Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

जैविक नमूने उच्च संकल्प एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर क्रायोजेनिक तापमान पर प्रजातियों के लिए तैयारी

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/60849
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 4,5, 4,5, 1,6
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

Summary

यह प्रोटोकॉल सिंक्रोट्रॉन-आधारित एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए जैविक क्रायोसम्पल तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। हम कैंसर और फाइटोप्लांकटन कोशिकाओं के साथ प्रोटोकॉल के उदाहरणों के साथ नमूना तैयारी और क्रायोप्रिजर्वेशन को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों का वर्णन करते हैं। यह विधि नमूना क्रायो-तैयारी का एक सार्वभौमिक मानक प्रदान करती है।

Abstract

एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (एक्सएएस) वाले तत्वों का अध्ययन जैविक प्रणालियों में धातुओं की भूमिका का अध्ययन करते समय विशेष रुचि का है। नमूना तैयारी एक महत्वपूर्ण और अक्सर जटिल प्रक्रिया है, विशेष रूप से जैविक नमूनों के लिए। यद्यपि एक्स-रे विलक्षणता तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन तकनीक के उपयोगकर्ताओं के लिए अभी तक कोई विस्तृत प्रोटोकॉल प्रसारित नहीं किया गया है। इसके अलावा, रासायनिक राज्य संशोधन चिंता का विषय है, और क्रायो-आधारित तकनीकों को कोशिकाओं या ऊतकों की रासायनिक अखंडता का अधिकतम संरक्षण प्रदान करने के लिए उनके निकट-देशी हाइड्रेटेड राज्य में जैविक नमूनों का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है। यहां, हम क्रायो-संरक्षित नमूनों के आधार पर एक सेलुलर तैयारी प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। यह एक उच्च ऊर्जा संकल्प प्रतिदीप्ति कैंसर कोशिकाओं में सेलेनियम के एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन और फाइटोप्लांकटन में लोहे के एक अध्ययन का पता लगाया में प्रदर्शित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य जैविक नमूनों और अन्य एक्स-रे तकनीकों के साथ किया जा सकता है जिन्हें विकिरण द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है।

Introduction

आवश्यक या विषाक्त तत्वों के सेलुलर बायोट्रांसफॉर्मेशन के अध्ययन के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ विलक्षणता तकनीकों की आवश्यकता होती है और नमूना तैयारी के चरणों को कम करना चाहिए जो अक्सर रासायनिक प्रजातियों के संशोधन के लिए प्रवण होते हैं।

सेलेनियम और लोहे जैसे शारीरिक तत्वों को उनके जटिल रसायन विज्ञान, सेलेनियम या लोहे की प्रजातियों की विभिन्न स्थिरताओं, और पीपीएम (मिलीग्राम / किग्रा) या यहां तक कि उप-पीपीएम रेंज में उनकी कम एकाग्रता के कारण विशेष रूप से निर्दिष्ट करना मुश्किल माना जाता है। इस प्रकार, एक्सएएस द्वारा इन तत्वों की प्रजाति का अध्ययन बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है। सिंक्रोट्रॉन एक्सएएस और विशेष रूप से उच्च ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति का पता लगाया एक्सएएस (एचईआरएफडी-एक्सएएस), जो बहुत कम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात1 की अनुमति देता है, सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर जटिल जैविक आव्यूहों 2,3 में अत्यधिक पतला तत्वों को निर्दिष्ट करने के लिए उपलब्ध हैं। पारंपरिक प्रतिदीप्ति-XAS माप एक ऊर्जा बैंडविड्थ ~ 150-250 eV के साथ एक ऊर्जा हल ठोस राज्य डिटेक्टर (SSD) का उपयोग करके किया जा सकता है, CRG-FAME बीमलाइन पर यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF)4 पर, जबकि HERFD-XAS माप एक क्रिस्टल विश्लेषक स्पेक्ट्रोमीटर (CAS) की आवश्यकता होती है, एक ऊर्जा बैंडविड्थ ~ 1-3 eV के साथ, CRG-FAME-UHD बीमलाइन पर ESRF2 पर CRG-FAME-UHD बीमलाइन पर . प्रतिदीप्ति फोटॉनों को क्रमशः इलेक्ट्रॉनिक या ऑप्टिकल प्रक्रियाओं के साथ उनकी ऊर्जा के संबंध में भेदभाव किया जाता है।

नमूना क्रायो-तैयारी संरचनाओं को संरक्षित करने और रचनात्मक रासायनिक अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, इस प्रकार जैविक मूल राज्य 5 के करीब विश्लेषण की अनुमति देताहै। इसके अलावा, तरल हीलियम क्रायोजेनिक कूलिंग (एलएन 2) का उपयोग करके 10 K के रूप में कम क्रायोजेनिक तापमान पर किए गए विश्लेषण, विकिरण क्षति को धीमा करने और एक्सएएस के लिए मौलिक प्रजातियों को संरक्षित करने की अनुमति देते हैं। यद्यपि जैविक नमूनों पर लागू एक्सएएस तकनीकों पर कुछ समीक्षाएं क्रायोजेनिक स्थितियों में नमूनों को तैयार करने और उनका विश्लेषण करने की आवश्यकता की रिपोर्ट करती हैं (उदाहरण के लिए, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), उनमें से कोई भी स्पष्ट रूप से संबंधित विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन नहीं करता है। इस प्रकाशन में, कैंसर कोशिकाओं और प्लवक सूक्ष्मजीवों की क्रायो-तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन क्रायोजेनिक तापमान पर Se8 और Fe9 के HERFD-XAS प्रजाति के लिए किया गया है।

अत्याधुनिक एक्सएएस स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के दौरान नमूना तैयारी और पर्यावरण के लिए अच्छा अभ्यास 1) एक सेटअप की आवश्यकता होती है; 2) एक विश्लेषण प्रक्रिया जो विकिरण क्षति के प्रभावों को यथासंभव सीमित करती है; और 3) एक्स-रे फोटॉन बीम आकार के संबंध में जितना संभव हो उतना सजातीय एक नमूना (या मॉडल यौगिक संदर्भ)। पहले आइटम को कम तापमान पर अधिग्रहण करके, एक तरल हीलियम क्रायोस्टेट का उपयोग करके ध्यान में रखा जाता है। दूसरे आइटम को बीम के संबंध में इसे स्थानांतरित करके नमूने के एक नए क्षेत्र पर प्रत्येक अधिग्रहण का प्रदर्शन करके निपटाया जाता है। अंत में, तीसरी स्थिति को ध्यान में रखते हुए, नमूनों (छर्रों) और संदर्भों (पाउडर) को दबाए गए थोक छर्रों में वातानुकूलित किया जाता है ताकि जितना संभव हो सके पोरोसिटिज़ और असमरूपताओं को सीमित किया जा सके, और एक्स-रे जांच किए गए नमूना सतह पर बीम आकार के संबंध में खुरदरापन से बचने के लिए। हम बताते हैं कि प्रोटोकॉल इन सभी बिंदुओं से कैसे निपटता है।

हमने मानव प्रोस्टेट सेल लाइन पीसी -3 (उच्च मेटास्टैटिक क्षमता) और डिम्बग्रंथि सेल लाइन ओवीसीएआर -3 (जो सभी डिम्बग्रंथि के कैंसर के मामलों के 70% तक के लिए खाता है) का उपयोग किया, ताकि सेलेनियम नैनोकणों (से-एनपी) की कैंसर कोशिकाओं के प्रति एंटीप्रोलिफेरेटिव गुणों की जांच की जा सके, और फाइटोप्लांकटन में लोहे के सीक्वेंसिंग की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रजाति के रूप में फेओडैक्टिलम ट्राइकोर्नटम डायटम।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेलेनियम प्रजाति के लिए मानव पीसी -3 और OVCAR-3 कैंसर सेल छर्रों की तैयारी

नोट:: निम्न प्रोटोकॉल Weekley et al.10 से अनुकूलित है। सभी चरणों को जैव सुरक्षा स्तर 2 स्थितियों और प्रतिबंधों के तहत एक सेल संस्कृति हुड के तहत किया जाना है, एसेप्टिक तकनीकों का उपयोग करके।

  1. एक Malassez सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें। पीसी -3 सेल लाइन के लिए प्रति फ्लास्क 150,000-200,000 कोशिकाओं और OVCAR-3 सेल लाइन के लिए 300,000 कोशिकाओं के बीज।
  2. T-75 फ्लास्क में बीज कोशिकाएं (तीन फ्लास्क प्रति शर्त के लिए प्रतिलिपि बनाने के लिए) पर्याप्त सेल संस्कृति मीडिया (तालिका 1) में लैमिनर प्रवाह हुड के तहत।
  3. सेल संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में बढ़ने के लिए छोड़ दें और 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफाइड वातावरण जब तक वे 80% संगम तक नहीं पहुंच जाते। आमतौर पर, पीसी -3 प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनें 24 घंटे के बाद दोगुनी हो जाती हैं जबकि ओवीसीएआर -3 डिम्बग्रंथि कैंसर सेल लाइनों में 72 घंटे लगते हैं। फ्लास्क को इनक्यूबेटर में छोड़ दिया जाना चाहिए।
  4. इस बीच, एक अंतिम एकाग्रता के लिए उपचार के लिए उपयोग किए जाने वाले से-एनपी को पतला करें जो आईसी 20 (20% सेल मृत्यु प्राप्त करने के लिए निरोधात्मक एकाग्रता) से मेल खाती है जो एमटीटी (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) द्वारा साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए परख द्वारा पूर्वनिर्धारित किया गया है। ये सांद्रता प्रत्येक से-एनपी प्रकार के लिए विशिष्ट हैं, लेकिन अध्ययन किए गए सेल लाइन के लिए भी विशिष्ट हैं।
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए अल्ट्रासाउंड पानी के स्नान में नैनोपार्टिकल स्टॉक समाधान (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन [बीएसए] या चिटोसन लेपित से-एनपी) के 2 मिलीग्राम / एमएल रखें।
    2. काम की सांद्रता तक पहुंचने के लिए पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम में सीरियल dilutions द्वारा Se-NPs समाधान पतला. प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच, 1 मिनट के लिए भंवर।
  5. उपचार के लिए पतला सेलेनियम नमक के साथ एक सेलेनियम सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें।
    1. एक 15 mL पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में एक जलीय सोडियम सेलेनाइट स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। 1 मिलीग्राम सोडियम सेलेनाइट पाउडर को 1 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी के साथ मिलाएं।
    2. भंवर 1 मिनट के लिए स्टॉक समाधान.
    3. काम सांद्रता तक पहुंचने के लिए पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम में सीरियल dilutions द्वारा सोडियम सेलेनाइट स्टॉक समाधान पतला।
      नोट: समाधान homogenize करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने से पहले कई बार pipet करने के लिए मत भूलना।
  6. सेलेनियम उपचार के लिए कैंसर कोशिकाओं को उजागर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग को परीक्षण किए गए प्रत्येक नैनोपार्टिकल (एनपी) के लिए दोहराया जाना चाहिए। यहां, एनपी दो प्रकार के होते हैं, बीएसए और चिटोसन लेपित से-एनपी, साथ ही नियंत्रण। सोडियम सेलेनाइट समाधान सकारात्मक नियंत्रण है और कोई भी उपचार नकारात्मक नियंत्रण नहीं है।
    1. तीन टी -75 फ्लास्क खोलें जिसमें लैमिनर प्रवाह हुड में कोशिकाएं होती हैं।
    2. माध्यम को निकालें और कोशिकाओं को धीरे से 2x को 5 मिलीलीटर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ धोएं।
    3. धीरे से, फ्लास्क के नीचे की ओर और सीधे सेल परत पर नहीं, 25 एमएल बाँझ प्लास्टिक पिपेट्स से लैस एक स्वचालित पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक फ्लास्क में उपचार के 15 मिलीलीटर जोड़ें। ढक्कन को फ्लास्क पर रखें। ढक्कनों को कसकर बंद न करें।
      नोट: जैसा कि चरण 1.3 और 1.4 में वर्णित है, उपचार समाधान ों को homogenized होने के लिए पहले से ही पुन: निलंबित किया जाना चाहिए।
    4. तीन फ्लास्क को क्षैतिज रूप से एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ ह्यूमिडिफाइड वातावरण।
  7. सेल छर्रों की तैयारी
    1. धीरे से T75 फ्लास्क में सीधे गर्म PBS (37 °C) के 5 mL के साथ कोशिकाओं 2x धोलें।
    2. 10 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक पिपेट्स से लैस एक पिपेट लड़के का उपयोग करके टी -75 फ्लास्क में सेल परत पर गर्म सेल संस्कृति माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के 6 एमएल जोड़ें।
    3. एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर कोमल स्क्रैपिंग द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। फ्लास्क प्रति एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
    4. एक पिपेट लड़के और एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके, तरल को एस्पिरेट करें और सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए फ्लास्क सतह पर सेल / माध्यम को वापस फ्लश करें। कोशिकाओं को अलग करने और वैयक्तिकृत करने के लिए इस चरण को कई बार दोहराएं। एक 15 mL polypropylene ट्यूब में कोशिकाओं युक्त माध्यम ले लीजिए.
    5. RT पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर नीचे स्पिन करें। Supernatant Aspirate।
    6. पीबीएस के 5 मिलीलीटर में उन्हें फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को कुल्ला।
    7. RT पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर नीचे स्पिन करें। Aspirate supernatant और उपचार के सभी शेष निशान से छुटकारा पाने के लिए चरण 1.6.5 और 1.6.6 2x को दोहराएं।
    8. पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंत में, RT पर 5 मिनट के लिए उन्हें 250 x g पर नीचे घुमाएं। चित्र 1 supernatant को centrifuging और त्यागने के बाद प्राप्त सेल गोली का प्रतिनिधित्व करता है।
    9. धीरे एक 200 μL पिपेट का उपयोग कर सभी PBS supernatant निकालें.
      नोट: स्पर्श और सेल गोली को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहें। आदर्श रूप से, गोली 2-3 मिमी उच्च या मोटी होनी चाहिए, जिसमें 3-6 मिमी का व्यास होना चाहिए। पीसी -3 सेल लाइन के लिए, 9 x 106-10 x 106 कोशिकाओं परख के लिए आवश्यक हैं। OVCAR-3 सेल लाइन के लिए, 8 x 106–9 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है (चित्र1)। कुछ कोशिकाओं की संभावना बाद के बफर rinsing चरणों के दौरान खो जाएगा। सेल संख्या जितनी अधिक होगी, पैलेट उतना ही बेहतर होगा।
  8. सेल छर्रों की फ्लैश-फ्रीजिंग
    1. तरल नाइट्रोजन (एलएन2) में गोली युक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के निचले हिस्से को सेल पैलेट के स्तर पर डुबोएं।
    2. नाइट्रोजन गैस जैसे एक निष्क्रिय वातावरण के साथ पूरी तरह से शुद्ध एक दस्ताने बॉक्स में, एलएन 2-कूल्ड कॉपर ब्लॉक (चित्रा 2) की सपाट सतह पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को धीरे से टैप करके सेल पैलेट को इकट्ठा करें। गोली तब सेल हानि के बिना एकत्र किया जाता है।
      नोट: क्रायोप्रोटेक्शन उपकरण, लैब कोट, बंद जूते, क्रायो-दस्ताने, और एलएन2 हैंडलिंग के लिए एक फेस शील्ड या सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें।
    3. यदि आवश्यक हो, तो एक एलएन2 ठंडी सुई का उपयोग गोली को बाहर निकालने में मदद करने के लिए किया जा सकता है।
      नोट: परिणामी जमे हुए सेल गोली टुकड़ा कर सकते हैं। इन चरणों को कुछ मिनटों के अंतराल में किया जाना चाहिए और शोधकर्ता की निपुणता और गति पर भरोसा करना चाहिए।
    4. जमे हुए गोली आयाम cryostat नमूना धारक फिट होना चाहिए. वर्णित उपकरण का उपयोग करके, यदि सेल पैलेट ऊंचाई में 2 मिमी से बड़ा है और एक्सएएस के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूना धारक के छेद से थोड़ा छोटा है, तो नमूना सीधे उपयोग किया जा सकता है। यदि नहीं, या यदि विश्लेषण के लिए एक सपाट सतह वांछित है, तो एक थोक बेलनाकार गोली तैयार की जानी चाहिए, फिर भी छर्रे को अपनी जमे हुए राज्य में रखा जाना चाहिए। यदि सेल गोली खंडित है, तो निम्नलिखित चरणों का उपयोग आदर्श रूप से एक दस्ताने बॉक्स में किया जा सकता है जो एक निष्क्रिय वातावरण के साथ पूरी तरह से शुद्ध हो जाता है।
  9. थोक जमे हुए बेलनाकार छर्रों की तैयारी
    1. एक मैनुअल हाइड्रोलिक प्रेस के सभी हिस्सों को विसर्जित करें जो एलएन2 में नमूने के संपर्क में होंगे (चित्रा 3 ए; 3- या 5-मिमी व्यास गोली मर जाती है, मोल्ड, पिस्टन / तार खींचती है)।
    2. उचित गोली मर जाता है (चित्रा 3 बी) के साथ भरी हुई मोल्ड में तेजी से जमे हुए छर्रे के टुकड़े स्थानांतरित करें।
    3. हाइड्रोलिक प्रेस के साथ त्वरित pelletize. 5 मिमी व्यास की गोली के लिए 1.5 टन या 3 मिमी व्यास के छर्रे के लिए 0.5 टन का उपयोग पर्याप्त है (चित्रा 3 सी)।
      नोट: हाइड्रोलिक प्रेस के साथ प्रत्येक गोली की तैयारी के बाद, शेष ठंढ और आर्द्रता के साथ किसी भी समस्या से बचने के लिए नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके सभी सामग्रियों को पिघलाने और ठीक से सुखाने की आवश्यकता होती है।
    4. जमे हुए कोशिकाओं के थोक गोली जल्दी से ले लीजिए और भंडारण के लिए एक पर्याप्त क्रायोट्यूब में जगह है।
    5. इसे लंबी अवधि के भंडारण के लिए एलएन2 टैंक में वापस स्टोर करें।
    6. स्थानांतरण और विश्लेषण के लिए क्रायो-छर्रों माउंट. एक एलएन 2 कूल्ड क्रायोट्यूब में संग्रहीत गोली कोतरल एन 2 में 77 के प्रीकूल्ड क्रायोस्टेट नमूना धारक में स्थानांतरित कर दिया जाता है (चित्रा 4, जैसा कि सीआरजी-फेम-यूएचडी बीमलाइन के लिए उपयोग किया जाता है)। इस चरण को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए, लेकिन इसमें कुछ मिनट लग सकते हैं। फिर नमूना धारक को क्रायोस्टेट में स्थानांतरित करें और पूरे XAS विश्लेषण के दौरान इसे 10 K पर बनाए रखें।
      नोट: चरण 1.9.3 और 1.9.6 मुश्किल हैं क्योंकि उन्हें पिस्टन और मोल्ड को अवरुद्ध करने वाले किसी भी ठंढ गठन से बचने के लिए जल्दी से करने की आवश्यकता है। एक विकल्प नाइट्रोजन गैस के साथ पूरी तरह से शुद्ध प्लास्टिक तम्बू के तहत इन चरणों को निष्पादित करना है। एलएन2-कूल कॉपर मास पैलेट को जमे हुए रखने की अनुमति देता है।

2. लोहे के प्रजाति के लिए प्लवक कोशिकाओं की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक समुद्री जल को अल्ट्राप्योर वाटर सी लवण, मॉर्फोलिनो प्रोपेनसल्फोनिक एसिड, अमोनियम नाइट्रेट, सोडियम नाइट्रेट, सोडियम मेटासिलिकेट पेंटाहाइड्रेट, सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, विटामिन स्टॉक, ट्रेस मेटल स्टॉक, एंटीबायोटिक स्टॉक और एचएच = 7.9 पर एचईपीईएस बफर जोड़कर तैयार किया गया था। प्रत्येक घटक की सांद्रता सामग्री की तालिका में इंगित की गई है। संस्कृति पर विवरण Sutak et al.11 में पाया जा सकता है

  1. 6 मिनट के लिए 1,100 x g पर 50 mL पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में एक P. tricornutum डायटम संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और ताजा माध्यम के साथ एक फ्लास्क में गोली को स्थानांतरित करें।
  2. संस्कृति को 24 घंटे के लिए एक विकास कक्ष में सिंथेटिक समुद्री जल में बढ़ने दें।
  3. 1,100 x g पर 6 मिनट के लिए प्लवक संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और पैलेट को नए माध्यम में स्थानांतरित करें जिसमें Fe-साइट्रेट (अंतिम संस्कृति में 1 μM) शामिल है। 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. प्लवक कोशिकाओं को तैयार करें
    1. 1,100 x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और लोहे के बिना माध्यम से कुल्ला करें।
    2. एक 1.5 mL polypropylene ट्यूब में गोली हस्तांतरण, ultrapure पानी के साथ धोना, और 1,100 x g पर 3 मिनट के लिए centrifuge 2x. supernatant निकालें.
    3. 1.5 mL polypropylene ट्यूब के निचले भाग में डुबकी LN2 में गोली युक्त के रूप में चरण 1.8 में वर्णित है.
    4. एक LN2 जमे हुए मोल्डर में जमे हुए कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और चरण 1.9 में वर्णित के रूप में एक XRF गोली प्रेस (चित्रा 3 और चित्रा 7) का उपयोग करके जल्दी से दबाएं।
    5. गोली को हटा दें और इसे लंबी अवधि के भंडारण के लिए एलएन2 टैंक में स्टोर करें।
    6. चरण 1.9.6 का पालन करें (क्रायोस्टेट नमूना धारक में स्थानांतरण के लिए चित्र4 देखें)।

3. संदर्भ यौगिक तैयारी और माप

नोट: प्रजातियों के संदर्भ यौगिकों (ठोस या तरल) प्रतिनिधि और जैविक प्रणाली में पाए जाने की उम्मीद है, प्रयोगात्मक जैविक नमूनों के साथ तुलना के लिए XAS द्वारा तैयार और विश्लेषण किया जाना चाहिए। संदर्भ स्पेक्ट्रा कोडेटाबेस 12,13,14 में भी पाया जा सकता है और इसका उपयोग किया जा सकता है बशर्ते कि माप की स्थिति (जैसे, वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन) प्रयोगात्मक नमूनों के समान हो।

  1. जलीय घोल में संदर्भ के लिए, एनारोबिक स्थिति या निष्क्रिय वातावरण के तहत पाउडर या तरल रूप में प्रारंभिक यौगिकों का वजन करें। किसी भी ऑक्सीडो-रिडक्टिव प्रतिक्रिया से बचने और यौगिक की रासायनिक अखंडता को संरक्षित करने के लिए, एक अक्रिय वातावरण में (यानी, एक एनारोबिक दस्ताने बॉक्स में या एक श्लेंक लाइन में, चित्रा 5 और चित्रा 6 देखें) में रेडॉक्स-संवेदनशील संदर्भ तैयार करें, जो परिवेशी हवा में अत्यधिक प्रतिक्रियाशील और अस्थिर हो सकता है)। यहां, सभी सेलेनियम संदर्भों को एक श्लेंक लाइन और degasified ultrapure पानी (चित्रा 6) का उपयोग करके तैयार किया गया था। तरल FeIII-malate और फेरिटिन परिवेशी हवा में तैयार किए गए थे।
  2. प्रतिदीप्ति मोड में संग्रह के लिए अध्ययन किए गए तत्व (यानी, सेलेनियम या लोहे) की 1% डब्ल्यूटी अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए उपयुक्त समाधान के साथ मिश्रण करें।
    नोट: Ultrapure पानी XAS संदर्भ तैयार करने के लिए सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया जाने वाला समाधान है। बर्फ क्रिस्टल द्वारा एक्स-रे विवर्तन से उत्पन्न कलाकृतियों और ठोस-राज्य डिटेक्टर के साथ एकत्र एक्सएएस सिग्नल की संरक्षित गुणवत्ता को रोकने के लिए मानक एक्सएएस प्रतिदीप्ति का उपयोग करके मापा जाने वाले तरल पदार्थों के लिए ग्लिसरॉल (15%-20%) के अतिरिक्त की आवश्यकता होती है। हालांकि, HERFD-XAS के लिए, ग्लिसरॉल अनिवार्य नहीं है। एक ठोस-राज्य डिटेक्टर के बजाय एक क्रिस्टल विश्लेषक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके, ऊर्जा को एक अत्यंत उच्च-रिज़ॉल्यूशन के साथ चुना जाता है और बर्फ क्रिस्टल द्वारा प्रेरित विवर्तन अध्ययन किए गए तत्व1 के डेटा संग्रह को प्रभावित नहीं करता है।
  3. संरक्षित करें और एक सील Schlenk गुब्बारे (चित्रा 5) या एक 1.5 mL polypropylene ट्यूब में तैयार समाधान स्टोर जब तक नमूनों के रूप में एक ही स्थितियों में माप.
  4. ठोस संदर्भों के लिए, सेलेनियम या लोहे के मॉडल यौगिक पाउडर को परिवेशी हवा में या दस्ताने बॉक्स में तौलें यदि प्रजातियां रेडॉक्स-संवेदनशील हैं। यहां, ठोस FeII संदर्भ (FeII-एसीटेट और विविनाइट) एक गैसीय N2 दस्ताने बॉक्स में तैयार किए गए थे, जबकि FeIII (Fe(OH)3, और FeIII-फॉस्फेट) परिवेशी हवा में तैयार किए गए थे।
  5. उच्च शुद्धता बोरान नाइट्राइड पाउडर का वजन करें और अध्ययन किए गए तत्व (चित्रा 7 ए) की 1% डब्ल्यूटी अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए मॉडल यौगिकों पाउडर के साथ मिश्रण करें।
  6. कम से कम 15 मिनट के लिए एक मोर्टार का उपयोग करके एक ठीक पाउडर में पीस लें।
  7. हाइड्रोलिक प्रेस के साथ छर्रों को तैयार करने के लिए मोल्डर में पाउडर मिश्रण रखें (चित्रा 7 बी, नमूना गोली के लिए चित्रा 3 ए के समान)।
  8. पिस्टन के साथ मोल्डर को बंद करें (चित्रा 7 सी, नमूना गोली के लिए चित्रा 3 बी के समान)।
  9. थोक गोली प्राप्त करने के लिए दबाएँ (चित्रा 7D, नमूना गोली के लिए चित्रा 3C के समान)।
  10. तैयार बल्क छर्रों को दस्ताने बॉक्स में तब तक स्टोर करें जब तक कि वे नमूनों के समान स्थितियों में विश्लेषण न करें।
    नोट: थोक गोली कभी-कभी पिस्टन से चिपक जाती है, उदाहरण के लिए पाउडर कॉम्पेसिटी के आधार पर। इसे तोड़ने के बिना इसे धीरे से हटाना मुश्किल हो सकता है। उस स्थिति में, पॉलीमाइड (जैसे, कप्टन) डिस्क का उपयोग करके निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग किया जाना है।
  11. पिस्टन के प्रत्येक तरफ इथेनॉल की एक बूंद डालें जो पाउडर (चित्रा 8 ए) के संपर्क में होगी।
  12. पिस्टन की तुलना में थोड़ा छोटा व्यास के साथ दो पॉलीमाइड डिस्क तैयार करें। पॉलीमाइड मोटाई को 10-25 μm होने की आवश्यकता है (पतला हेरफेर करना मुश्किल होगा, मोटा विश्लेषण के दौरान एक्स-रे फोटॉनों के बहुत अधिक अवशोषित करेगा)।
  13. पिस्टन पर डिस्क रखो. वे केशिका कार्रवाई (चित्रा 8 बी) द्वारा छड़ी करेंगे।
  14. पिस्टन के साथ मोल्डर माउंट करें, पाउडर जोड़ें, और दूसरे पिस्टन (चित्रा 8 सी) में डालें।
  15. दबाएँ (चरण 3.11 देखें) और पिस्टन से संपीड़ित थोक गोली निकालें।
    नोट:: ठोस संदर्भ cryostat-विशिष्ट नमूना धारक जैसे नमूने पर माउंट किया जा सकता है (चरण 1.8.6 देखें)। तरल संदर्भ क्रायोस्टेट-विशिष्ट नमूना धारक पर लगाए जा सकते हैं। CRG-FAME क्रायोस्टेट नमूना धारक के लिए चित्रा 9A देखें. एक ही प्रक्रिया एक CRG-FAME-UHD नमूना धारक का उपयोग कर लागू किया जा सकता है, चित्र4D में दिखाया गया है, निम्न कार्यविधि का उपयोग कर।
  16. क्रायोस्टेट नमूना धारक पर तरल संदर्भ का बढ़ते.
    1. RT (चित्रा 9B) पर नमूना धारक पर छेद के एक तरफ सील करने के लिए polyimide (जैसे, Kapton) टेप (25 μm मोटी) सेट करें।
    2. एक सिरिंज का उपयोग करके, गुहा को समाधान के साथ धीरे-धीरे भरें जब तक कि यह शीर्ष तक न पहुंच जाए। बुलबुले से बचें। जलाशय को भरा जाना चाहिए (चित्रा 9 C, बाएं)।
    3. टेप के साथ गुहा के दूसरी तरफ सील (चित्रा 9 सी, दाएं)।
    4. एलएन2 (चित्रा 9 डी, टी0-टी 3) में सील किए गए नमूना धारक को डुबोएं।
    5. एक थर्मिक प्रतिक्रिया एलएन2 बुदबुदाने को प्रेरित करती है। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि बुदबुदाहट बंद न हो जाए, प्रतिक्रिया के अंत का संकेत देता है (चित्रा 9 डी, टी3-टी 5)।
    6. डेटा संग्रह (चित्रा 9 डी, टी6) शुरू करने या एलएन2 देवर में संग्रहीत करने से पहले बीमलाइन के क्रायोस्टेट में 77 K पर नमूना धारक को स्थानांतरित करें।
      नोट: जमे हुए समाधान अच्छी तरह से गुहा में फैल गया है और एक समान और सजातीय गोली बनाता है (चित्रा 9 डी, टी7)।

4. HERFD-XAS: प्रक्रिया को मापने

  1. ब्याज की प्रतिदीप्ति रेखा ऊर्जा के संबंध में ब्रैग स्थितियों में कैस से सभी क्रिस्टल का अनुकूलन। इस प्रक्रिया को एक केंद्रित संदर्भ यौगिक के साथ किया जा सकता है।
  2. एक संदर्भ का उपयोग करके घटना मोनोक्रोमैटिक बीम ऊर्जा को कैलिब्रेट करें जिसके लिए अवशोषण किनारे की ऊर्जा स्थिति ज्ञात होती है (आमतौर पर एक शुद्ध धातु पन्नी)। इस संदर्भ को नमूने के बाद एक दूसरे चरण में, डबल ट्रांसमिशन मोड में तैनात किया जा सकता है, ताकि प्रत्येक प्राप्त स्पेक्ट्रा के लिए अंशांकन की जांच करने में सक्षम हो सके और अंततः उन्हें पोस्टट्रीटमेंट संरेखित किया जा सके।
  3. चरण 1.9.6 में वर्णित उचित प्रक्रिया के बाद जैविक नमूनों के लिए एक तरल हीलियम क्रायोस्टेट में नमूने की स्थिति।
  4. सिंक्रोट्रॉन सुरक्षा नियमों का पालन करते हुए प्रयोगात्मक हच को बंद करें।
  5. चयनित अवशोषण किनारे को कवर करता है जो किसी ऊर्जा श्रेणी पर XAS अधिग्रहण निष्पादित करें।
  6. प्रत्येक वर्णक्रमीय अधिग्रहण के बाद, एक नया अधिग्रहण शुरू करने से पहले गति की दिशा में बीम आकार से कम से कम दो बार नमूने को स्थानांतरित करें।
    नोट:: इस मामले में, Ge(440) क्रिस्टल का उपयोग करके Fe K एक 1 पंक्ति का चयन करने के लिए और Se K एक1 पंक्ति का चयन करने के लिए Ge(844) क्रिस्टल का उपयोग कर माप किए गए थे। नमूने पर बीम का आकार 200 x 100 μm² (H x V पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम) था। प्रत्येक अधिग्रहण के बीच नमूना गति दोनों दिशाओं में 500 μm थी, ताकि संरचनात्मक समरूपता की जांच की जा सके और हर बार पिछले संभावित विकिरण क्षति से मुक्त एक नए क्षेत्र का विश्लेषण किया जा सके। व्यक्तिगत स्पेक्ट्रा की तुलना की जाती है और विलय कर दिया जाता है यदि वे शोर के भीतर अतिरंजित होते हैं। मर्ज किए गए स्पेक्ट्रम की गुणवत्ता सही होने पर किसी दिए गए नमूने के लिए माप को रोक दिया जाता है। फिर डेटा विश्लेषण को एक्सएएस विश्लेषण के लिए समर्पित किसी भी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है, विशेष रूप से वे जो सामान्यीकृत स्पेक्ट्रा के रैखिक संयोजन फिटिंग की अनुमति देते हैं, उदाहरण के लिए एथेना और आर्टेमिस (सॉफ्टवेयर का डीमीटर समूह)15, सिक्सपैक16, या वाइपर17। XAS विश्लेषण के पूर्ण और विस्तृत स्पष्टीकरण इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर आते हैं और हाल के पत्रों में पाए जा सकते हैं18,19, उनमें से कुछ विशेष रूप से जैविक नमूनों के लिए समर्पितहैं। सेलेनियम XANES संदर्भ स्पेक्ट्रा पहले से ही SSHADE स्पेक्ट्रा डेटाबेस21 में एकत्र किए गए हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इन तैयारियों का मुख्य उद्देश्य सेलेनियम नैनोकणों (से-एनपी) और कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करना था, और फाइटोप्लांकटन में लोहे के बंधन और सीक्वेंसिंग।

प्रारंभिक अवस्था (बीएसए से-एनपी) में सेलेनियम के HERFD-XANES स्पेक्ट्रा और पोषक माध्यम (24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद BSA Se-NPs) में इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं में चित्र 10 में दिखाया गया है। परिणामों से पता चला है कि प्रारंभिक सी-एनपी में सेलेनियम से (0) और सेलेनाइट जैसे रूपों दोनों के रूप में मौजूद था, जबकि पीसी -3 कोशिकाओं के साथ बातचीत के बाद कोशिकाओं में सेलेनियम मुख्य रूप से से (0) के रूप में मौजूद था, इस प्रकार कोशिकाओं में सेलेनियम प्रजातियों के परिवर्तन का प्रदर्शन किया गया था। लोहे के लिए, संदर्भों के HERFD-XANES स्पेक्ट्रा ने लोहे के ऑक्सीकरण राज्य के आधार पर अलग-अलग किनारे की स्थिति दिखाई, जिसमें लोहे की कम प्रजातियों को कम ऊर्जा मूल्यों (चित्रा 11) में स्थानांतरित कर दिया गया। डायटम गोली की एक ही स्थिति पर एकत्र किए गए दो क्रमिक स्पेक्ट्रा समान थे, यह दर्शाता है कि 10 K पर He-cryostat का उपयोग करते समय बीम क्षति दो अधिग्रहणों के बीच सीमित थी। इसके अलावा, डायटम गोली (यहां तीन पदों) के विभिन्न पदों से स्पेक्ट्रा समान थे, यह दर्शाते हुए कि नमूना गोली सजातीय थी, और यह कि स्पेक्ट्रा को एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात स्पेक्ट्रम (औसत स्पेक्ट्रम) प्राप्त करने के लिए औसत किया जा सकता था। Diatoms के लिए औसत स्पेक्ट्रम किनारे सुविधाओं को ज्यादातर Fe (III) के अनुरूप दिखाता है। संदर्भ स्पेक्ट्रा की रैखिक संयोजन फिटिंग तब लोहे की प्रजातियों के अनुपात को मापने के लिए की गई थी जैसा कि Sarret et al.6 में वर्णित है।

Figure 1
चित्रा 1: ठेठ सेल छर्रों. 1.5 mL पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब (OVCAR-3 कोशिकाएं बाएं, PC-3 कोशिकाएं दाईं ओर) जिसमें क्रमशः 8 x 106 कोशिकाएं और 1 x 107 कोशिकाएं होती हैं। क्रेडिट: कैरोलीन बिस्रडन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एनारोबिक दस्ताने बॉक्स में तैयारी। (A) एनारोबिक दस्ताने बॉक्स जिसमें एक (B) 1.5 mL पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब रैक (नीला) होता है, जो पूरी तरह से तरल LN2 में डूबा होता है। तरल एलएन2 स्पष्टता के लिए चित्र में प्रस्तुत नहीं किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल पेलेटिंग की स्कीमा. (ए) लोड करने से पहले प्रेस में नमूना गोली। (बी) लोडिंग के दौरान नमूना। (सी) लोड होने के बाद नमूना थोक गोली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: क्रायो-नमूना (ओं) का बढ़ते हुए। ESRF पर BM16 XAS बीमलाइन के लिए विशिष्ट नमूना धारक में बढ़ते. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: संदर्भ समाधान की एनोक्सिक तैयारी। Schlenk गुब्बारे में संग्रहीत सेलेनियम संदर्भ तैयारी के उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: संदर्भ समाधान की एनोक्सिक तैयारी के लिए सेटअप। दाईं ओर बोतल में degasified ultrapure पानी के साथ Schlenk रैंप का सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ठोस संदर्भ गोली में तैयारी. पाउडर यौगिकों के लिए दबाए गए बेलनाकार छर्रों की तैयारी या तो परिवेशी हवा में या दस्ताने बॉक्स के नीचे। (ए) संदर्भ पाउडर का वजन। (बी) प्रेस समर्थन के बेलनाकार छेद में पाउडर। (c) बंद प्रेस समर्थन. (d) दबाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: पॉलीमाइड डिस्क का उपयोग करके एक ठोस संदर्भ गोली की तैयारी। चिपचिपा या भंगुर पाउडर यौगिकों के लिए दबाया बेलनाकार गोली की तैयारी. (ए) पिस्टन के प्रत्येक तरफ इथेनॉल की एक बूंद जो पाउडर के संपर्क में होगी, पिस्टन पर पॉलीमाइड डिस्क को उनसे चिपकने की अनुमति देगी (बी)। मोल्डर पिस्टन के साथ घुड़सवार है। फिर, पाउडर को जमा किया जा सकता है, और मोल्डर को दूसरे पिस्टन (सी) के साथ बंद किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: एक तरल संदर्भ या नमूने के लिए क्रायोस्टेट नमूना धारक के लिए तैयारी के चरण। चित्र स्पष्टता के लिए, तस्वीरें दस्ताने बॉक्स के बाहर और खतरनाक पदार्थों के बिना ली गई थीं। यहां, हमने डीडीएच2ओ पानी का उपयोग किया। यदि आवश्यक हो, तो यह तैयारी एक दस्ताने बॉक्स या अक्रिय वातावरण (एन2) प्लास्टिक तम्बू के नीचे की जा सकती है। (ए) नमूना धारक। (बी) छेद को सील करने के लिए घुमावदार सतह पर पॉलीमाइड टेप रखें। (सी) धीरे-धीरे एक सिरिंज का उपयोग करके ड्रॉप द्वारा संदर्भ समाधान ड्रॉप को इंजेक्ट करें जब तक कि गुहा भर न जाए। कोई हवा के बुलबुले नहीं रहना चाहिए। Polyimide टेप के साथ दूसरे छेद सील. (d) LN2 में डुबकी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: Se K-किनारे ठेठ HERFD-XANES विश्लेषण. बीएसए-लेपित से-एनपी के से के-एज एचआरएफडी-एक्सएनईएस, जैसा कि सेल संस्कृति माध्यम में प्राप्त हुआ और 24 घंटे छोड़ दिया गया, और पीसी -3 सेल बीएसए-लेपित से-एनपी के संपर्क में आया। स्पेक्ट्रा को स्पष्टता के लिए स्थानांतरित कर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: Fe K-किनारे ठेठ HERFD-XANES विश्लेषण. प्लवक में लोहे की प्रजाति पर हमारे प्रयोग के दौरान एकत्र स्पेक्ट्रा का उदाहरण। छह ऊपरी स्पेक्ट्रा संदर्भों / मानकों के अनुरूप हैं। अधिरोपित स्पेक्ट्रा (लाल और काले रंग में) गोली की एक ही स्थिति पर एकत्र किए गए दो स्पेक्ट्रा के अनुरूप है। पोस # 1, पॉस # 2, और पीओएस # 3 लेबल किए गए स्पेक्ट्रा को नमूना गोली के तीन अलग-अलग पदों पर एकत्र किया गया था। Diatoms Average नामक स्पेक्ट्रम गोली के विभिन्न पदों पर एकत्र किए गए औसत स्पेक्ट्रा से मेल खाता है और यह वह नमूना है जिसके लिए प्रजाति निर्धारित करने की आवश्यकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उत्पादों PC3 सेल लाइन OVCAR3 सेल लाइन
ATCC संशोधित RPMI 1640 मध्यम 445 mL 394.5 mL
भ्रूण गोजातीय सीरम 50 mL 100 mL
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 mL 5 mL
गोजातीय इंसुलिन - 500 μL

तालिका 1. सेल संस्कृति मीडिया की तैयारी. कोशिकाओं को अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC) संशोधित RPMI 1640 माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जो भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 10% और पीसी -3 प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के लिए 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस) के साथ पूरक होता है और 20% FBS और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.01 मिलीग्राम / एमएल बोवाइन इंसुलिन के साथ OVCAR-3 डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जैविक नमूनों में सेलेनियम और लोहे के रासायनिक रूप का अध्ययन करने के लिए किया गया था। यह क्रायो-तैयारी और जैविक नमूनों और संदर्भ यौगिकों के भंडारण के साथ-साथ HERFD-XAS माप पर केंद्रित है।

क्रायो-तैयारी और भंडारण
थोक जैविक नमूना छर्रों की क्रायो-तैयारी नमूनों में मौजूद प्रजातियों की रासायनिक अखंडता के संरक्षण की अनुमति देती है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि तैयारी के लिए फ्रीज-सुखाने या हवा-सुखाने का उपयोग करते समय प्रजातियों में परिवर्तन देखा गयाहै। इस प्रोटोकॉल का उपयोग जल्द ही किया जाना चाहिए जैसे ही माप के लिए चयनित बीमलाइन एक हीलियम क्रायोस्टेट से सुसज्जित होती है।

संदर्भ यौगिकों के लिए, ऑक्सीकरण राज्य को संरक्षित करने के लिए रेडॉक्स-संवेदनशील तत्वों का उपयोग करते समय एनोक्सिक वातावरण में काम करना आवश्यक है। इसके बाद इसे वर्णक्रमीय किनारे की स्थिति में भिन्नताओं के साथ जांचा जा सकता है जैसा कि लौह और फेरिक संदर्भ यौगिकों (चित्रा 11) के लिए दिखाया गया है।

यह नमूना तैयारी सिंक्रोट्रॉन या प्रयोगशाला विश्लेषण से पहले की जा सकती है। इस मामले में, जमे हुए गोली या संदर्भ को एक क्रायोट्यूब में स्थानांतरित किया जाना चाहिए और एलएन2 टैंक में संग्रहीत किया जाना चाहिए। यह एलएन2 भंडारण एक सुरक्षात्मक निष्क्रिय वातावरण प्रदान करने और रासायनिक प्रजातियों में परिवर्तन से बचने के लिए अनिवार्य है, विशेष रूप से प्रतिक्रियाशील लोहे या सेलेनो-यौगिकों के लिए। अधिमानतः, नमूनों को मापने से ठीक पहले तैयार किया जाना चाहिए या विश्लेषण से कुछ दिन पहले संग्रहीत किया जाना चाहिए। लंबे समय तक (यानी, महीनों) के लिए नमूनों को संग्रहीत नहीं करना सबसे अच्छा है।

क्रायो-विश्लेषण
कम तापमान पर विश्लेषण, आदर्श रूप से 10 K पर, तीव्र एक्स-रे बीम द्वारा प्रेरित क्षति को धीमा करने के लिए अत्यधिक वकालत की जाती है, विशेष रूप से पानी के हाइड्रोलिसिस से मुक्त कणों का गठन, जो प्रोटीन मैट्रिक्स को नुकसान पहुंचा सकता है और संक्रमण धातु आयनों का फोटोरिडक्शन या सल्फर22 जैसे तत्वों के फोटोरिडक्शन का निर्माण कर सकता है। एक्सएएस स्पेक्ट्रम के तेजी से अधिग्रहण के माध्यम से रासायनिक प्रजातियों में इन संभावित परिवर्तनों को ध्यान में रखना सबसे अच्छा है। प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए एक गैर-विकिरणित क्षेत्र को उजागर करने के लिए नमूने को भी स्कैन किया जाना चाहिए। जैसा कि फाइटोप्लांकटन पैलेट (चित्रा 11) के तीन अलग-अलग पदों पर एकत्र स्पेक्ट्रा द्वारा प्रदर्शित किया गया है, इस तरह की रणनीति शक्तिशाली स्पेक्ट्रा को प्रकट करती है, जिसे तब बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए औसत किया जा सकता है।

भविष्य के अनुप्रयोग
हमारे काम में, हमने HERFD-XAS माप (FAME-UHD, ESRF, फ्रांस) को समर्पित एक बीमलाइन का उपयोग किया, लेकिन जैविक नमूना तैयारी के लिए इस प्रोटोकॉल को क्रायोस्टेट से सुसज्जित किसी भी मानक XAS बीमलाइन पर लागू किया जा सकता है, जबकि अन्य प्रकार के डिटेक्टरों का उपयोग किया जा सकता है जैसे कि मल्टीएलिमेंट जीई सॉलिड-स्टेट-डिटेक्टर या सिलिकॉन-ड्रिफ्ट डिटेक्टर। प्रस्तावित वर्कफ़्लो को किसी भी अन्य रासायनिक तत्वों या एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा अध्ययन किए जाने की उम्मीद वाली किसी भी जैविक सामग्री पर भी लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम CEMHTI (ऑरलियन्स, फ्रांस, ANR-13-BS08-0012-01) और Labex OSUG@2020 (Grenoble, फ्रांस, ANR-10-LABX-0056) द्वारा बीमलाइन विकास में वित्तीय योगदान के लिए आभारी हैं। फेम-यूएचडी परियोजना वित्तीय रूप से फ्रांसीसी "ग्रैंड एम्प्रंट" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG कंसोर्टियम और INSU CNRS संस्थान द्वारा समर्थित है। हम प्रयोगों के दौरान सभी योगदानों के आभारी हैं, विशेष रूप से BM30B और BM16 पर काम करने वाले सभी व्यक्तियों के लिए। लेखकसिंक्रोट्रॉन विकिरण बीमटाइम के प्रावधान के लिए यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा को स्वीकार करते हैं। हम वित्तीय सहायता (ANR-16-CE01-0008) और वित्तीय सहायता के लिए SEDMAC परियोजना (INCA-Plan Cancer-ASC16019CS) के लिए PHYTOMET ANR परियोजना को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium nitrate Sigma-Aldrich A3795 NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber Coy Laboratory, USA equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock Sigma-Aldrich A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder Sigma-Aldrich 255475
Cell counting chamber Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO 14190-094 Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes 0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes 15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 Sigma-Aldrich F3388 aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum GIBCO A31604-02 Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks Sigma-Aldrich Z707503 TPP 150 cm2 area
Growth chamber Sanyo Sanyo MLR-352 at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer Sigma-Aldrich H4034 1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3 ATCC, Rockville, MD HTB-161 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas Sigma-Aldrich I0516 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum Roscoff culture collection RCC69 http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid Sigma-Aldrich M3183 MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3 ECCAC, Salisbury, UK 90112714 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts Sigma-Aldrich S9883 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers Oxford Instrument AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) GIBCO A10491-01 Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA Se50-BS-1 BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA 11. Se50-CS-1 Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate Sigma-Aldrich 71746 Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate Sigma-Aldrich S5022 NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock Sigma-Aldrich M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%) GIBCO 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25300-054
Vitamin stock Sigma-Aldrich T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
  9. Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
  10. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  11. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  12. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  13. Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  15. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  16. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
  17. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  18. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  19. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  20. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  21. Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
  22. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 183 एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रजाति सेलेनियम लोहा कैंसर कोशिकाओं फाइटोप्लांकटन सिंक्रोट्रॉन उच्च ऊर्जा संकल्प प्रतिदीप्ति एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी क्रायो-तैयारी का पता लगाया
जैविक नमूने उच्च संकल्प एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर क्रायोजेनिक तापमान पर प्रजातियों के लिए तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bissardon, C., Isaure, M. P.,… More

Bissardon, C., Isaure, M. P., Lesuisse, E., Rovezzi, M., Lahera, E., Proux, O., Bohic, S. Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution X-Ray Absorption Spectroscopy. J. Vis. Exp. (183), e60849, doi:10.3791/60849 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter