayın
- Hücreleri 1.100 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve demirsiz bir ortamla durulayın.
- Peleti 1,5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın, ultra saf suyla yıkayın ve 1.100 x g'da 3 dakika boyunca 2x santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın.
- LN2'deki peleti içeren 1.5 mL polipropilen tüpün alt kısmını, adım 1.8'de açıklandığı gibi daldırın.
- Dondurulmuş hücreleri LN2 dondurulmuş bir kalıp makinesine aktarın ve adım 1.9'da açıklandığı gibi bir XRF pelet presi (Şekil 3 ve Şekil 7) kullanarak hızlı bir şekilde bastırın.
- Peleti çıkarın ve uzun süreli depolama için bir LN2 tankında saklayın.
- Adım 1.9.6'yı izleyin (kriyostat numune tutucusuna aktarım için Şekil 4'e bakınız).
3. Referans bileşik hazırlama ve ölçme
NOT: Türleri temsil eden ve biyolojik sistemde bulunması beklenen referans bileşikler (katı veya sıvı), deneysel biyolojik örneklerle karşılaştırılmak üzere XAS tarafından hazırlanmalı ve analiz edilmelidir. Referans spektrumları 12,13,14 veritabanlarında da bulunabilir ve ölçüm koşullarının (örneğin, spektral çözünürlük) deneysel örneklere benzer olması koşuluyla kullanılabilir.
- Sulu çözeltideki referanslar için, ilk bileşikleri anaerobik koşullar veya inert atmosfer altında toz veya sıvı halde tartın. Herhangi bir oksido-indirgeyici reaksiyondan kaçınmak ve bileşiğin kimyasal bütünlüğünü korumak için inert bir atmosferde (yani, anaerobik bir torpido gözünde veya bir Schlenk hattında, bakınız Şekil 5 ve Şekil 6) redoksa duyarlı referanslar hazırlayın. ortam havasında oldukça reaktif ve kararsız olabilir). Burada, tüm selenyum referansları bir Schlenk hattı kullanılarak hazırlandı ve gazdan arındırılmış ultra saf su (Şekil 6). Sıvı FeIII-malat ve ferritin ortam havasında hazırlandı.
- Floresan modunda toplanmak üzere çalışılan elementin (yani selenyum veya demirin) ağırlıkça% 1'lik bir nihai konsantrasyonuna ulaşmak için uygun çözelti ile karıştırın.
NOT: Ultra saf su, XAS referanslarını hazırlamak için en sık kullanılan çözümdür. Buz kristalleri tarafından X-ışını kırınımından kaynaklanan artefaktları önlemek ve katı hal dedektörü ile toplanan XAS sinyalinin kalitesini korumak için standart XAS floresansı kullanılarak ölçülen sıvılar için gliserol ilavesi (% 15-% 20) gereklidir. Bununla birlikte, HERFD-XAS için gliserol zorunlu değildir. Bir katı hal dedektörü yerine bir kristal analizörü spektrometresi kullanılarak, enerji son derece yüksek çözünürlüklü olarak seçilir ve buz kristalleri tarafından indüklenen kırınım, çalışılan element1'in veri toplamasını etkilemez. - Hazırlanan çözeltiyi, numunelerle aynı koşullarda ölçüm yapana kadar kapalı bir Schlenk balonunda (Şekil 5) veya 1,5 mL'lik bir polipropilen tüpte saklayın ve saklayın.
- Katı referanslar için, selenyum veya demir model bileşik tozları, türler redoksa duyarlıysa ortam havasında veya torpido gözünde tartın. Burada, katı FeII referansları (Fe II-asetat ve vivianit) gaz halindeki bir N2 torpido gözünde, FeIII (Fe (OH) 3 ve FeIII-fosfat) ise ortam havasında hazırlanmıştır.
- Yüksek saflıkta bor nitrür tozunu tartın ve çalışılan elementin ağırlıkça% 1'lik bir nihai konsantrasyonuna ulaşmak için model bileşikleri tozlarıyla karıştırın (Şekil 7A).
- En az 15 dakika boyunca bir harç kullanarak ince bir toza öğütün.
- Hidrolik pres ile peletleri hazırlamak için toz karışımını kalıpçıya yerleştirin (Şekil 7B, numune peleti için Şekil 3A'ya benzer).
- Kalıpçıyı pistonla kapatın (Şekil 7C, numune pelet için Şekil 3B'ye benzer).
- Dökme pelet elde etmek için basın (Şekil 7D, numune pelet için Şekil 3C'ye benzer).
- Hazırlanan dökme peletleri, numunelerle aynı koşullarda analiz edilene kadar torpido gözünde saklayın.
NOT: Dökme pelet bazen toz birliğine bağlı olarak pistonlara yapışır. Daha sonra kırmadan yumuşak bir şekilde çıkarmak zor olabilir. Bu durumda, poliimid (örneğin, Kapton) diskleri kullanan aşağıdaki prosedür kullanılmalıdır. - Tozla temas edecek pistonların her iki tarafına bir damla etanol koyun (Şekil 8A).
- Pistonlardan biraz daha küçük bir çapa sahip iki poliimid disk hazırlayın. Poliimid kalınlığının 10-25 μm olması gerekir (daha ince manipüle edilmesi zor olacaktır, daha kalın analiz sırasında X-ışını fotonlarının çok fazlasını emer).
- Diskleri pistonlara yerleştirin. Kılcal hareketle yapışırlar (Şekil 8B).
- Kalıpçıyı pistonla monte edin, tozu ekleyin ve ikinci pistonu takın (Şekil 8C).
- Presleyin (bkz. adım 3.11) ve sıkıştırılmış dökme pelet pistonlardan çıkarın.
NOT: Katı referanslar, numuneler gibi kriyostata özgü numune tutucuya monte edilebilir (bkz. adım 1.8.6). Sıvı referansları kriyostata özgü numune tutucuya monte edilebilir. CRG-FAME kriyostat numune tutucu için Şekil 9A'ya bakınız. Aynı prosedür, aşağıdaki prosedür kullanılarak Şekil 4D'de gösterilen bir CRG-FAME-UHD numune tutucu kullanılarak uygulanabilir. - Kriyostat numune tutucu üzerine sıvı referansının montajı.
- RT'de numune tutucudaki deliğin bir tarafını kapatmak için poliimid (örneğin Kapton) bandı (25 μm kalınlığında) ayarlayın (Şekil 9B).
- Bir şırınga kullanarak, boşluğu tepeye ulaşana kadar çözelti ile yavaşça doldurun. Kabarcıklardan kaçının. Rezervuar doldurulmalıdır (Şekil 9C, sol).
- Boşluğun diğer tarafını bantla kapatın (Şekil 9C, sağda).
- Kapalı numune tutucuyu LN2'ye daldırın (Şekil 9D, T0-T 3).
- Termik bir reaksiyon LN2'nin köpürmesine neden olur. Köpürme durana kadar bekleyin ve reaksiyonun sonunu işaret edin (Şekil 9D, T3-T 5).
- Veri toplamaya başlamadan önce (Şekil 9D, T6) veya LN2 Dewar'da depolamadan önce 77 K'daki numune tutucuyu ışın hattının kriyostatına aktarın.
NOT: Dondurulmuş çözelti boşluğa iyi yayılır ve düzgün ve homojen bir pelet oluşturur (Şekil 9D, T7).
4. HERFD-XAS: ölçüm prosedürü
- Bragg koşullarında CAS'taki tüm kristalleri, ilgilenilen floresan hattı enerjisine göre optimize edin. Bu prosedür konsantre bir referans bileşiği ile yapılabilir.
- Gelen tek renkli ışın enerjisini, absorpsiyon kenarının enerji konumunun bilindiği bir referans kullanarak kalibre edin (tipik olarak saf metalik bir folyo). Bu referans, elde edilen her spektrum için kalibrasyonu kontrol edebilmek ve sonunda işlem sonrası bunları hizalayabilmek için numuneden sonra ikinci bir adımda, çift iletim modunda konumlandırılabilir.
- Adım 1.9.6'da açıklanan uygun prosedürü izleyerek numuneyi biyolojik numuneler için sıvı helyum kriyostat içine yerleştirin.
- Senkrotron güvenlik kurallarını izleyerek deneysel kulübeyi kapatın.
- XAS alımını, seçilen absorpsiyon kenarını kapsayan bir enerji aralığında gerçekleştirin.
- Her spektral kazanımdan sonra, yeni bir edinime başlamadan önce numuneyi ışın boyutunun en az iki katı kadar hareket yönünde hareket ettirin.
NOT: Bu durumda, ölçümler Fe K a 1 çizgisini seçmek için Ge(440) kristalleri kullanılarak ve Se Ka1 çizgisini seçmek için Ge(844) kristalleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Numune üzerindeki ışın boyutu 200 x 100 μm² (Y x V Tam Genişlik Yarım Maksimum) idi. Her bir kazanım arasındaki numune hareketi, yapısal homojenliği araştırmak ve her seferinde önceki olası radyasyon hasarından arındırılmış yeni bir alanı analiz etmek için her iki yönde de 500 μm idi. Bireysel spektrumlar, gürültü içinde üst üste binebilirse karşılaştırılır ve birleştirilir. Birleştirilmiş spektrumun kalitesi doğru olduğunda belirli bir numune için ölçüm durdurulur. Daha sonra veri analizi, XAS analizine adanmış herhangi bir yazılım, özellikle normalleştirilmiş spektrumların doğrusal bir kombinasyon uyumuna izin verenler, örneğin Athena ve Artemis (Demeter yazılım grubu)15, SixPack 16 veya Viper17 kullanılarak gerçekleştirilebilir. XAS analizinin tam ve ayrıntılı açıklamaları bu protokolün kapsamı dışındadır ve bazıları daha spesifik olarak biyolojik örneklere ayrılmış olan18,19 numaralı son makalelerde bulunabilir20. Selenyum XANES referans spektrumları zaten SSHADE spektrum veritabanı21'de toplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu preparatların temel amacı, selenyum nanopartikülleri (Se-NP'ler) ve kanser hücreleri arasındaki etkileşimi ve fitoplanktonlarda demir bağlama ve sekestrasyonunu araştırmaktı.
Selenyumun başlangıç halindeki (BSA Se-NP'ler) ve besleyici ortamda inkübe edilen hücrelerdeki (24 saatlik inkübasyondan sonra BSA Se-NP'ler) HERFD-XANES spektrumları Şekil 10'da gösterilmiştir. Sonuçlar, ilk Se-NP'lerdeki selenyumun hem Se (0) hem de selenit benzeri formlar olarak mevcut olduğunu, PC-3 hücreleri ile etkileşimlerden sonra hücrelerdeki selenyumun esas olarak Se (0) olarak mevcut olduğunu ve böylece hücrelerdeki selenyum türlerinin değiştiğini gösterdiğini göstermiştir. Demir için, referansların HERFD-XANES spektrumları, demir oksidasyon durumuna bağlı olarak farklı kenar konumları gösterdi ve azaltılmış demir türleri düşük enerji değerlerine geçti (Şekil 11). Bir diatom peletinin aynı pozisyonunda toplanan iki ardışık spektrum benzerdi, bu da 10 K'da bir He-kriyostat kullanıldığında ışın hasarının iki kazanım arasında sınırlı olduğunu gösteriyordu. Ayrıca, diyatom peletinin farklı konumlarından gelen spektrumlar (burada üç konum) aynıydı, bu da örnek peletin homojen olduğunu ve spektrumların daha iyi bir sinyal-gürültü oranı spektrumu (ortalama spektrum) elde etmek için ortalamasının alınabileceğini gösterdi. Diatomlar için ortalama spektrum, çoğunlukla Fe (III) 'e karşılık gelen kenar özelliklerini gösterir. Daha sonra Sarret ve ark.6'da açıklandığı gibi demir türlerinin oranını ölçmek için referans spektrumlarının doğrusal kombinasyon uyumu gerçekleştirildi.
Resim 1: Tipik hücre peletleri. Sırasıyla 8 x 106 hücre ve 1 x 107 hücre içeren 1.5 mL polipropilen tüpler (OVCAR-3 hücreleri solda, PC-3 hücreleri sağda). Kredi: Caroline Bissardon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Anaerobik torpido gözünde hazırlık. (A) Tamamen sıvı LN 2'ye batırılmış (B) 1,5 mL polipropilen tüp rafı (mavi) içeren anaerobik torpido gözü. Sıvı LN2, netlik için resimde sunulmamıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre peletleme şeması. (A) Yüklemeden önce preste numune peleti. (B) Yükleme sırasında numune. (C) Yüklemeden sonra numune dökme pelet. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kriyo-numunelerin montajı. ESRF'de BM16 XAS ışın hattına özgü numune tutucuya montaj. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Referans çözeltinin anoksik hazırlanması. Schlenk balonlarında saklanan selenyum referans preparatlarına örnekler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Referans çözeltilerin anoksik hazırlanması için kurulum. Schlenk rampasının sağdaki şişede gazdan arındırılmış ultra saf su ile kurulumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Katı referans peletinde hazırlama. Toz bileşikleri için ortam havasında veya torpido gözünün altında preslenmiş silindirik peletlerin hazırlanması. (A) Referans tozun ağırlığı. (B) Pres desteğinin silindirik deliğindeki toz. (C) Kapalı basın desteği. (D) Presleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Poliimid diskler kullanılarak katı referans peletinin hazırlanması. Yapışkan veya kırılgan toz bileşikleri için preslenmiş silindirik peletin hazırlanması. (A) Tozla temas edecek pistonların her iki tarafındaki bir damla etanol, pistonlar üzerindeki poliimid disklerin kendilerine yapışmasını sağlayacaktır (B). Kalıp kalıp piston ile monte edilir. Daha sonra, toz biriktirilebilir ve kalıpçı ikinci piston (C) ile kapatılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Bir sıvı referansı veya numune için kriyostat numune tutucusu için hazırlık adımları. Görüntü netliği için, fotoğraflar torpido gözünün dışında ve tehlikeli maddeler olmadan çekilmiştir. Burada ddH2O su kullandık. Gerekirse, bu hazırlık bir torpido gözü veya inert atmosfer (N2) plastik çadır altında yapılabilir. (A) Numune tutucu. (B) Deliği kapatmak için kavisli yüzeye poliimid bant yerleştirin. (C) Boşluk dolana kadar bir şırınga kullanarak referans çözeltileri damla damla yavaşça enjekte edin. Hava kabarcıkları kalmamalıdır. Diğer deliği poliimid bantla kapatın. (D) LN2'ye dalma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 10: Se K-edge tipik HERFD-XANES analizi. BSA kaplı Se-NP'lerin Se K-edge HERFD-XANES'i, hücre kültürü ortamında 24 saat alınıp bırakıldığı gibi ve PC-3 hücresi BSA kaplı Se-NP'lere maruz kalır. Spektrumlar netlik için kaydırılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 11: Fe K-edge tipik HERFD-XANES analizi. Planktondaki demir türleşmesi üzerine yaptığımız deney sırasında toplanan spektrumlara örnek. Altı üst spektrum referanslara/standartlara karşılık gelir. Üst üste bindirilmiş spektrumlar (kırmızı ve siyah renkte), peletin aynı pozisyonunda toplanan iki spektruma karşılık gelir. Pos # 1, pos # 2 ve pos # 3 etiketli spektrumlar, örnek peletin üç farklı pozisyonunda toplandı. Diatoms Average adı verilen spektrum, peletin çeşitli konumlarında toplanan ortalama spektrumlara karşılık gelir ve türleşmenin belirlenmesi gereken örnektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ürünler | PC3 hücre hattı | OVCAR3 hücre hattı |
| ATCC modifiye RPMI 1640 orta | 445 dev/dak | 394,5 milyon L |
| Fetal sığır serumu | 50 mL | 100 mL |
| Penisilin-Streptomisin | 5 mL | 5 mL |
| Sığır insülini | - | 500 μL |
Tablo 1. Hücre kültürü ortam hazırlama. Hücreler, PC-3 prostat kanseri hücreleri için %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (PS) ve OVCAR-3 yumurtalık kanseri hücreleri için %20 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ve 0.01 mg/mL sığır insülini ile desteklenmiş Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) modifiye RPMI 1640 ortamında kültürlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, X-ışını absorpsiyon spektroskopisi ile biyolojik örneklerde selenyum ve demirin kimyasal formunu incelemek için kullanılmıştır. Biyolojik numunelerin ve referans bileşiklerin kriyo-hazırlanması ve depolanmasının yanı sıra HERFD-XAS ölçümlerine odaklanmaktadır.
Kriyo-hazırlama ve depolama
Toplu biyolojik numune peletlerinin kriyo-hazırlanması, numunelerde bulunan türlerin kimyasal bütünlüğünün korunmasını sağlar. Bu çok önemlidir, çünkü hazırlama için dondurarak kurutma veya hava kurutmada kullanıldığında türleşme değişiklikleri gözlenmiştir6. Bu protokol, ölçümler için seçilen ışın çizgisi bir helyum kriyostat ile donatılır donatılmaz kullanılmalıdır.
Referans bileşikler için, oksidasyon durumunu korumak için redoksa duyarlı elementler kullanılırken anoksik bir atmosferde çalışmak gerekir. Bu daha sonra demir ve ferrik referans bileşikleri için gösterildiği gibi spektral kenar pozisyonundaki değişikliklerle kontrol edilebilir (Şekil 11).
Bu numune hazırlama, senkrotron veya laboratuvar analizinden önce gerçekleştirilebilir. Bu durumda, dondurulmuş pelet veya referans bir kriyotüp içine aktarılmalı ve bir LN2 tankında saklanmalıdır. Bu LN2 depolaması, koruyucu bir inert ortam sağlamak ve özellikle reaktif demir veya seleno-bileşikler için kimyasal türlerdeki değişiklikleri önlemek için zorunludur. Tercihen, numuneler ölçümden hemen önce hazırlanmalı veya analizden birkaç gün önce saklanmalıdır. Numuneleri uzun süre (yani aylarca) saklamamak en iyisidir.
Kriyo-analizi
Düşük sıcaklıklarda, ideal olarak 10 K'da analiz, yoğun X-ışını ışınının, özellikle de suyun hidrolizinden serbest radikallerin oluşumunun neden olduğu hasarı yavaşlatmak için protein matrisine zarar verebilecek ve geçiş metal iyonlarının fotoredüksiyonunu veya kükürt22 gibi elementlerin fotoredüksiyonunu oluşturabilecek şekilde şiddetle savunulmaktadır. XAS spektrumunun hızlı bir şekilde elde edilmesi yoluyla kimyasal türlerdeki bu olası değişiklikleri dikkate almak en iyisidir. Numune ayrıca her spektrum için ışınlanmamış bir alanı ortaya çıkarmak için taranmalıdır. Fitoplankton peletinin üç farklı pozisyonunda toplanan spektrumların gösterdiği gibi (Şekil 11), böyle bir strateji, daha sonra daha iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için ortalaması alınabilen güçlü spektrumları ortaya koymaktadır.
Gelecekteki uygulamalar
Çalışmamızda, HERFD-XAS ölçümlerine adanmış bir ışın hattı kullandık (FAME-UHD, ESRF, Fransa) ancak biyolojik numune hazırlama için bu protokol, çok elemanlı Ge Katı Hal Dedektörü veya Silikon-Sürüklenme Dedektörü gibi diğer dedektör türlerini kullanırken, kriyostat ile donatılmış herhangi bir standart XAS ışın hattına uygulanabilir. Önerilen iş akışı, X-ışını absorpsiyon spektroskopisi ile incelenmesi beklenen diğer kimyasal elementlere veya herhangi bir biyolojik materyale de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
CEMHTI (Orleans, Fransa, ANR-13-BS08-0012-01) ve Labex OSUG@2020 (Grenoble, Fransa, ANR-10-LABX-0056) tarafından ışın hattı gelişimine yapılan finansal katkılar için minnettarız. FAME-UHD projesi, Fransız "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG konsorsiyumu ve INSU CNRS Enstitüsü tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Deneyler sırasındaki tüm katkılardan, özellikle BM30B ve BM16 üzerinde çalışan tüm kişilere minnettarız. Yazarlar, senkrotron radyasyon ışın süresinin sağlanması için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'ni kabul etmektedir. Ayrıca finansal destek için PHYTOMET ANR projesini (ANR-16-CE01-0008) ve finansal destek için SEDMAC projesini (INCA-Plan kanser-ASC16019CS) kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V.
- Newville, M.
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
