Summary
In questo protocollo, descriviamo un modello murino di resezione chirurgica incompleta del sarcoma dei tessuti molli per testare (neo)le terapie adiuvanti.
Abstract
La chirurgia è spesso il primo trattamento per molti tumori solidi. Tuttavia, le ricadute locali si verificano frequentemente a seguito della resezione tumorale primaria, nonostante le terapie adiuvanti o neo-adiuvanti. Ciò si verifica quando i margini chirurgici non sono sufficientemente privi di tumore, con conseguente cellule tumorali residue. Da un punto di vista biologico e immunologico, la chirurgia non è un evento nullo; l'ambiente di guarigione delle ferite è noto per indurre vie sia pro- e anti-tumorale. Di conseguenza, i modelli preclinici per lo sviluppo di farmaci volti a prevenire le ricadute locali dovrebbero incorporare la resezione chirurgica durante il test di nuove terapie (neo)adhavant, per modellare le impostazioni cliniche in pazienti trattati con chirurgia.
Qui, descriviamo un modello murino di resezione chirurgica incompleta del sarcoma dei tessuti molli WEHI 164 che consente di testare (terapie neo)adiuvanti nell'impostazione di una risposta di guarigione della ferita. In questo modello, 50% o 75% del tumore viene rimosso, lasciando dietro di sé alcuni tessuti tumorali in situ per modellare la malattia residua lorda dopo l'intervento chirurgico in ambiente clinico. Questo modello consente di testare le terapie nel contesto della chirurgia, considerando anche la risposta di guarigione della ferita, che può influenzare l'efficacia dei (neo)trattamenti associati. La resezione chirurgica incompleta si traduce in ricrescita riproducibile del tumore in tutti i topi in assenza di terapia adiuvante. Il trattamento adiuvante con blocco dei checkpoint si traduce in una ridotta ricrescita del tumore. Questo modello è quindi appropriato per testare le terapie nel contesto della chirurgia di debulking e della relativa risposta di guarigione della ferita e può essere esteso ad altri tipi di cancro solido.
Introduction
La chirurgia rimane l'opzione di trattamento principale per molti tumori solidi1, tra cui sarcoma dei tessuti molli2,3. Nonostante i miglioramenti nelle tecniche di chirurgia del cancro, e le combinazioni con (neo)terapie associate, c'è ancora un alto rischio di ricaduta del cancro e metastasi a seguito della resezione tumorale primaria4,5. Nel sarcoma dei tessuti molli, le ricadute si verificano particolarmente locoregionale, nel sito di intervento chirurgico, con conseguente aumento della morbilità e della mortalità. In ambito clinico, può essere difficile ottenere margini abbastanza ampi (ad esempio, a causa di vincoli anatomici), con conseguente resezione incompleta e successiva ricorrenza tumorale6. Lo stress chirurgico e il successivo processo di guarigione delle ferite sono noti per creare un microambiente tumorale immunosoppressivo favorevole per la ricorrenza del tumore7,8. Pertanto, la scoperta e lo sviluppo di nuove terapie per il sarcoma dei tessuti molli, in particolare le immunoterapie, dovrebbe idealmente prendere in considerazione la risposta chirurgica di guarigione della ferita.
La maggior parte degli studi preclinici per le terapie adiuvanti vengono inizialmente effettuati utilizzando modelli di topo singenici o xenotrapianto sottocutanei, senza incorporare lo stress chirurgico e la risposta di guarigione delle ferite9,10. Pertanto, abbiamo sviluppato un modello di sarcoma dei tessuti molli topo subgenico singenico che incorpora una resezione chirurgica incompleta. WEHI 164 cellule fibrosarcoma sono inoculated sottocutaneamente, e una volta che i tumori sono stabiliti, rimuoviamo 50-75% della massa tumorale (Figura 1A-E). I tumori ricrescono costantemente dal tumore rimanente. Questo modello consente di testare le terapie adiuvanti considerando l'effetto dello stress chirurgico e della guarigione delle ferite. Modelli chirurgici simili di resezione incompleta sono stati utilizzati in una serie di studi da diversi gruppi e trovati per essere riproducibili ed efficaci11,12,13. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di questo protocollo.
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Protocol
Gli animali utilizzati in questi esperimenti sono stati ottenuti dall'Animal Resource Centre (Perth, Australia Occidentale). Gli animali sono stati mantenuti in condizioni standard prive di agenti patogeni presso l'Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Australia Occidentale). Tutti gli esperimenti sono stati effettuati seguendo il protocollo approvato dal Comitato etico animale Harry Perkins Institute of Medical Research. In questi esperimenti sono stati utilizzati topi BALB/c di 8-12 settimane di età. La linea cellulare del fibrosarcoma WEHI 164 è stata ottenuta da CellBank Australia (Westmead, Nuovo Galles del Sud).
1. Inoculazione delle cellule
- Preparazione di cellule e animali
- Assicurarsi che la linea di celle sia mantenuta nel supporto consigliato. Ad esempio, mantenere weHI 164 linea cellulare in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media integrata con 2 mM L-glutamina, 10% siero bovino fetale, 20 m HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoenol, 100 U/mL penicillina, e 100 g / mL streptomica.
NOTA: Passare le cellule almeno 3 e fino a 5 volte dopo essere state rimosse dall'immagazzinamento criogenico. Per garantire una vitalità cellulare ottimale, le cellule devono essere divise quando sono tra 70-80% confluente. Le linee cellulari tumorali devono essere testate per il micoplasma, poiché l'infezione può alterare la crescita cellulare e influenzare la risposta immunitaria in vivo. - Un giorno prima dell'inoculazione, radere i topi sul fianco inferiore destro usando i clipper.
NOTA: in questo esperimento sono stati utilizzati topi femminili BALB/c, di età compresa tra 8-12 settimane, di peso normale (16 -22 grammi). - Il giorno dell'inoculazione, raccogliere WEHI 164 cellule quando 70-80% confluente per tentativpsinizzazione.
- Aspirare il mezzo di coltura dai flaconi di coltura dei tessuti e quindi aggiungere la soluzione sterile di fosfato tamponata (1x PBS), per rimuovere le tracce rimanenti del siero bovino fetale (FBS).
- Aspirare la PBS dai flaconi della coltura dei tessuti. Aggiungere 3 mL di 0,05% di ciplo (per un flacone T75) e quindi girare il flacone in modo che l'intera superficie del flacone con le cellule sia coperta da trypsin.
- Incubare il pallone a 37 gradi centigradi, 5% dicovampiera di CO 2 per 3 min. Controllare periodicamente le cellule, toccando i lati del pallone per vedere se le cellule si sono sloggiate.
- Rimuovere i flaconi dall'incubatrice a coltura cellulare e aggiungere 5 mL di supporti integrati con FBS per neutralizzare la trypsin.
NOTA: Non lasciare le cellule in trypsin più a lungo del necessario, in quanto ciò può danneggiare le cellule e portare a bassa vitalità cellulare. - Sospensione Pipet più volte per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare a un tubo centrifuga conico.
- Cellule di Pellet ruotando a 350 x g per 3 min.
- Lavare le cellule tre volte in 1x PBS.
- Risospendere le cellule in 50 mL di pbS sterile 1x e lavare le cellule con il tubo delle sospensioni cellulari su e giù. Cellule di Pellet ruotando a 350 x g per 3 min.
- Aspirare le cellule sovrnatali e risospendere in 15 mL di sterile 1x PBS. Lavare le cellule con la sospensione cellulare con voglia su e giù. Cellule di Pellet ruotando a 350 x g per 3 min.
- Aspirare le cellule sovrnatali e risospendere in esattamente 10 mL di sterile 1x PBS. Lavare le cellule come al punto 1.1.4.2 e trasferire una piccola quantità (circa 100 lL) di sospensione cellulare in un tubo di centrifuga per il conteggio. Cellule di Pellet ruotando a 350 x g per 3 min.
- Determinare il numero di cella utilizzando il metodo di esclusione blu Trypan utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato. Risospendere le cellule in sterile 1x PBS ad una concentrazione di 5 x 106 cellule / mL. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
NOTA: La vitalità delle cellule tumorali deve essere uguale o superiore all'80 % per garantire una crescita tumorale riproducibile.
- Assicurarsi che la linea di celle sia mantenuta nel supporto consigliato. Ad esempio, mantenere weHI 164 linea cellulare in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media integrata con 2 mM L-glutamina, 10% siero bovino fetale, 20 m HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoenol, 100 U/mL penicillina, e 100 g / mL streptomica.
- Inoculazione sottocutanea
- Mescolare accuratamente la sospensione cellulare e riempire una siringa con un ago da 26 G con 100 -L di sospensione cellulare (5 x 105 celle) in sterile 1x PBS. Ripetere la miscelazione delle cellule prima di caricare la siringa successiva.
NOTA: Mantenere le cellule sul ghiaccio per tutta la procedura per mantenere la vitalità. - Trattenere il mouse in modo appropriato, garantendo l'accesso al fianco inferiore destro. Inoculare il topo sottocutaneo sul fianco inferiore destro rasato.
NOTA: Assicurarsi che l'inoculazione non sia nel peritoneo sollevando leggermente l'ago, che dovrebbe essere visibile sotto la pelle. Un nodulo simile a una bolla dovrebbe formarsi sotto la pelle dopo l'inoculazione. - Monitorare i topi come richiesto dall'approvazione etica applicabile ed eseguire la resezione chirurgica quando i tumori sono cresciuti fino a una dimensione di circa 50 mm2.
- Mescolare accuratamente la sospensione cellulare e riempire una siringa con un ago da 26 G con 100 -L di sospensione cellulare (5 x 105 celle) in sterile 1x PBS. Ripetere la miscelazione delle cellule prima di caricare la siringa successiva.
2. Resezione chirurgica parziale del tumore
NOTA: Questo protocollo richiede DUE ricercatori; uno per le procedure chirurgiche (SURGEON) e un altro per il monitoraggio del topo (ASSISTANT).
- Configurazione chirurgia
- Il giorno 12 post inoculazione, quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di circa 50 mm2, dosi di topi con 100 (L L) di buprenorfina s.c. nella mischia del collo, 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
- Impostare l'area chirurgica con un tergiglio riscaldato coperto con panca e impostare un cono naso per l'anestesia. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima dell'uso e tra ogni animale utilizzando uno sterilizzatore di perline di calore, consentendo agli strumenti di raffreddarsi prima dell'uso. Avere le seguenti apparecchiature chirurgiche pulite e a portata di mano: clorhesidina, tampone, garza, gel occhio, due pinze curve, forbici, applicatore clip, rimozione clip, clip ripieno (Figura 2A, 2B).
- Riscaldare la camera di riscaldamento a 37 gradi centigradi e impostare un altro blocco di calore per il recupero (Figura 2C). Posizionare gli utensili sterilizzati su una superficie sterile come le pastiglie autoclaved.
- Anestesia
- Posizionare il mouse nella camera di induzione e anesizzare il mouse con il 4% di isoflurane (4% in 100% di ossigeno ad una velocità di flusso di 1 L/min) fino a quando la frequenza respiratoria rallenta a circa 60 respiri al minuto (1 al secondo) (questo di solito prende <1 min).
NOTA: Non lasciare il mouse nella camera per troppo tempo che possa portare ad asfissia e morte. Avere solo un topo sotto anestesia alla volta. - Trasferire il mouse sul pad di calore sul tavolo di intervento chirurgico, posizionare il mouse con il naso nel cono del naso e mantenere lo stato anestetico con 3-4% isoflurane in 100% ossigeno ad una portata di 0,5 L/min. Monitor la frequenza respiratoria per garantire che la profondità di anestesia è mantenuta.
NOTA: l'ASSISTANT deve monitorare la respirazione del topo durante l'intervento chirurgico per garantire il corretto livello di anestesia è mantenuto. Abbassare la concentrazione anestetica se la respirazione diventa troppo lenta o aumentare la concentrazione se la profondità dell'anestesia è troppo bassa. Se il mouse inizia a ansimante, rimuovere il mouse dal cono naso, diminuire la concentrazione anestetica, e attendere fino a quando la respirazione si normalizza prima di mettere sul cono naso di nuovo. - Eseguire un "test di pizzico" e un "test del riflesso corneale"14 per assicurarsi che il mouse sia completamente anetizzato prima di iniziare l'intervento chirurgico.
NOTA: Il movimento di qualsiasi parte del mouse indica che il mouse non è completamente afizzato. All'animale deve essere immediatamente somministrato un anestetico aggiuntivo aumentando la concentrazione anestetica. - Coprire gli occhi del mouse con una piccola quantità di gel oftalmico per evitare la secchezza degli occhi.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione e anesizzare il mouse con il 4% di isoflurane (4% in 100% di ossigeno ad una velocità di flusso di 1 L/min) fino a quando la frequenza respiratoria rallenta a circa 60 respiri al minuto (1 al secondo) (questo di solito prende <1 min).
- Procedura chirurgica (SURGEON)
- Swab l'area chirurgica 3 volte con clorhessia alcolica. Utilizzando pinze e un paio di forbici, fare un 1 cm di incisione dritta lungo il lato dorsale, 3 mm di distanza dal tumore (Figura 3A, 3B).
NOTA: la standardizzazione dell'incisione a 1 cm in ogni topo (utilizzando un righello) consente di valutare uniformemente la guarigione della ferita tra i topi. Individuare l'incisione di 3 mm di distanza dal tumore consente la successiva terapia adiuvante intratutale senza perdite dalla ferita. - Utilizzando una pinzetta, tirare via la facia e il tessuto adiposo sottocutaneo tra il tumore e il peritoneo. Il tumore sottocutaneo è normalmente attaccato al lato della pelle.
- Aprire la ferita tenendo delicatamente la pelle sul lato portante del tumore utilizzando una pinzetta e "invertire" il tumore in modo che sia visibile all'esterno (Figura 3C, 3D).
NOTA: La sezione del tumore da debulked deve essere più vicina all'apertura, per avere abbastanza pelle per chiudere la ferita. Fare attenzione a non tagliare la pelle quando si rimuove il tumore. - Utilizzando un paio di forbici, tagliare la capsula tumorale dalla metà per rimuovere, a partire dalla base del tumore più vicina all'apertura.
- Per la chirurgia del 50% del debulk, tagliare attraverso il centro del tumore. Utilizzando pinze curve, raccogliere la sezione del tumore da rimuovere (50%); raccogliere eventuali resti dalla zona debulked.
- Per 75% debulk, eseguire un 50% debulk tumore come nella parte 2.3.5 sopra. Quindi tagliare a metà il restante 50% del tumore e raccogliere il 25% del tumore, utilizzando la forza curva come descritto sopra.
- Swab l'area chirurgica 3 volte con clorhessia alcolica. Utilizzando pinze e un paio di forbici, fare un 1 cm di incisione dritta lungo il lato dorsale, 3 mm di distanza dal tumore (Figura 3A, 3B).
- Chiusura del sito chirurgico
- Posizionare il tumore rimanente sotto la pelle, e con le pinze, tirare i lembi della pelle insieme e allineare la pelle lungo la ferita.
- Tenere la pelle insieme 5 mm dal bordo della ferita e utilizzare clip chirurgiche per chiudere la ferita, iniziando sul lato più vicino alle pinze. Applicare tutte le clip necessarie per garantire che nessun tessuto sottostante sia esposto. In genere, da tre a quattro clip vengono applicate con spazi di 2 mm tra le clip.
NOTA: se le clip non sono ben applicate, rimuoverle con un ritaglio e sostituirle con nuove clip.
- Recupero dei topi (ASSISTANT)
- Lasciare che i topi si riprendano mettendoli nella camera calda di riscaldamento (37 gradi centigradi).
- Posizionare la gabbia del mouse sul pad di calore. Monitorare i topi nella camera di riscaldamento fino a quando non si sono ripresi dall'anestetico (sveglia e camminata) e poi rimettere i topi nella gabbia. Lasciare la gabbia sul pad di calore per altri 10 minuti, fino a quando i topi sono diventati più attivi.
- Dare ai topi cibo bagnato e morbido. Monitorare i topi 1 ora dopo l'intervento chirurgico per il recupero e assicurarsi che le clip rimangano in posizione. Assicurarsi che la gabbia sia a metà del blocco di calore per consentire agli animali di autoregolare la temperatura incustodita.
- Dose topi con 8,1 mg/kg di buprenorfina (100 -L sottocutaneamente nella mischia del collo), 6-8 ore dopo l'intervento chirurgico (alla fine della giornata). Monitorare i topi la mattina seguente e dosare di nuovo i topi con una buprenorfine di 0,1 mg/kg (100 litri nella mischia del collo). Dare più cibo bagnato come necessario.
- Monitorare i mouse ogni giorno per i prossimi sette giorni. Le clip possono essere rimosse dopo sette giorni utilizzando la rimozione clip.
- Trattamento adiuvante o neoadiuvante
- Trattare i topi peri-operatori con (neo)terapia adiuvante in un dato momento, a seconda del trattamento di interesse.
- Ad esempio, trattare i topi con una dose di 100 g di anti-CTLA-4 intraperitonealmente (i.p.) il giorno 15 dopo l'inoculazione, o con tre dosi di 200 g anti-PD-1 i.p. il giorno 15, 17 e 19 dopo l'inoculazione.
- Controlli sperimentali
- Quando si utilizza questo modello per valutare gli effetti della guarigione dell'infiammazione/ ferita, considerare l'utilizzo dei seguenti gruppi di controllo: 1) Controllo senza chirurgia (trattamenti possono ancora essere somministrati intratumoralmente); 2) Controllo della chirurgia finta: un'incisione chirurgica è fatta nella pelle; il tumore è manipolato ed esposto, ma nessun tessuto tumorale viene rimosso; la ferita è chiusa con clip.
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Representative Results
La crescita del tumore a una dimensione di 50 mm2 è una dimensione ideale per il debulk parziale. La resezione chirurgica incompleta di 50 mm2 tumori risulta in 100% (n.5) ricrescita riproducibile dei tumori in assenza di immunoterapia adiuvante (Figura 4A). Successivamente abbiamo usato il modello per testare le immunoterapie adiuvanti usando anticorpi contro molecole di checkpoint Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4) e Programmed Death Receptor 1 (PD-1). Il trattamento di topi con anti-CTLA-4 o anti-PD-1 ha portato a un tasso di cura dell'80% e del 25% (rispettivamente 4-5 per gruppo),(Figura 4B, 4C). La risposta con anti-PD-1 offre l'opportunità di testare nuove combinazioni per migliorare ulteriormente il tasso di risposta.
Figura 1: Schematica diagramma della resezione chirurgica parziale del tumore. (A) I topi BALB/c vengono inoculati con 5 x 105 cellule WEHI-164 sul fianco inferiore destro. (B) Quando il tumore raggiunge i 50 mm2, può iniziare un intervento chirurgico. (C) Il tumore è parzialmente resected (50 % indicato). (D) Il sito chirurgico è chiuso con clip. (E) La terapia adiuvante può essere somministrata, per via endovenosa, per via endovenosa (mostrata) o intratumoralmente nella zona della ferita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative dell'intervento. (A) Un'intera immagine dell'intervento chirurgico impostato che mostra gli strumenti chirurgici (elencati al punto 2.1) e la macchina anestetica. (B) Un'immagine istantanea della tabella chirurgica che mostra tutti i materiali a portata di mano. (C) Una camera di riscaldamento e una piastra di riscaldamento per il recupero del mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative della tecnica parziale del debulk tumorale. (A) Un topo completamente anetizzato con un tumore di 50 mm2 di dimensioni prima dell'intervento chirurgico. (B) Sito di incisione 3 mm di distanza dal tumore; 1 cm di incisione. (C-D) Apertura della ferita tenendo delicatamente la pelle sul lato del tumore che porta utilizzando una pinzetta, e "invertendo" il tumore in modo che sia visibile all'esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Ricrescita del tumore dopo la resezione tumorale incompleta e l'immunoterapia. (A) Le curve di ricrescita del tumore parzialmente resected WEHI-164 in assenza di immunoterapia adiuvante. (B-C) Ricrescita tumorale dopo l'intervento chirurgico e trattamento adiuvante con anti-CTLA-4 (B) o anti-PD1 (C). La linea tratteggiata indica il giorno dell'intervento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Forniamo un protocollo per un modello murino di resezione chirurgica incompleta del sarcoma dei tessuti molli per testare le terapie peri-operatorie. Abbiamo anche standardizzato l'incisione chirurgica per consentire la valutazione della guarigione della ferita tra topi dopo il trattamento.
Il posizionamento del tumore è una parte importante di questo protocollo. Abbiamo optato per un modello tumorale sottocutaneo per consentire un facile accesso chirurgico al sito del tumore e la somministrazione di terapie locali con un carico minimo sui topi. È anche importante garantire che i tumori crescano nello spazio sottocutaneo e non all'interno del peritoneo, che può provocare morbilità e mortalità inaspettate.
Quando si sceglie una linea cellulare tumorale per questo protocollo, si consiglia che le cellule quando coltivate in vivo formano una massa solida (ad esempio, il modello WEHI-164), piuttosto che una massa semi-solida (come il modello B16) in quanto è tecnicamente difficile da resiettare parzialmente. Inoltre, se il tumore inizia a crescere attraverso la pelle (di solito visto in tumori più grandi di 100 mm2), debulking non è raccomandato come la pelle può diventare necrotica e non guarire bene dopo l'intervento chirurgico. Abbiamo superato questo problema debulking tumori una volta che raggiungono 50 mm2 di dimensioni.
Poiché il nostro modello può essere utilizzato per valutare l'effetto della guarigione della ferita sulla terapia, proponiamo un gruppo di controllo/sham come confronto. Il controllo può essere un tumore inalterato, o chirurgia fittizia che avrebbe solo l'incisione della pelle, l'esposizione del tumore, e la chiusura della ferita senza debulk tumore parziale. Questo finto gruppo di controllo potrebbe essere usato per discernere l'effetto dell'infiammazione indotta dalla chirurgia e della guarigione delle ferite dal debulk parziale sull'esito del trattamento.
Per la chirurgia di debulking parziale di successo, è necessario considerare alcuni punti tecnici. Un aspetto importante è il corretto impianto e la crescita del tumore. I tumori devono essere impiantati sul fianco inferiore destro, lontano dalla gamba posteriore. I tumori che vengono impiantati troppo vicino alla gamba posteriore possono interferire con la loro capacità di camminare e possono provocare una forza in più sulle clip causandone l'allentamento. Inoltre, la coerenza nella dimensione del tumore è fondamentale per evitare la variabilità nella percentuale relativa di debulking. Abbiamo scelto di eseguire un intervento chirurgico con tumori che hanno una dimensione di 50 mm2, per rendere la chirurgia tecnicamente semplice, anche se si prevede che la resezione parziale sui tumori più piccoli è fattibile. Per prevenire l'incoerenza nella dimensione del tumore, la linea cellulare utilizzata deve essere passaggiata seguendo le tecniche di coltura cellulare standard appropriate e il ricercatore deve essere adeguatamente addestrato nella tecnica di inoculazione del tumore. Quando si estende questo protocollo ad altri modelli di tumore sottocutaneo, le caratteristiche fisiche del tumore sono importanti. Ad esempio, abbiamo scoperto che le linee cellulari che danno origine a tumori morbidi e gelatinosi (ad esempio, rhabdomyosarcoma M3-9-M e B16 melanoma15)sono tecnicamente difficili da debulk.
Ci sono anche punti tecnici che devono essere considerati durante l'intervento chirurgico. I topi devono essere adeguatamente anestesizzati per prevenire il movimento durante la procedura. A parte l'impost che i topi anestesisti inadeguatamente dureranno, qualsiasi movimento dei topi durante la procedura può rendere difficile la resezione chirurgica, con conseguente variabilità delle dimensioni del tumore rimosso tra i topi. Inoltre, la frequenza respiratoria del topo deve essere attentamente monitorata durante la chirurgia la concentrazione di isoflurane deve essere regolata per mantenere la profondità appropriata di anestesia. Pertanto, un assistente è sempre necessario durante la procedura chirurgica per monitorare la frequenza respiratoria durante l'intervento chirurgico e per garantire un adeguato livello di anestesia. La dimensione dell'incisione deve essere coerente per evitare la variabilità nella risposta di guarigione della ferita. Abbiamo scoperto che un'incisione di 1-1,5 cm è sufficiente per il debulking del tumore, con una minima probabilità di dehiscenza delle ferite.
Il nostro modello di resezione parziale imita la malattia residua rimanente dopo l'intervento chirurgico come si è visto nell'ambiente clinico di molti tumori solidi e offre vantaggi rispetto ai modelli di topo sintetici tradizionali tenendo conto dell'effetto della guarigione chirurgica della ferita. Inoltre, i modelli tradizionali esistenti di chirurgia hanno utilizzato la resezione completa del tumore, che non sempre si traducono in recidiva del tumore16. Altri ricercatori hanno utilizzato con successo modelli di resezione parziale utilizzando altre linee cellulari tumorali11,12,13, sottolineando la robustezza di questo metodo. Inoltre, è stato dimostrato che la resezione parziale, ma non la resezione completa, ha provocato la memoria immunitaria anti-tumorale protettiva quando la terapia adiuvante è data12 che è stata attribuita alla persistenza di antigeni dal tumore residuo.
Questo modello è progettato per studiare l'effetto dell'infiammazione e della guarigione delle ferite sulla terapia. Il nostro approccio di depilazione assomiglia clinicamente a situazioni cliniche in cui la malattia residua lorda viene lasciata dopo l'intervento chirurgico (resezione R2), piuttosto che la resezione macroscopica completa con malattia residua microscopica (resezione R1). Ad esempio, la resezione chirurgica nel sarcoma invasivo dei tessuti molli può comportare margini positivi quando il tumore si trova accanto a strutture critiche come nervi, arterie o organi adiacenti, precludendo una resezione completa con ampi margini17. Sono stati pubblicati13modelli chirurgici per la resezione con conseguente microscopico margine positivo ; il nostro protocollo può essere utilizzato per studiare l'effetto della risposta di guarigione della ferita sulla terapia quando è presente una malattia residua macroscopica.
Una limitazione del nostro modello è che non dà origine a ricadute lontane e micrometastasi, che è comune dopo l'intervento chirurgico in tumori solidi come il cancro al seno o al pancreas. Altri modelli di chirurgia, come il modello di cancro al seno murino 4T118,19,20 o modelli murini di cancro mammario de novometastasi21 sono più adatti per indagare recidiva sistemica dopo la resezione locale. Un'altra limitazione è che questo protocollo è per i modelli sottocutanei e quindi non consente la valutazione della patologia specifica dei tessuti. A questo scopo, i modelli di topo tumorale ortotopico sono appropriati7,22,23. Tuttavia, i modelli ortotopici sono più impegnativi e di solito coinvolgono un maggiore impost ai topi, e sono più laboriosi e costosi22. I modelli sottocutanei sono adatti a valutare gli effetti delle terapie (neo-)adiuvanti, sistematicamente o localmente, sulla ricaduta locale del cancro, in modo conveniente e relativamente ad alta produttività con impost minimo per gli animali.
La resezione parziale incompleta come delineata in questo protocollo è utile per testare le terapie adiuvanti incorporando al contempo la guarigione chirurgica delle ferite come fattore, una variabile che spesso viene trascurata.
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Disclosures
Nessuna divulgazione.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto dalle sovvenzioni dal Calzino a Sarcoma! dell'Associazione Sarcoma australiana e neozelandese, della Children's Leukemia & Cancer Research Foundation e della Perpetual Philanthropy. W.J.L è supportato da una Simon Lee Fellowship e da una borsa di ricerca del National Health and Medical Research Council e del Cancer Council WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
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