Summary

En musemodel af ufuldstændigt resected blødt væv sarkom til test (Neo) adjuverende behandlinger

Published: July 28, 2020
doi:

Summary

I denne protokol beskriver vi en musemodel af ufuldstændig kirurgisk resektion af bløddelssarkom til test (neo)adjuverende behandlinger.

Abstract

Kirurgi er ofte den første behandling for mange solide tumorer. Men, lokale tilbagefald ofte opstår efter primær tumor resektion, trods adjuverende eller neo-adjuverende behandlinger. Dette sker, når kirurgiske margener er utilstrækkeligt tumor-fri, resulterer i resterende kræftceller. Fra et biologisk og immunologisk perspektiv, kirurgi er ikke en null begivenhed; sårhelingsmiljøet er kendt for at fremkalde både pro- og anti-tumorigenic veje. Som følge heraf bør prækliniske modeller for lægemiddeludvikling, der har til formål at forebygge lokalt tilbagefald, omfatte kirurgisk resektion, når der testes nye (neo)adjuverende behandlinger, for at modellere de kliniske indstillinger hos patienter, der behandles med kirurgi.

Her beskriver vi en musemodel af ufuldstændig kirurgisk resektion af WEHI 164 bløddelssarkom, der gør det muligt at teste (neo)adjuverende behandlinger i forbindelse med et sårhelingsrespons. I denne model, 50% eller 75% af tumoren er fjernet, efterlader nogle kræft væv in situ til model brutto resterende sygdom efter operation i den kliniske indstilling. Denne model gør det muligt at teste behandlinger i forbindelse med kirurgi, samtidig med at man overvejer sårhelingsresponsen, hvilket kan påvirke effekten af (neo)adjuverende behandlinger. Den ufuldstændige kirurgiske resektion resulterer i reproducerbar genvækst af tumoren i alle mus i mangel af adjuverende behandling. Adjuverende behandling med checkpoint blokade resulterer i reduceret tumor genvækst. Denne model er således velegnet til test af behandlinger i forbindelse med debulking kirurgi og dens tilhørende sårheling svar og kan udvides til andre typer af fast kræft.

Introduction

Kirurgi er fortsat den vigtigste behandlingsmulighed for mange solidetumorer 1, herunder blødt væv sarkom2,3. På trods af forbedringer i kræft kirurgi teknikker, og kombinationer med (neo) adjuverende behandlinger, der er stadig en høj risiko for kræft tilbagefald og metastase efter primær tumor resektion4,5. I bløddelssarkom forekommer tilbagefald særligt locoregionalt på operationsstedet, hvilket resulterer i øget sygelighed og dødelighed. I den kliniske indstilling, Det kan være vanskeligt at opnå brede nok margener (f.eks på grund af anatomiske begrænsninger), resulterer i ufuldstændig resektion og efterfølgende tumor tilbagefald6. Kirurgisk stress og den efterfølgende proces med sårheling er kendt for at skabe en immunosuppressiv tumor mikromiljø gunstige for tumor tilbagefald7,8. Derfor bør opdagelsen og udviklingen af nye behandlingsformer for bløddelssarkom, især immunterapier, ideelt set tage den kirurgiske sårhelingsrespons i betragtning.

De fleste prækliniske undersøgelser for adjuverende behandlinger udføres i første omgang ved hjælp af subkutane syngeneic eller xenotransplant musemodeller, uden at indarbejde den kirurgiske stress og sårhelingrespons 9,10. Derfor har vi udviklet en syngeneic subkutane mus blødt væv sarkom model indarbejde ufuldstændig kirurgisk resektion. WEHI 164 fibrosarkom celler er podet subkutane, og når tumorer er etableret, vi fjerner 50-75% af tumor bulk(Figur 1A-E). Tumorer konsekvent igen vokse fra de resterende tumor. Denne model giver mulighed for at teste adjuverende behandlinger, mens man overvejer effekten af kirurgisk stress og sårheling. Lignende kirurgiske modeller af ufuldstændig resektion er blevet anvendt i en række undersøgelser af flere grupper og fundet at være reproducerbare og effektive11,,12,13. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af denne protokol.

Protocol

Dyr, der anvendes i disse forsøg blev fremstillet fra Animal Resource Centre (Perth, Western Australia). Dyr blev opretholdt under standard patogen-fri betingelser på Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia). Alle forsøg blev udført i henhold til protokollen som godkendt af Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c mus på 8-12 uger blev anvendt til disse forsøg. DEN WEHI 164 fibrosarcoma celle linje blev opnået fra CellBank…

Representative Results

Tumorvækst til en størrelse på 50 mm2 er en ideel størrelse til delvis debulk. Den ufuldstændige kirurgiske resektion af 50 mm2 tumorer resulterer i 100% (n = 5) reproducerbar genvækst af tumorer i mangel af adjuverende immunterapi (Figur 4A). Vi brugte derefter modellen til at teste adjuverende immunterapier ved hjælp af antistoffer mod checkpoint molekyler Cytotoksisk T Lymphocyt Associated Protein 4 (CTLA-4) og…

Discussion

Vi leverer en protokol til en musemodel af ufuldstændig kirurgisk resektion af bløddelssarkom til at teste perioperative behandlinger. Vi har også standardiseret det kirurgiske snit for at muliggøre vurdering af sårheling mellem mus efter behandling.

Tumor placering er en vigtig del af denne protokol. Vi har valgt en subkutan tumor model for at give nem kirurgisk adgang til tumorstedet og administration af lokale behandlinger med minimal byrde på musene. Det er også vigtigt at sikre, at…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af tilskud fra Sock det til Sarcoma! Foundation, den australske og New Zealand Sarcoma Association, Children’s Leukæmi & Cancer Research Foundation og Perpetual Philanthropy. W.J.L støttes af et Simon Lee Fellowship og et forskningsstipendium fra National Health and Medical Research Council og Cancer Council WA.

Materials

26 gauge 0.5 mL insulin syringe Becton Dickinson, Australia 326769 None
2-Mercaptoethanol Life Technologies Australia Pty Ltd 21985023 None
Anaestetic gas machine Darvall Vet, Australia SKU: 2848 None
Anti-CTLA-4 BioXcell, USA BE0164 None
Anti-PD-1 BioXcell, USA BP0273 None
Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL RB healthcare UK Limited, UK 55175 Prescription order
Chlorhexidine Surgical Scrub 4% Perigo Australia, Australia CHL01449F(scrub None
Fetal Bovine serum CellSera, Australia AU-FBS-PG None
Forceps Fine 10.5 cm Surgical house, Western Australia CC74110 None
Forceps Fine 12 cm Serrated Surgical house, Western Australia CC74212 None
Forceps Halsted 14 cm Surgical house, Western Australia CD01114 None
Heating chamber Datesand Ltd, UK Mini-Thermacage None
HEPES (1M) Life Technologies Australia Pty Ltd 15630080 None
Isoflurane Henry Schein Animal Health, Australia SKU: 29405 Prescription order
Lubricating Eye Ointment Alcon n/a None
Penicillin/streptomycin 1000X Life Technologies Australia Pty Ltd 15140122 None
Phosphate Buffered Solution 10x Life Technologies Australia Pty Ltd 70013-032 None
Reflex 7mm Clips Able scientific, Australia AS59038 None
Reflex 7mm Wound Clip Applicator Able scientific, Australia AS59036 None
Reflex Wound Clip Remover Able scientific, Australia AS59037 None
Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit Darvall Vet, Australia #7885 None
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine Life Technologies Australia Pty Ltd 21870092 None
Scissors Iris STR 11 cm Surgical house, Western Australia KF3211 None
Scissors Iris STR 9 cm Surgical house, Western Australia JH4209 None
Small Induction Chamber Darvall Vet, Australia SKU: 9630 None
TrypLE express 1x Life Technologies Australia Pty Ltd 12604-021 None

References

  1. Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
  2. Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
  3. Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
  4. Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
  5. Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
  6. Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
  7. Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
  8. Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
  9. Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
  10. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
  11. Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
  12. Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
  13. Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
  14. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  15. Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  16. Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
  17. Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
  18. Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
  19. Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
  20. Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
  21. Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  22. Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
  23. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).

Play Video

Cite This Article
Rwandamuriye, F. X., Weston, B. J., Johns, T. G., Lesterhuis, W. J., Zemek, R. M. A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies. J. Vis. Exp. (161), e60882, doi:10.3791/60882 (2020).

View Video