Summary
في هذا البروتوكول، نحن وصف نموذج الماوس من استئصال غير مكتملة الجراحية من ساركوما الأنسجة الرخوة لاختبار (neo) العلاجات المساعدة.
Abstract
الجراحة غالباً ما تكون أول علاج للعديد من الأورام الصلبة. ومع ذلك، تحدث الانتكاسات المحلية في كثير من الأحيان بعد استئصال الورم الأساسي، على الرغم من العلاجات المساعدة أو المساعدة الجديدة. يحدث هذا عندما تكون الهوامش الجراحية خالية من الورم بشكل غير كافٍ، مما يؤدي إلى خلايا سرطانية متبقية. من منظور بيولوجي ومناعي ، الجراحة ليست حدثًا فارغًا ؛ فهي لا تعتبر من الناحية البيولوجية أو المناعية . ومن المعروف أن بيئة التئام الجروح للحث على كل من المسارات المؤيدة والمضادة للورم. ونتيجة لذلك، يجب أن تتضمن النماذج قبل السريرية لتطوير الأدوية التي تهدف إلى منع الانتكاس المحلي استئصال جراحي عند اختبار علاجات جديدة (جديدة) مساعدة، لنمين الأوضاع السريرية في المرضى الذين عولجوا بالجراحة.
هنا، ونحن وصف نموذج الماوس من استئصال الجراحية غير مكتملة من الساركوما الأنسجة الرخوة WEHI 164 التي تسمح لاختبار (نيو) العلاجات المساعدة في وضع استجابة التئام الجروح. في هذا النموذج، تتم إزالة 50٪ أو 75٪ من الورم، وترك وراء بعض الأنسجة السرطانية في الموقع لنموذج إجمالي المرض المتبقي بعد الجراحة في الإعداد السريري. هذا النموذج يسمح اختبار العلاجات في سياق عملية جراحية في حين تنظر أيضا في الاستجابة التئام الجروح, التي قد تؤثر على فعالية (نيو) adjuvant العلاجات. يؤدي استئصال الشقوق الجراحي غير المكتمل إلى إعادة نمو الورم القابلة للتكرار في جميع الفئران في غياب العلاج المساعد. العلاج المساعد مع حاجز التفتيش يؤدي إلى انخفاض نمو الورم. وبالتالي فإن هذا النموذج مناسب لاختبار العلاجات في سياق جراحة إزالة الbulking وما يرتبط بها من استجابة لتضميد الجروح ويمكن تمديدها إلى أنواع أخرى من السرطان الصلب.
Introduction
لا تزال الجراحة هي الخيار العلاجي الرئيسي للعديد من الأورام الصلبة1، بما في ذلك ساركوما الأنسجة الرخوة2،3. على الرغم من التحسينات في تقنيات جراحة السرطان، وتركيبات مع (neo) العلاجات المساعدة، لا يزال هناك خطر كبير من الانتكاس السرطان والانتدرالية بعد استئصال الورم الأولية4،5. في ساركوما الأنسجة الرخوة ، تحدث الانتكاسات بشكل خاص في موقع الجراحة ، مما يؤدي إلى زيادة المراضة والوفيات. في الأجواء السريرية، قد يكون من الصعب الحصول على هوامش واسعة بما فيه الكفاية (على سبيل المثال، بسبب القيود التشريحية)، مما يؤدي إلى استئصال غير كامل وتكرار الورم اللاحق6. ومن المعروف الإجهاد الجراحي وعملية لاحقة من التئام الجروح لخلق بيئة الورم المثبطة للمناعة مواتية لتكرار الورم7,8. ولذلك ، فإن اكتشاف وتطوير علاجات جديدة لساركوما الأنسجة الرخوة ، وخاصة العلاجات المناعية ، يجب أن تأخذ بشكل مثالي استجابة التئام الجروح الجراحية في الاعتبار.
معظم الدراسات قبل الإكلينيكية للعلاجات المساعدة تتم في البداية باستخدام نماذج الماوس السيني تحت الجلد أو xenotransplant ، دون دمج استجابة الإجهاد الجراحي والتئام الجروح9،10. لذلك، قمنا بتطوير نموذج نسيج ساركوما ناعم من الماوس تحت الجلد يدمج استئصال جراحي غير مكتمل. يتم تلقيح خلايا WEHI 164 فيبرومساركوما تحت الجلد ، وبمجرد تأسيس الأورام ، نقوم بإزالة 50-75 ٪ من الجزء الأكبر من الورم(الشكل 1A-E). الأورام باستمرار إعادة النمو من الورم المتبقي. هذا النموذج يسمح لاختبار العلاجات المساعدة مع النظر في تأثير الإجهاد الجراحي والتئام الجروح. وقد استخدمت نماذج جراحية مماثلة من استئصال غير مكتمل في عدد من الدراسات التي أجرتها عدة مجموعات وتبين أن تكون قابلة للتكرار وفعالة11,12,13. هنا، نقدم وصفا مفصلا لهذا البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الحيوانات المستخدمة في هذه التجارب من مركز الموارد الحيوانية (بيرث، غرب أستراليا). تمت صيانة الحيوانات في ظل ظروف قياسية خالية من مسببات الأمراض في معهد هاري بيركنز للبحوث الطبية بالمرفق الشمالي للبحوث الطبية (بيرث، غرب أستراليا). وقد أجريت جميع التجارب في أعقاب البروتوكول الذي وافق عليه معهد هاري بيركنز للبحوث الطبية لجنة أخلاقيات الحيوان. وقد استخدمت في هذه التجارب فئران BALB/c التي يبلغ عمرها 8-12 أسبوعاً. تم الحصول على WEHI 164 خط الخلية الساركوما الليفية من CellBank أستراليا (Westmead، نيو ساوث ويلز).
1. تلقيح الخلايا
- إعداد الخلايا والحيوانات
- تأكد من أن يتم الاحتفاظ بخط الخلية في الوسائط الموصى بها. على سبيل المثال، الحفاظ على WEHI 164 خط الخلية في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تكملها 2 M L-الجلوتامين، 10٪ مصل الأبقار الجنين، 20 mM HEPES، 0.05 mM 2-mercaptoethanol، 100 U/mL البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل ستريبسين.
ملاحظة: خلايا الممر 3 مرات على الأقل وما يصل إلى 5 مرات بعد إزالتها من التخزين المبرد. لضمان صلاحية الخلية المثلى، يجب تقسيم الخلايا عندما تكون بين 70-80٪ التقاء. يجب اختبار خطوط الخلايا السرطانية لـ الميكوبلازما، حيث يمكن أن تغير العدوى نمو الخلايا وتؤثر على الاستجابة المناعية في الجسم الحي. - قبل يوم واحد من التطعيم، حلق الفئران على الجناح الأيمن السفلي باستخدام المقصات.
ملاحظة: تم استخدام فئران BALB/c الأنثوية، التي تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعاً، من الوزن الطبيعي (16 -22 غراماً) في هذه التجربة. - في يوم التلقيح، حصاد خلايا WEHI 164 عندما 70-80٪ التقاء بواسطة التربسينيشن.
- التعرق المتوسطة الثقافة من قارورة زراعة الأنسجة ثم إضافة محلول الفوسفات المعقم المخزنة (1x PBS)، لإزالة الآثار المتبقية من مصل البقرة الجنين (FBS).
- التعرق برنامج تلفزيوني من قارورة زراعة الأنسجة. إضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين (لقارورة T75) ثم دوامة القارورة بحيث يتم تغطية السطح كله من القارورة مع الخلايا بواسطة التربسين.
- احتضان القارورة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 3 دقائق. تحقق الخلايا بشكل دوري، عن طريق التنصت على جانبي القارورة لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد خلعت.
- إزالة القارورة من حاضنة ثقافة الخلية وإضافة 5 مل من وسائل الإعلام تستكمل مع FBS لتحييد التربسين.
ملاحظة: لا تترك الخلايا في التربسين أطول من اللازم، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا ويؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا. - تعليق بابيبت عدة مرات للحصول على تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مركزي مخروطي.
- خلايا بيليه عن طريق الغزل في 350 × ز لمدة 3 دقائق.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1x.
- الخلايا ريسوسينيد في 50 مل من 1X PBS العقيمة وغسل الخلايا عن طريق تعليق الخلايا الأنابيب صعودا وهبوطا. خلايا بيليه عن طريق الغزل في 350 × ز لمدة 3 دقائق.
- pirate الخلايا عظمى وsuspend في 15 مل من برنامج تلفزيوني عقيم 1x. غسل الخلايا عن طريق تعليق الخلايا الأنابيب صعودا وهبوطا. خلايا بيليه عن طريق الغزل في 350 × ز لمدة 3 دقائق.
- pirate الخلايا فائقة و resuspend في بالضبط 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيم 1x. غسل الخلايا كما في الخطوة 1.1.4.2 ونقل كمية صغيرة (حوالي 100 ميكرولتر) من تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي للعد. خلايا بيليه عن طريق الغزل في 350 × ز لمدة 3 دقائق.
- تحديد رقم الخلية باستخدام طريقة استبعاد الأزرق Trypan باستخدام إما قياس الهيموسيت أو عداد خلية الآلي. خلايا إعادة التجمّع في 1x PBS معقمة بتركيز 5 x 106 خلايا/مل. إبقاء تعليق الخلية على الجليد.
ملاحظة: يجب أن تكون صلاحية الخلايا السرطانية مساوية أو أعلى من 80% لضمان نمو الورم القابل للتكرار.
- تأكد من أن يتم الاحتفاظ بخط الخلية في الوسائط الموصى بها. على سبيل المثال، الحفاظ على WEHI 164 خط الخلية في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تكملها 2 M L-الجلوتامين، 10٪ مصل الأبقار الجنين، 20 mM HEPES، 0.05 mM 2-mercaptoethanol، 100 U/mL البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل ستريبسين.
- التلقيح تحت الجلد
- اخلطي تعليق الخلية جيداً و املأي حقنة بإبرة 26 G مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا (5 × 105 خلايا) في برنامج تلفزيوني معقمة 1x PBS. كرر خلط الخلايا قبل تحميل الحقنة التالية.
ملاحظة: إبقاء الخلايا على الجليد طوال الإجراء للحفاظ على قابلية البقاء. - كبح جماح الماوس بشكل مناسب، وضمان الوصول إلى الجناح الأيمن السفلي. تلقيح الماوس تحت الجلد على حلق الجناح السفلي الأيمن.
ملاحظة: تأكد من أن التطعيم ليس في الصفاق عن طريق رفع الإبرة قليلاً، والتي يجب أن تكون مرئية تحت الجلد. وينبغي أن تشكل كتلة تشبه الفقاعة تحت الجلد بعد التطعيم. - مراقبة الفئران كما هو مطلوب من قبل موافقة الأخلاقيات المعمول بها وإجراء استئصال الجراحية عندما نمت الأورام إلى حجم حوالي 50 مم2.
- اخلطي تعليق الخلية جيداً و املأي حقنة بإبرة 26 G مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا (5 × 105 خلايا) في برنامج تلفزيوني معقمة 1x PBS. كرر خلط الخلايا قبل تحميل الحقنة التالية.
2. استئصال جزئي جراحي للورم
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول اثنين من الباحثين; واحدة للعمليات الجراحية (SURGEON)، وأخرى لرصد الماوس (مساعد).
- إعداد الجراحة
- في اليوم 12 بعد التطعيم, عندما وصلت الأورام حجم ما يقرب من 50 مم2,جرعة الفئران مع 100 ميكرولتر (0.1 ملغ/كغ) من البوبرينورفين s.c. في scruff من الرقبة, 30 دقيقة قبل الجراحة.
- قم بإعداد المنطقة الجراحية مع وسادة حرارية مغطاة بمعطف مقاعد البدلاء واقامة مخروط الأنف للتخدير. تعقيم الأدوات الجراحية قبل استخدامها، وبين كل باستخدام معقمة حبة الحرارة، مما يسمح للأدوات لتبرد قبل الاستخدام. وقد المعدات الجراحية التالية نظيفة وفي متناول اليد: chlorhexidine، مسحة، الشاش، هلام العين، اثنين من ملقط المنحني، مقص، كليب applicator، مزيل مقطع، كليب عبوات (الشكل 2A، 2B).
- تدفئة غرفة التدفئة إلى 37 درجة مئوية واقامة آخر وسادة الحرارة لاسترداد(الشكل 2C). ضع أدوات معقمة على سطح معقمة مثل منصات autoclaved.
- التخدير
- ضع الفأر في غرفة الحث و قم بتحيين الماوس مع 4% ايزوفلوران (4% في 100% من الأكسجين بمعدل تدفق 1 لتر/دقيقة) حتى يتباطأ معدل التنفس إلى ما يقرب من 60 نفساً في الدقيقة (1 في الثانية) (وهذا عادة ما يستغرق <1 دقيقة).
ملاحظة: لا تترك الماوس في الغرفة لفترة طويلة جداً لأن ذلك قد يؤدي إلى الاختناق والموت. لديك فأر واحد فقط تحت التخدير في كل مرة. - نقل الماوس على وسادة الحرارة على طاولة الجراحة، ووضع الماوس مع أنفها في مخروط الأنف والحفاظ على حالة التخدير مع isoflurane 3-4٪ في الأكسجين 100٪ بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة. لمراقبة معدل التنفس لضمان الحفاظ على عمق التخدير.
ملاحظة: يجب أن يراقب المساعد تنفس الماوس طوال الجراحة لضمان الحفاظ على المستوى الصحيح للتخدير. خفض تركيز التخدير إذا أصبح التنفس بطيئا جدا أو زيادة التركيز إذا كان عمق التخدير ضحلة جدا. إذا بدأ الماوس يلهث، إزالة الماوس من مخروط الأنف، وانخفاض تركيز مخدر، وانتظر حتى يُطَعَل التنفس قبل وضع على مخروط الأنف مرة أخرى. - إجراء "اختبار قرصة" و "اختبار انعكاس القرنية"14 لضمان تخدير الماوس بالكامل قبل بدء الجراحة.
ملاحظة: حركة أي جزء من الماوس هو إشارة إلى أن الماوس غير مُ تخدير بالكامل. وينبغي أن تعطى على الفور الحيوان مخدر إضافية عن طريق زيادة تركيز مخدر. - غطي عينا الماوس بكمية صغيرة من الجلّات التي تُحلّق في العين لتجنب جفاف العين.
- ضع الفأر في غرفة الحث و قم بتحيين الماوس مع 4% ايزوفلوران (4% في 100% من الأكسجين بمعدل تدفق 1 لتر/دقيقة) حتى يتباطأ معدل التنفس إلى ما يقرب من 60 نفساً في الدقيقة (1 في الثانية) (وهذا عادة ما يستغرق <1 دقيقة).
- العمليات الجراحية (SURGEON)
- مسحة المنطقة الجراحية 3 مرات مع الكلورهيكسيدين الكحولية. باستخدام ملقط وزوج من مقص، وجعل شق مستقيم 1 سم على طول الجانب الظهري، 3 مم بعيدا عن الورم (الشكل 3A، 3B).
ملاحظة: إن توحيد الشق إلى 1 سم في كل فأرة (باستخدام مسطرة) يسمح بتقييم حتى التئام الجروح بين الفئران. تحديد موقع شق 3 مم بعيدا عن الورم يسمح للعلاج اللاحقة داخل المفصل المساعد دون تسرب من الجرح. - باستخدام ملاقط، سحب بعيدا في facia والأنسجة الدهنية تحت الجلد بين الورم والصواني. عادة ما يتم ربط الورم تحت الجلد إلى جانب الجلد.
- فتح الجرح عن طريق عقد بلطف الجلد على الجانب تحمل الورم باستخدام ملاقط، و "عكس" الورم بحيث يكون مرئيا خارج (الشكل 3C، 3D).
ملاحظة: يجب أن يكون الجزء من الورم الذي يجب إزالة غلقه أقرب إلى الفتحة، ليكون لديه ما يكفي من الجلد لإغلاق الجرح. يجب الحرص على عدم قطع الجلد عند إزالة الورم. - باستخدام زوج من مقص، وقطع بعيدا كبسولة الورم من النصف لإزالة، بدءا من قاعدة الورم الأقرب إلى الفتحة.
- لجراحة 50٪ ديبولك، قطع عبر منتصف الورم. باستخدام ملقط منحنية، مغرفة حتى قسم من الورم ليتم إزالتها (50٪)؛ مغرفة أي بقايا من منطقة debulked.
- ل 75% ديبولك, إجراء 50% ديبول الورم كما هو الحال في الجزء 2.3.5 أعلاه. ثم خفض في النصف المتبقية 50٪ من الورم ويغرف حتى 25٪ من الورم، وذلك باستخدام ملقط المنحني كما هو موضح أعلاه.
- مسحة المنطقة الجراحية 3 مرات مع الكلورهيكسيدين الكحولية. باستخدام ملقط وزوج من مقص، وجعل شق مستقيم 1 سم على طول الجانب الظهري، 3 مم بعيدا عن الورم (الشكل 3A، 3B).
- إغلاق موقع الجراحة
- ضع الورم المتبقي مرة أخرى تحت الجلد، واستخدام ملقط، اسحب رفرفات الجلد معًا واصطف الجلد على طول الجرح.
- عقد الجلد معا 5 مم من حافة الجرح، واستخدام لقطات جراحية لإغلاق الجرح، بدءا من الجانب الأقرب إلى ملقط. تطبيق العديد من مقاطع حسب الحاجة لضمان عدم تعرض الأنسجة الكامنة. عموما، يتم تطبيق ثلاثة إلى أربعة مقاطع مع 2 مم التباعد بين القصاصات.
ملاحظة: إذا لم يتم تطبيق أي قصاصات بشكل جيد، إزالته باستخدام مزيل قصاصة واستبدالها مقاطع جديدة.
- استعادة الفئران (مساعد)
- السماح للفئران لاسترداد عن طريق وضعها في غرفة التدفئة الدافئة (37 درجة مئوية).
- ضع قفص الفأر على وسادة الحرارة. مراقبة الفئران في غرفة التدفئة حتى أنها قد تعافى من مخدر (مستيقظا والمشي) ومن ثم وضع الفئران مرة أخرى في القفص. اترك القفص على منصة الحرارة لمدة 10 دقائق أخرى ، حتى تصبح الفئران أكثر نشاطًا.
- إعطاء الفئران المواد الغذائية الرطبة والناعمة. مراقبة الفئران 1 ساعة بعد الجراحة للتعافي وضمان لقطات تبقى في مكانها. تأكد من أن القفص نصف على / نصف قبالة وسادة الحرارة للسماح للحيوانات لتنظيم درجة الحرارة الذاتي في حين غير المراقب.
- جرعة الفئران مع 0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين (100 ميكرولتر تحت الجلد في scruff من الرقبة)، 6-8 ساعات بعد الجراحة (في نهاية اليوم). مراقبة الفئران في وقت مبكر من صباح اليوم التالي، وجرعة الفئران مرة أخرى مع 0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين (100 ميكرولتر تحت الجلد في scruff من الرقبة). إعطاء المزيد من المواد الغذائية الرطبة حسب الحاجة.
- مراقبة الفئران يوميا للأيام السبعة المقبلة. يمكن إزالة القصاصات بعد سبعة أيام باستخدام مزيل القصاصة.
- Adjuvant أو العلاج المساعد الجديد
- علاج الفئران حول العملية الجراحية مع (نيو) adjuvant therapy في أي وقت من الأوقات، اعتمادا على علاج الفائدة.
- على سبيل المثال، علاج الفئران بجرعة واحدة من 100 ميكروغرام من مضاد CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) في اليوم 15 بعد التطعيم، أو مع ثلاث جرعات من 200 ميكروغرام المضادة PD-1 i.p. في اليوم 15 و 17 و 19 بعد التطعيم.
- الضوابط التجريبية
- عند استخدام هذا النموذج لتقييم آثار الالتهاب / التئام الجروح ، فكر في استخدام مجموعات التحكم التالية: 1) عدم التحكم في الجراحة (لا يزال من الممكن إعطاء العلاجات داخل الدماغ) ؛ 1) مراقبة عدم الجراحة (لا يزال من الممكن إعطاء العلاجات داخل الدماغ). 2) مراقبة جراحة صورية: يتم إجراء شق جراحي في الجلد؛ يتم التلاعب بالورم وفضحه ، ولكن لا تتم إزالة أنسجة الورم ؛ الجرح مغلق مع مقاطع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نمو الورم إلى حجم 50 ملم2 هو حجم مثالي للفك الجزئي. ال استئصال جراحية غير مكتملة من 50 مم2 نتائج الأورام في 100% (ن = 5) إعادة إنتاج للأورام في غياب العلاج المناعي المساعد(الشكل 4A). استخدمنا النموذج التالي لاختبار العلاجات المناعية المساعدة باستخدام الأجسام المضادة ضد جزيئات نقطة التفتيش Cytotoxic T Lymphocyte البروتين المرتبط 4 (CTLA-4) ومستقبل الموت المبرمج 1 (PD-1). وأدى علاج الفئران مع المضادة للCTLA-4 أو المضادة PD-1 في معدل علاج 80٪ و 25٪ (ن = 4-5 لكل مجموعة)، على التوالي(الشكل 4B، 4C). توفر الاستجابة باستخدام ANTI-PD-1 فرصة لاختبار مجموعات جديدة لتحسين معدل الاستجابة بشكل أكبر.
الشكل 1: رسم تخطيطي لل استئصال جزئي جراحي للورم. (أ)يتم تلقيح فئران BALB/c بـ 5 × 105 خلايا WEHI-164 على الجناح الأيمن السفلي. (ب) عندما يصل الورم إلى 50 مم2، يمكن أن تبدأ الجراحة. (C) الورم هو جزئيا (50 ٪ هو مبين). (D) يتم إغلاق موقع الجراحة مع لقطات. (E) يمكن إعطاء العلاج المساعد ، عن طريق الوريد ، intraperitoneally (يظهر) أو داخل الفم في منطقة الجرح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية لعملية جراحية تم إعدادها. (أ) صورة كاملة لعملية جراحية إعداد تظهر الأدوات الجراحية (المدرجة في الخطوة 2.1) وآلة التخدير. (ب) صورة سريعة للطاولة الجراحية تظهر جميع المواد في متناول اليد. (C) غرفة التدفئة ومنصة التدفئة لاستعادة الماوس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية لتقنية إزالة البول الجزئي للورم. (أ) فأر مُجرّد تخدير كامل مع ورم50 مم 2 في الحجم قبل الجراحة. (ب) شق الموقع 3 مم بعيدا عن الورم; 1 سم شق. (C-D) فتح الجرح عن طريق عقد بلطف الجلد على الجانب تحمل الورم باستخدام ملاقط، و "عكس" الورم بحيث يكون مرئيا في الخارج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إعادة نمو الورم بعد استئصال الورم غير المكتمل والعلاج المناعي. (أ)منحنيات إعادة نمو الورم من الأورام التي تم استئصالها جزئيا WEHI-164 في غياب العلاج المناعي المساعد. (B-C) الورم ينمو بعد الجراحة والعلاج المساعد مع مكافحة CTLA-4 (B) أو المضادة PD1 (C). يشير الخط المنقط إلى يوم الجراحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نقدم بروتوكول لنموذج الماوس من استئصال جراحية غير مكتملة من ساركوما الأنسجة الرخوة لاختبار العلاجات حول العملية. كما قمنا بتوحيد الشق الجراحي للسماح بتقييم التئام الجروح بين الفئران بعد العلاج.
وضع الورم هو جزء مهم من هذا البروتوكول. لقد اخترنا نموذج ورم تحت الجلد للسماح بسهولة الوصول الجراحي إلى موقع الورم وإدارة العلاجات المحلية مع الحد الأدنى من العبء على الفئران. من المهم أيضا التأكد من أن الأورام تنمو في الفضاء تحت الجلد وليس داخل الصفاق، والتي يمكن أن تؤدي إلى المراضة والوفيات غير متوقعة.
عند اختيار خط الخلايا السرطانية لهذا البروتوكول، ننصح بأن الخلايا عندما تنمو في الجسم الحي تشكل كتلة صلبة (على سبيل المثال، نموذج WEHI-164)، بدلاً من كتلة شبه صلبة (مثل نموذج B16) حيث أنه من الصعب من الناحية الفنية إعادة الاستئصال جزئيًا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا بدأ الورم ينمو من خلال الجلد (ينظر إليه عادة في الأورام أكبر من 100 مم2)، فلا ينصح بفك الbulking لأن الجلد قد يصبح نخريًا ولا يشفي جيدًا بعد الجراحة. لقد تغلبنا على هذه المشكلة عن طريق إزالة الأورام بمجرد أن تصل إلى 50 ملم2 في الحجم.
كما يمكن استخدام نموذجنا لتقييم تأثير التئام الجروح على العلاج، نقترح مجموعة السيطرة / صور للمقارنة. قد يكون السيطرة الورم غير معلّل، أو جراحة صورية التي سيكون لها فقط شق الجلد، والتعرض للورم، وإغلاق الجرح دون ديبول جزئي الورم. ويمكن استخدام هذه المجموعة من السيطرة صور عند تمييز تأثير التهاب الناجم عن الجراحة والتئام الجروح من debulk الجزئي على نتائج العلاج.
لنجاح جراحة إزالة العضاز الجزئي، يجب النظر في بعض النقاط التقنية. جانب مهم هو زرع الصحيح ونمو الورم. الأورام تحتاج إلى زرع على الجانب السفلي الأيمن، بعيدا عن الساق الخلفية. يمكن أن تتداخل الأورام التي يتم زرعها بالقرب من الساق الخلفية مع قدرتها على المشي ويمكن أن تؤدي إلى قوة إضافية على مقاطع مما تسبب في الخروج. بالإضافة إلى ذلك، الاتساق في حجم الورم أمر بالغ الأهمية من أجل تجنب التباين في النسبة المئوية النسبية للفك. اخترنا إجراء عملية جراحية مع الأورام التي لديها حجم 50 مم2، لجعل عملية جراحية مباشرة من الناحية الفنية ، على الرغم من أننا نتصور أن استئصال جزئي على الأورام الصغيرة هو ممكن. لمنع عدم الاتساق في حجم الورم، يجب أن يتم تمرير خط الخلية المستخدم باتباع تقنيات ثقافة الخلايا القياسية المناسبة، ويحتاج الباحث إلى تدريب كافٍ على تقنية التطعيم السليمة للورم. عند توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل نماذج أخرى من الأورام تحت الجلد، فإن الخصائص الفيزيائية للورم لها أهمية. على سبيل المثال، وجدنا أن خطوط الخلايا التي تؤدي إلى الأورام الناعمة والجيلاتنية (على سبيل المثال، M3-9-M rhabdomyosarcoma، وB16 الميلانوما15)هي صعبة من الناحية الفنية لفك.
وهناك أيضا النقاط التقنية التي تحتاج إلى النظر في أثناء الجراحة. الفئران تحتاج إلى تخدير مناسب لمنع الحركة أثناء الإجراء. وبصرف النظر عن impost أن الفئران تخدير غير كاف سوف تتحمل، أي حركة الفئران أثناء العملية يمكن أن تجعل استئصال الجراحية صعبة، مما يؤدي إلى تقلب في حجم الورم إزالتها بين الفئران. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يتم رصد معدل التنفس الماوس بعناية أثناء الجراحة يجب تعديل تركيز Isoflurane للحفاظ على عمق مناسب للتخدير. لذلك، هناك حاجة دائما إلى مساعد خلال العملية الجراحية لمراقبة معدل التنفس أثناء الجراحة، وضمان مستوى كاف من التخدير. حجم الشق يجب أن تكون متسقة من أجل تجنب التباين في استجابة التئام الجروح. وجدنا أن شق 1-1.5 سم يكفي لتمصال الورم، مع فرصة ضئيلة للديهينسي.
نموذجنا من استئصال جزئي يحاكي المرض المتبقية بعد الجراحة كما رأينا في الإعداد السريرية للعديد من الأورام الصلبة، ويقدم مزايا على نماذج الماوس السينيجيني التقليدية من خلال الأخذ في الاعتبار تأثير التئام الجروح الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت النماذج التقليدية الموجودة من الجراحة استئصال الورم الكامل، والذي لا يؤدي دائما إلى تكرار الورم16. وقد استخدم باحثون آخرون بنجاح نماذج جزئية للرفط باستخدام خطوط الخلايا السرطانية الأخرى11,12,13, مما يؤكد على قوة هذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن استئصال جزئي، ولكن ليس استئصال كامل، أدى إلى الحماية المضادة للورم الذاكرة المناعية عندما تعطى العلاج المساعد12 الذي كان يعزى إلى استمرار المستضدات من الورم المتبقي.
تم تصميم هذا النموذج لدراسة تأثير الالتهاب والتئام الجروح على العلاج. نهجنا إزالة الbulking يشبه سريريا الحالات السريرية حيث يتم ترك المرض المتبقية الإجمالي وراء بعد الجراحة (R2 استئصال)، بدلا من استئصال كامل العيان مع مرض المتبقية المجهرية (R1 استئصال). على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي استئصال جراحي في ساركوما الأنسجة الرخوة الغازية إلى هوامش إيجابية عندما يقع الورم بجوار الهياكل الحرجة مثل الأعصاب أو الشرايين أو الأعضاء المجاورة، مما يحول دون استئصاله بالكامل بهوامش واسعة17. وقد نشرت نماذج لعملية جراحية للرصاص مما أدى إلى هوامش إيجابية مجهرية13; يمكن استخدام بروتوكول لدينا لدراسة تأثير استجابة التئام الجروح على العلاج عندما يكون المرض المتبقي العيانية موجود.
وهناك قيد على نموذجنا هو أنه لا يؤدي إلى الانتكاس البعيد وmicrometastasis، وهو أمر شائع بعد الجراحة في الأورام الصلبة مثل سرطان الثدي أو سرطان البنكرياس. نماذج أخرى من الجراحة, مثل مورين نموذج سرطان الثدي 4T118,,19,,20 أو نماذج مورين منnovo novo ورمامي السرطان21 هي أكثر ملاءمة للتحقيق في الانتكاس الجهازية بعد استئصال المحلية. وثمة قيد آخر هو أن هذا البروتوكول هو لنماذج تحت الجلد ، وبالتالي لا يسمح بتقييم أمراض الأنسجة الخاصة. لهذا الغرض، نماذج الماوس الورم العظام المناسبة7،,22،,23. ومع ذلك ، فإن نماذج تقويم العظام هي أكثر تحديا وعادة ما تنطوي على قدر أكبر من المحتالة للفئران ، وأكثر شاقة ومكلفة22. النماذج تحت الجلد مناسبة تماما لتقييم آثار (الجدد) العلاجات المساعدة، إما بشكل نظامي أو محليا، على الانتكاس السرطان المحلية، بطريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية نسبيا مع الحد الأدنى impost للحيوانات.
ال جزئ ناقصة اقص كما هو مبين في هذا البروتوكول مفيد لاختبار العلاجات المساعدة في حين دمج الجروح الجراحية التئام كعامل, متغير الذي غالبا ما يتم تجاهله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا إفصاحات.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من المنح من سوك إلى ساركوما! المؤسسة، ورابطة ساركوما الأسترالية والنيوزيلندية، ومؤسسة أبحاث سرطان الدم للأطفال، والأعمال الخيرية الدائمة. ويدعم W.J.L من قبل زمالة سيمون لي وزمالات بحثية من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية، ومجلس السرطان WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
